Name: 리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 학습하세요 리파제 및 포스포리파제의 기질 특이성을 정의하는 생화학적 방법을 통해 효소 활성을 최적화하고 생리적 기질을 신속하게 탐지하는 기술을 익히세요. 이 방법은 지질 대사 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 (Investigación 엉 Fronteras 드 라 Ciencia에서 Investigación Científica BASICA에서 82614, 153998, 253549 및 178359뿐만 아니라 118) 및 Dirección 일반 드에서 Consejo 나시 오날 드를 CIENCIAS Y TECNOLOGIA - 멕시코 (CONACYT 멕시코)에서 보조금에 의해 지원되었다 (DGAPA - UNAM, PAPIIT IN202616, IN203612) Asuntos 드 개인 Académico-대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코.

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저자는 공개 아무것도 없어.

지난 20 년 동안, 많은 생물의 게놈은 서열화되었다 및 게놈 시퀀스 데이터의 재산이 생성되었지만, 기능 해석은 뒤쳐 따라서 게놈 기능에 대한 우리의 이해를 방해한다. 게놈에서 유전자의 기능은 종종 알려진 기능 또는 보존 모티브의 발생 유전자의 유사성을 기준으로 할당됩니다. 그러나, 특정 유전자의 정확한 기능은 대개 알려져 있지 않다. 특히, 효소 구조 유전자를 쉽게 인해 대부분의 효소 및 기질이 두 제품을 포함하는 복잡한 반응을 촉진한다는 사실 오믹 기술에 의해 탐색 할 수없는 예측. 현재, 적어도 하나의 기판이 고정되고, 다른 어디에 변화시킬 수있는 효소의 그룹에 대한 기질 특이성을 탐구 더 실현 가능한 것으로 보인다. 예를 들어, 진핵 생물의 단백질에있는 대부분의 인산화 모티브는 알려진 키나제에 대한 합의 펩타이드는 펩타이드 AR을 생성하기 위해 고체 지지체에 발견되어있다광선입니다. kinome 프로파일의 확립을 가능하게 결정될 수있다 이러한 배열 및 방사성 표지 된 ATP 기질 특이성 및 유기체의 서로 키나제의 활성 수...

이러한 트리 아실 글리세롤과 (글리세) 인지질 등의 글리세롤 기반의 지질이 중요한 구성하고 아마 가장 잘 알려진 지질 클래스 1. 트리 아실 글리세롤 (태그) 지방 또는 일반적으로 저장 지질의 기능 오일, 따라서 에너지 및 탄소 소스로합니다. 태그는 자주 외부 태그를 소화하고 탄소 소스로이를 사용할 수 있도록 생산 미생물에 의해 분비되는 리파제에 의해 저하 될 수 있습니다. 또한, 리파제 널리 그들의 중요한 생명 공학 응용 프로그램을 2 년 동안 연구되어왔다. 때문에 자신의 양친 매성 자연과 가까운 원통 모양, (글리세) 인지질 전시 막 형성 특성과 일반적으로 이중 층 막 3의 주요 지질 구성 요소를 구성합니다. 이러한 박테리아, 대장균, 세 개의 주요 그룹 헤드 변형, 포스파티딜 글리세롤 (PG), 카디오 리핀 (CL) 및 phosphatid 간단한 미생물에서하나는 그들 각자가 서로 다른 분자 종 (4)를 다수로 상기 SN의 다른 지방산 아실 사슬의 상당수 -1 SN -2 위치주는 증가로 치환 될 수 있음을 알아야하지만 ylethanolamine (PE)가 발생하는 . 다른 박테리아는 다른 인지질 외에 또는 대신이있을 수 있습니다. 예를 들어, Sinorhizobium의 meliloti은, 콩과 식물 알팔파 (Medicago 사티)와 질소 고정 뿌리혹 공생 관계를 형성 할 수있는 토양 박테리아, 제 양쪽이 온성 인지질, 포스파티딜콜린 (PC)를 PE 이외에 포함 오. 또한, 지질이 포함되지 인 또는 글리세롤은 세포막의 양친과 형태의 일부가 될 수 있습니다. 예를 들어, 인 - 제한 성장 조건에 따라, S.의 meliloti, (글리세) 인지질은 크게, 즉, sulfolipids, 오르니 틴 지질 및 diacylglyceryl의 trimethylho 인을 포함하지 않는 막 지질로 대체moserine (DGTS) 6. 박테리아, DGTS은 두 단계 경로 7에서 디아 실 글리세롤 (DAG)로 형성되지만 DAG 생성하기위한 소스는 명확하지 않았다된다. 펄스 - 체이스 실험은 PC가 인 제한 조건에서 형성된다 및 DAG 및 포스 포 콜린에 PC를 변환 할 수있는 DGTS 8 전구체하고 우리는 포스 포 리파제 C (PLCP, SMc00171)을 식별 할 수있는이 원고에 기술 된 방법을 사용하여 수 있다는 제안 8. 별도의 연구에서 우리는 발견이 아 닐 -CoA 합성 효소 (FADD) S.의 결핍 돌연변이 성장 9 정지상 들어갈 때 meliloti 또는 대장균 유리 지방산 축적. 이들 지방산은 세포막의 지질로부터 유도 될 듯하지만, 유리 지방산 또는이를 유리화하는 효소 (들)에 대한 정확한 소스는 공지되지 않았다. 다시 말하지만, 전략을 사용하는 것은이 원고에 설명 된 두 파타 틴과 같은 10 (포스) 리파제 (S.에서 유리 지방산의 형성에 기여하고 SMc00930 SMc01003) meliloti (11)는 예측했다. 놀랍게도 SMc01003는 글리세롤 및 유리 지방산 및 모노 아실 글리세롤 마지막 11로 변환 기판으로서 DAG를 이용했다. 따라서, SMc01003는 DAG 리파제 (DGLA)입니다. 알고리즘의 숫자가 전위 (포스)를 예측하는 존재하지만 12, 13는, 리파제 자신의 정확한 기능과 생리 학적 역할은 일반적으로 알려져 있지 않다. 여기에서 우리는 복제, 프로토콜 개요 및 예측 또는 전위 (포스) 리파제를 과발현. 이 원고 효소 분석법 개발 인공 발색 기질을 사용하여 과발현 (포스) 리파제에 최적화 할 수있는 방법을 설명한다. 우리는이 연구 결과는 미생물 생리학에 대한 우리의 이해를 풍부하게하는 방법을 최적화 효소 분석과 실제 (포스) 리파제 기판이 발생할 수있는 방법과 예제를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>클로로포름</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>TLC 분석 및 지질 추출</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>TLC 분석 및 지질 추출</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>TLC 분석 및 지질 추출</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>TLC 분석 및 지질 추출</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>이중 증류수</td><td>&nbsp; 아니</td><td>&nbsp; NA</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>LB 국물</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>박테리아 성장, 10g 트립톤 + 효모 추출물 5g + NaCl 10g 당 이중 증류수</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td><td>박테리아 성장</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>박테리아 성장</td></tr><tr><td>TY 국물</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>박테리아 성장, 트립톤 8g + 효모 추출물 3g + CaCl 66mg2&#183; 2H2O 중증류수 CaCl</td></tr><tr><td>2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-티오갈락토시드(IPTG)</td><td>인비트로젠</td><td>15529-019</td><td>박테리아 성장</td></tr><tr><td>디에탄올아민</td><td>시그마</td><td>D-8885</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>포스포리파제 A2 뱀 venom</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>Phospholipase C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrophenyl phosphate</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-nitrophenyl stearate</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 도데카노에이</td>트 <td>Sigma</td><td>61716</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 데카노에이</td>트 <td>Sigma</td><td>N0252</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 팔미테이</td>트 <td>Sigma</td><td>N2752</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 부티레이트</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 옥타노에이</td>트 <td>Sigma</td><td>21742</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>아세트산, 나트륨 염 [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>박테리아 성장</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>효소 분석</td></tr><tr><td>알루미늄 HPTLC 실리카겔 60 플레이트. 실리카겔 HPTLC 플레이트 크기 20 x 20cm, 25 매.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC 분석 및 지질 추출</td></tr><tr><td>분광계 UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Enzymatic assays</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Photostimulable Luminescence scanner&nbsp;</td></tr><tr><td>다목적 섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>방사능 정량화</td></tr><tr><td>프랑스어 압력 셀</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>세포의 파손</td></tr><tr><td>크로마토그래피 논문 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC 분석</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021우리의</td><td>참고 문헌 11</td><td></td>은 <td>균주</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS 유능 세포</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>단백질 발현 균주</td></tr><tr><td>pET9a 벡터</td><td>, Novagen</td><td>69431</td><td>단백질 발현 벡터</td></tr><tr><td>pET17b 벡터</td><td>, Novagen</td><td>69663</td><td>단백질 발현 벡터</td></tr>, <tr><td>멸균 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브(14ml), Falcon</td><td>Becton, Dickinson</td>, <td></td><td>352057 세균 배양의 방사선 라벨링,</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브(1.5ml),</td> <td>Eppendorf</td><td>30125.15</td>, 효소 <td>분석</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol</td>, <td>Sigma</td><td>D9135</td><td>지질 표준물</td></tr><tr><td>L-&알파;-포스파티딜콜린, 디팔미토일</td><td>시그마</td><td>P6267</td><td>지질 표준물</td></tr><tr><td>DL-&알파;-모노팔미틴</td><td>시그마</td><td>M1640</td><td>지질 표준</td></tr>물 <tr><td>팔미트산</td><td>시그마</td><td>P0500</td><td>지질 표준물</td></tr></tbody></table>

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

미생물 유기체의 외부 기판을 사용할 수 있도록하기 위해 분비된다 (포스) 리파제의 넓은 스펙트럼을 생산하고 있습니다. 또한, 다른 (포스) 리파제는 물리적으로 생산 유기체가 고유 지질의 매출을 일으키는 원인이 자주 세포막의 리모델링에 상승을 제공과 연관 될 수있다. 전위 (포스)은 리파제 유전자 / 단백질 서열 사용할 알고리즘의 번호와 예측 될 수 있지만, 효소 활성, 기질 특이성, 잠재적 생리 기능의 실험적 증거는 종종 수득되지 않았다. 이 원고는 알 수없는 기질 특이성하는 방법과 각각의 (포스) 리파제의 자연 기판에 대한 검색이 최적의 조건을 사용하는 방법과 미래 (포스) 리파제에 대한 분석 조건의 최적화에 대해 설명합니다. 미성년자를 감지하는 데 도움이, 같은 페이지의 -nitrophenyl 유도체 인공 발색 기판을, 수 사용표준 조건에서 예측 (포스) 리파제에 대한 효소 활성. 이러한 보조 효소 활성을 발생하는 데, 효소 분석의 고유 파라미터는 인공 기판의보다 효율적인 가수 분해를 얻기 위해 변화 될 수있다. 효소가 잘 작동되는 조건을 판정 한 후, 자연 전위 다양한 기판은 그들의 열화 구별 크로마토 그래피 방법을 이용 하였다 될 수있는 프로세스를 분석한다. 새로운 효소 기질 특이성의 정의는 종종 후 실험적으로 테스트 될 수있는 이러한 효소의 전위 생리적 역할에 대한 가설을 제공한다. 이 가이드 라인에 따라, 우리는 성장의 인 제한 조건에 따라 세균 Sinorhizobium의 meliloti에서 세포막의 리모델링을위한 중요한 단계에서, 포스 포 콜린과 디아 실 글리세롤하는 포스파티딜콜린을 저하 포스 포 리파제 C (SMc00171)을 식별 할 수 있었다. 두 patatin- 예측을 위해같은 유기체의 포스 포 (SMc00930 및 SMc01003)처럼, 우리는 그들의 기질 특이성을 재정의하고 SMc01003은 디아 실 글리세롤 리파제 있음을 명확히 할 수있다.

비스 P는 -nitrophenyl 인산와 PC 고유의 포스 C SMc00171의 활동 E. 얻은 무 세포 추출물 대장균 BL21 (DE3)는 smc00171가 형성된 P는 -NP을 측정하는 분광 효소 분석을 이용하여, 비스 페이지 -nitrophenyl 인산 에스테르를 가수 분해하는 능력에 대해 연구 하였다 표현했다 pLysS 균주를, X. 어떤 가수 활동은 E.에서 얻은 무 세포 추출물에 존재하지 않는 P의 -nitrophenyl 인산 기판으로서 사용 하였다 비스 -시 (데이터는 도...

많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

본 절차의 전반적인 목표는 잠재적 리파아제(lipase) 및 포스포리파아제(phospholipase)에 대한 생리적 기질의 검출을 가속화하는 것입니다. 이 방법은 포스포리파아제가 생체막의 지질 재구성(lipid remodeling)에 어떻게 기여하는지와 같이 곤충학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효소 활성의 최적화와 효소의 천연 기질 탐색을 독립적으로 수행할 수 있다는 점입니다.이 방법은 박테리아 리파아제(lipase) 및 포스포리파아제(phospholipase)의 기질 특이성에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 다른 모델 생물체의 하이드롤라아제(hydrolase) 연구를 위해 수정하여 사용할 수도 있습니다. 저희는 처음에 rhizobium meliloti의 내인성 막 지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 분해할 수 있는 효소 활성을 탐색하던 중 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 세포 없는 단백질 추출물을 준비하려면, 박테리아 세포 현탁액을 해동한 후 얼음 위에 보관하십시오.그 다음, 세포 현탁액을 20,000 pounds per square inch의 냉장 가압 세포 파쇄기를 통해 3회 통과시킵니다. 4 °C에서 5,000 ×g로 30분 동안 원심분리하여 온전한 세포와 세포 파편을 제거합니다. 원심분리 후, 상층액에서 후속 분석을 위해 100 µL 및 500 µL의 분주액을 준비합니다.텍스트 프로토콜에 표로 정리된 피펫팅 스킴을 사용하여 이전에 최적화된 효소 분석법을 설정하십시오. 다양한 효소 활성을 초기에 포괄적으로 확인하기 위해, 가수분해 시 유색 생성물을 생성하는 para-nitrophenol 또는 PNP 유도체와 같은 인공 기질을 사용하십시오. 30 °C의 분광광도계에서 5분 동안 PNP 형성으로 인해 발생하는 405 nm에서의 흡광도 증가 시간 경과를 추적하십시오.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계산을 수행합니다. 지질의 방사성 표지를 위해, 원하는 배지 5 mL에 대상 생물체의 하룻밤 전배양액을 준비하고 30 °C에서 배양합니다. 전배양액으로부터 100 mm 배양 플라스크의 신선한 배지 20 mL에 접종하여, 배양액의 620 nm에서의 초기 광학 밀도가 0.3이 되도록 합니다.다음으로, 멸균 조건 하에서 배양액 1 mL 분취량을 14 mL 멸균 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다. 1 mL 배양액에 1 µCi의

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

OCTOPUS라는 별명을 가진 다중 하위 단계 교환으로 구현된 펜던트 드롭 표면 필름 균형은 원래 벌크 용액과 시뮬레이션된 위장관액의 순차적 하위 단계 교환을 통해 소화 상태를 모방할 수 있습니다. 시뮬레이션된 체외 소화는 소화된 계면층의 계면 장력을 현장에서 기록하여 모니터링됩니다.

시험관 내 시뮬레이션된 위장관액의 다중 하위 단계 교환 을 통한 단일 액적의 에멀젼 소화

이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

학습하세요 리파제 및 포스포리파제의 기질 특이성을 정의하는 생화학적 방법을 통해 효소 활성을 최적화하고 생리적 기질을 신속하게 탐지하는 기술을 익히세요. 이 방법은 지질 대사 연구에 활용됩니다.

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

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