리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

많은 예측된 (포스포) 리파제는 기질 특이성 및 생리학적 기능과 관련하여 제대로 특성화되지 않았습니다. 여기에서 우리는 효소 활성을 최적화하고, 천연 기질을 검색하고, 이러한 효소에 대한 생리학적 기능을 제안하는 프로토콜을 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 잠재적인 리파아제 및 인소포리파아제에 대한 생리학적 기질의 검출을 가속화하는 것입니다. 이 방법은 포스포리파아제가 생물학적 막의 지질 리모델링에 어떻게 기여하는지와 같은 곤충학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 효소 활성의 최적화와 효소의 천연 기질 검색을 독립적으로 수행할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 박테리아 리파제 및 포스포리파제의 기질 특이성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 모델 유기체의 가수분해효소를 연구하기 위해 수정할 수도 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 내인성 지질인 포스파티딜콜린 이노리조븀 멜리로티를 분해할 수 있는 효소 활성을 검색했을 때 처음 떠올랐습니다. cell-free 단백질 추출물을 준비하려면 박테리아 세포 현탁액을 해동하여 얼음에 보관하십시오.

그런 다음, 20, 평방 인치당 000파운드의 차가운 압력 셀을 통해 셀 현탁액을 세 번 통과시킵니다. in-tact 세포와 세포 파편을 섭씨 4도에서 5, 000 회 g에서 30 분 동안 원심 분리하여 제거합니다. 원심분리 후 후속 분석을 위해 상층액에서 100 및 500 마이크로리터의 분취액을 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 표로 정리된 피펫팅 계획을 사용하여 이전에 최적화된 효소 분석을 설정합니다. 뚜렷한 효소 활성의 초기 적용 범위를 위해, 파라-니트로페놀 또는 PNP 유도체와 같은 가수분해 시 착색된 생성물을 생성하는 인공 기질을 사용하십시오. 5분 동안 섭씨 30도의 분광 광도계에서 PNP가 형성되기 때문에 405나노미터에서 흡광도가 증가하는 시간 경과를 따르십시오.

마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계산을 수행합니다. 지질의 무선 라벨링을 위해 원하는 배양 배지 5ml에서 관심 유기체의 하룻밤 사전 배양을 준비하고 섭씨 30도에서 성장합니다. 사전 배양에서 100mm 배양 플라스크에 20mm의 신선한 배지를 접종하여 배양을 위해 620 나노 미터에서 0.3의 초기 광학 밀도를 얻습니다.

다음으로, 배양액의 1ml 분취액을 멸균 조건에서 14ml 멸균 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 114c 아세테이트 마이크로퀴리 1개를 1밀리리터 배양액에 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 24시간 동안 교반하에서 액체 배양액을 배양합니다.

배양 기간이 끝나면 배양액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 12, 000 회 g으로 원심 분리합니다. 펠릿을 100마이크로리터의 물에 재현탁합니다. 이 시점에서 세포 현탁액을 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 극성 지질 추출을 계속하십시오.

극성 지질 추출을 수행하려면 375마이크로리터의 2:1 메탄올을 클로로포름 용액에 100마이크로리터의 수성 세포 현탁액에 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하기 전에 샘플을 30초 동안 볼텍스합니다. 배양 후, 12, 실온에서 000 회 g에서 5 분 동안 원심 분리기.

그런 다음 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 125마이크로리터의 클로로포름과 125마이크로리터의 물을 상층액에 첨가합니다. 30 초 동안 와류 후에, 12에 1 분 동안 표본을 원심분리, 실내 온도에 000 시간 g.

하부 클로로포름 상을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 질소 가스 흐름으로 용액을 건조시킵니다. 건조 된 지질을 100 마이크로 리터의 클로로포름에서 메탄올 용액에 용해시킵니다.

박층 크로마토그래피에 의한 중성 극성 지질의 분리를 위해 플레이트 가장자리에서 2cm부터 시작하는 고성능 박층 크로마토그래피 실리카겔 알루미늄 시트에 지질 샘플의 3마이크로리터 분취량을 적용합니다. 여러 시료를 1차원 크로마토그래피로 분석하는 경우, 서로 다른 시료 적용 지점 사이에 최소 1.5cm의 거리를 유지하십시오. 이동상을 내부에 크로마토그래피 종이로 코팅된 TLC 현상 챔버로 옮깁니다.

챔버가 30분 동안 포화되도록 유리판으로 덮습니다. HPTLC 실리카겔 알루미늄 시트를 건조된 지질 샘플과 함께 챔버로 옮깁니다. 플레이트를 제거하기 전에 밀폐된 챔버에서 플레이트가 30분 동안 현상되도록 합니다.

그런 다음 용제를 플로우 후드에서 2시간 동안 건조시킵니다. 현상된 TLC 시트가 건조되면 밀폐된 카세트에 광자극 발광 스크린으로 3일 동안 배양합니다. 그런 다음 인큐베이션된 스크린을 PSL 스캐너에 노출시키고 분리된 방사성 표지 지질의 가상 이미지를 획득합니다.

디아실글리세롤 또는 DAG, 리파아제 활성을 측정하려면 먼저 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 5, 000CPM의 14 C 표지 DAG를 추가합니다. 또한 튜브에 Triton X-100 용액을 넣고 소용돌이로 혼합합니다. 질소 흐름에서 용액을 건조시킵니다.

최종 100 마이크로 리터 분석을 위해 Tris-HCl 완충액, 염화나트륨 용액 및 이중 증류수를 추가합니다. 5초 동안 소용돌이가 발생합니다. 용액에 5마이크로리터의 효소를 첨가하여 반응을 시작합니다.

용액을 섭씨 30도에서 4시간 동안 배양합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 지질을 추출하기 전에 250마이크로리터의 메탄올과 125마이크로리터의 클로로포름을 첨가하여 반응을 중지합니다. 이전과 같이 1DTLC 및 후속 PSL 이미징으로 중성 극성 지질 분석을 진행합니다.

예측된 phosopholipase SMc01003은 인공 파라-니트로페놀 아실 에스테르와의 활성을 보여주지만, 활성은 외래 유전자가 발현되지 않은 Escherichia coli의 cell-free 추출물에 존재하는 백그라운드 활성의 두 배 또는 세 배에 불과합니다. 이는 파라-니트로페닐 아실 에스테르가 SMc01003에 대한 좋은 기질이 아닌 것으로 보인다는 것을 나타냅니다. E.Coli의 cell-free 추출물은 디아실글리세롤을 분해할 수 없는 반면, 예측된 포스포리파아제 SMc01003이 발현된 균주 추출물은 디아실글리세롤의 분해를 일으켰습니다.

SMc01003은 포스포리파아제로 예측되었지만, 실제로는 디아실글리세롤을 모노아실글리세롤과 하나의 지방산으로 분해하는 디아실글리세롤 리파아제입니다. 그런 다음 모노아실글리세롤을 글리세롤 및 다른 지방산으로 더 분해합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 몇 주 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 리파아제와 포스포리파제의 효소 활성을 최적화하는 방법과 이들의 생리학적 기질을 계속 찾는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차의 결정적인 이점은 효소 활성의 최적화가 천연 효소 기질에 대한 검색과 분리될 수 있다는 것입니다. 유기 용제 또는 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 필요한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.