멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

이 실험의 전반적인 목표는 단일 세포에서 여러 유전자 발현을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 세포 집단 내 분자 서명의 이질성 또는 희귀한 분자 서명과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소 48개의 서로 다른 유전자를 가진 특정 분자 서명을 동시에 많은 세포에서 평가할 수 있다는 것입니다.

1.5ml 튜브에서 48회 반응을 위한 사전 증폭 혼합물을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 튜브에 240마이크로리터의 특이적 역전사 완충액, 62.4마이크로리터의 낮은 EDTA TE 완충액 및 9.6마이크로리터의 Taq DNA 중합효소를 추가합니다. 전자 피펫을 사용하여 6.5마이크로리터의 사전 증폭 혼합물을 96웰 단일 셀 플레이트의 48개 웰 각각에 분배합니다.

다음으로, 1.5ml 튜브에서 0.2x 분석 혼합물을 준비합니다. 튜브에 각 프라이머 1.4마이크로리터를 추가합니다. 최종 부피를 낮은 EDTA TE 버퍼로 140마이크로리터로 조정합니다.

전자 피펫을 사용하여 0.2x 분석 혼합물 2.5마이크로리터를 사전 증폭 혼합물이 포함된 96웰 단일 세포 분류 플레이트의 48웰에 분배합니다. 커버 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 접시를 소용돌이치고 1분 동안 280회 g으로 돌립니다.

단일 간 선천성 림프구 세포(ILC)는 형광 활성화 세포 분류에 의해 분류됩니다. 빈 96웰 플레이트를 테스트로 사용하여 이 절차를 시작합니다. 테스트 플레이트를 플레이트 홀더에 놓고 1 웰이 왼쪽과 실험자를 향하도록 놓습니다.

플레이트 홀더를 조정하여 검증 비드가 있는 원 웰 중앙에 한 방울을 떨어뜨립니다. 적절하게 조정되면 분석 혼합물과 사전 증폭이 포함된 96웰 단일 세포 선별 플레이트를 플레이트 홀더에 놓습니다. 플레이트 레이아웃을 그리고 게이트 모집단의 웰당 하나의 셀을 정렬합니다.

96웰 단일 셀 분류 플레이트에서 각 셀의 적절한 위치는 필수적이며, 플레이트 레이아웃은 스프레드시트 소프트웨어에 보관해야 합니다. 0.2x 분석 혼합물과 사전 증폭 혼합물을 포함하는 하나의 웰은 세포 없이 비입력 대조군으로 남겨 둡니다. 선택적으로, 프라이머 효율을 위한 대조군으로 cDNA 희석을 위해 6개의 웰로 구성된 2열을 남겨 둡니다.

단일 세포 분류 직후 96웰의 단일 세포 분류 플레이트를 소용돌이치고 스핀 다운합니다. 플레이트를 thermocycler에 놓습니다. 표시된 대로 역전사 및 사전 증폭을 수행합니다.

충분한 물질을 갖기 위해서는 분류된 단일 세포에서 특정 표적 유전자의 사전 증폭이 필요합니다. 각 웰에 36마이크로리터의 낮은 EDTA TE 완충액을 추가하여 사전 증폭된 샘플을 희석합니다. 이 절차를 시작하려면 175마이크로리터의 qPCR 마스터 믹스와 17.5마이크로리터의 샘플 로딩 시약을 1.5ml 튜브에 피펫팅하여 191마이크로리터의 마스터 믹스를 준비합니다.

새로운 96웰 플레이트에서 3.6마이크로리터의 마스터 믹스를 48개의 웰 각각에 분배합니다. 이것은 96웰 샘플 플레이트입니다. 2.9 μl의 사전 증폭된 cDNA를 96-well, 단일 세포 분류 플레이트에서 새로운 96-well 샘플 플레이트로 이동시키고, 두 플레이트 사이의 각 샘플에 대해 동일한 위치를 유지합니다.

새로운 96웰 플레이트의 48개 웰 각각에 3마이크로리터의 분석 로딩 시약을 분배하여 96웰 분석 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 3마이크로리터의 프라이머를 추가합니다. 96웰 분석 플레이트에서 각 프라이머의 적절한 위치는 필수적입니다.

스프레드시트 소프트웨어에서 플레이트 레이아웃을 유지합니다. 이 절차를 시작하려면 통합 미세유체 회로(IFC)를 벤치에 놓고 주사기를 사용하여 밸브를 점검합니다. 주사기의 캡을 제거하고 한쪽 밸브에 수직으로 놓고 단단히 누릅니다.

O-링이 움직여야 합니다. 칩에 제어 라인 유체를 채웁니다. 두 번째 밸브로 이전 단계를 반복한 후 칩 바닥에서 검은색 필름을 제거합니다.

칩을 IFC 컨트롤러에 로드합니다. IFC 컨트롤러 화면에서 prime을 선택한 다음 실행합니다. 그런 다음 칩을 꺼내고 칩 바닥에 검은색 필름을 다시 밀봉합니다.

8채널 피펫을 사용하여 96웰 분석 플레이트에서 칩의 1 또는 왼쪽으로 5마이크로리터를 옮깁니다. 칩의 각 웰에 대한 팁을 변경합니다. 거품을 만들지 말고 거품이 나타나면 10마이크로리터 팁을 사용하여 거품을 제거하십시오.

표시된 대로 칩의 왼쪽을 채웁니다. 같은 방식으로 96웰 샘플 플레이트에서 5마이크로리터를 사용하여 칩의 오른쪽을 채웁니다. 이 실험의 성공을 위해서는 IFC 컨트롤러에 적절하게 로드될 수 있도록 IFC 칩이 적절하게 채워지는 것이 중요합니다.

칩 바닥에서 파란색 필름을 제거하고 칩을 IFC 컨트롤러에 로드합니다. IFC 컨트롤러 화면에서 Load mix를 선택한 다음 실행합니다. 완료되면 칩을 꺼내고 칩 바닥에 파란색 필름을 다시 밀봉합니다.

칩을 실행하려면 먼저 미세유체 qPCR 컴퓨터에서 데이터 수집 소프트웨어를 선택하십시오. 시작되면 새 실행을 선택합니다. 꺼내기를 선택하고 칩을 로드합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 소프트웨어를 설정한 후 실행 시작을 선택합니다. 반응에는 약 90분이 소요됩니다. 데이터 분석을 시작하려면 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 열고 파일을 선택한 다음 실험 폴더를 열고 칩 실행 dot b m one 파일을 선택합니다.

해석 보기, 결과 테이블 및 히트 맵 보기를 클릭합니다. x로 표시된 상자는 임계값 감지 수준보다 낮거나 증폭 곡선이 잘못되었습니다. 샘플의 이름을 지정합니다.

샘플 설정으로 이동하여 새 SBS 96을 선택합니다. 매핑을 클릭하고 96웰 샘플 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 레이아웃을 선택합니다. 스프레드시트 소프트웨어에서 샘플 레이아웃 디자인을 복사하여 붙여넣습니다.

붙여넣은 레이아웃을 샘플 이름으로 정의합니다. 동일한 절차를 사용하여 어세이의 이름을 지정합니다. detector setup에 primer 이름을 입력하고 붙여넣은 레이아웃을 detector name으로 정의합니다.

분석 보기를 클릭하고 분석합니다. 파일을 선택하고 내보내고 히트 맵 결과로 저장합니다. 유세포 분석을 사용하여 널리 발현된 ILC 마커를 기반으로 간 ILC 집단을 분류하고 3개의 고유한 집단을 정의했습니다.

적절하게 로드된 단일 세포, 다중 유전자 발현 칩은 각 반응 챔버가 채워지고 동일한 치수에 직선과 행으로 나타나야 합니다. 부적절하게 로드된 칩에는 빈 라인과 반응 챔버 행, 굽힘 라인이 있습니다. 적절하게 로드된 칩의 이 플루오레세인 아미드 그림은 몇 사이클 후에 나타나는 반응 챔버 밝기의 차이를 보여줍니다.

증폭 신호가 있는 반응 챔버는 증폭 신호가 없거나 낮은 반응 챔버보다 밝게 나타납니다. 적절한 세포 분류, 사전 증폭 및 로딩 후, ILC 집단은 성체, 야생형 마우스의 간에서 유전자 발현에 대해 이질적인 것으로 나타났습니다. 왼쪽에는 수정 사항이 없는 히트 맵이 있습니다.

오른쪽에는 시료 및 분석 이름 정의 후에 얻은 수정된 히트 맵이 있습니다. 온라인 소프트웨어를 사용하여 세포 특이적 유전자 발현 서명과 세포 집단 관계를 확인했습니다. 각 줄은 유전자를 나타내고 각 행은 동일한 세포를 나타내며 세 개의 세포 집단은 파란색, 빨간색 및 녹색으로 표시됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 9시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 및 프라이머 분포에 대한 플레이트의 방향을 주의 깊게 추적하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 연구자가 세포 집단에서 희귀하고 특정한 분자 서명을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 적절한 세포 분류, 사전 증폭 및 로딩 후 여러 단일 세포에서 동시에 여러 유전자 발현을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.