면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

이 절차의 전반적인 목표는 T 림프구 모세포형성 또는 아세포 변형을 측정하여 자동화된 세포 계수기를 사용하여 면역 조절 약물의 효능을 평가하는 것입니다. 이 분석은 세포 직경을 측정할 수 있는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 T 림프구 활성화를 정량화하는 빠른 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 일반적인 T 림프구 증식 분석법과 달리 단일 세포에서 빠르고 간단하며 직접적인 측정이 가능하다는 것입니다.

면역조절제로 림프구를 치료하면 세포 모세포형성의 속도와 정도가 증가하거나 감소합니다. 세포 계수기 분석을 사용하여 이 모세포 형성의 정도를 샘플당 약 4분 안에 측정할 수 있습니다. 희생 제물을 바친 지 10분 이내에 생쥐의 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 가위를 사용하여 쥐의 왼쪽 털과 피부를 절개합니다.

피부를 벌렸다가 뒤로 젖히면 복막이 드러납니다. 그런 다음 절개 부위에 4%의 클로르헥시딘을 바릅니다. 두 번째 가위와 집게를 사용하여 중앙 복부를 따라 2-3cm를 잘라 복막을 엽니다.

그런 다음 비장을 둘러싼 내장 부착물과 과도한 지방을 제거하고 조직을 DPBS 용기로 옮깁니다. 다음으로, 10cm 배양 접시에 10ml의 완전한 RPMI 1640 배지를 넣고 두 개의 멸균된 젖빛 유리 슬라이드 사이의 비장을 분쇄합니다. 멸균 40미크론 나일론 세포 여과기를 통해 조직 슬러리를 새로운 10cm 배양 접시에 여과하여 결합 조직과 파편을 제거하고 원심분리를 위해 단일 세포 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

펠릿을 20ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 준 후 다른 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 10밀리리터의 신선한 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 다시 원심분리하여 섭씨 37도의 완전한 배지 2밀리리터에서 재현탁합니다.

T 세포를 정제하려면 먼저 비장당 1-2개의 나일론 울 컬럼을 5ml의 완전한 RPMI로 2회 세척하고 컬럼을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 2ml의 분리된 비장 세포 현탁액을 각 컬럼의 상단에 로드하고 액체가 양모 상단에 도달할 때까지 세포가 컬럼을 통과하도록 합니다. 다음으로, 섭씨 37도의 신선한 배지 2ml를 컬럼 상단에 추가하고 컬럼 상단의 액체가 울 상단에 도달할 때까지 매체가 나일론 울을 통과하도록 합니다.

이제 울을 섭씨 37도의 완전한 배지 3밀리리터로 덮고 컬럼을 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 모든 B 세포, 섬유아세포 및 부속 세포가 양모 섬유에 부착되도록 합니다. 한 시간 후, 새로운 50ml 원뿔형 튜브에서 5ml의 새로운 완전 배지로 컬럼을 두 번 세척하여 비부착성 T 세포를 용리시킵니다. 그런 다음 원심분리로 세포를 수집합니다.

10ml의 완전 배지로 T 세포를 한 번 세척한 후 펠릿을 2ml의 새로운 완전 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수하고 현탁액을 밀리리터당 6개 세포 농도의 0.5배로 희석하여 실험적으로 적합한 6웰 또는 24웰 세포 배양 플레이트에 파종하기 위한 새로운 완전한 배지에 넣습니다. 분리 후 24시간 이내에 적절한 자극과 관심 있는 실험 약물로 나일론 울 컬럼 분리 T 세포를 활성화합니다.

12-72시간 후, 1mL 피펫을 사용하여 활성화된 처리된 세포를 부드럽게 혼합하여 덩어리를 제거합니다. 자동 세포 계수기로 세포 직경을 측정하려면 각 웰에서 처리된 세포 1ml를 개별 시료 컵으로 옮기고 시료 컵을 자동 세포 계수기의 시료 캐러셀에 놓습니다. 샘플 ID 및 세포 유형 정보를 입력하여 샘플을 기록하고 샘플 실행을 시작합니다.

트리판 블루(trypan blue)를 세포 현탁액과 혼합한 후, 각 샘플에서 약 100개의 세포 이미지가 수집될 때까지 세포를 이미징 필드(imaging field)로 통과시킵니다. 이 소프트웨어는 감지된 각 트리판 블루 염색 및 염색되지 않은 세포 주위에 원을 그려 세포 직경을 결정합니다. 모든 세포가 측정되면 데이터를 스프레드시트로 내보내고, 이 스프레드시트는 측정된 모든 직경에 대한 총 및 생존 가능한 세포 수로 결과를 보여줍니다.

그런 다음 데이터를 히스토그램으로 표시할 수 있습니다. PMA와 이오노마이신으로 이틀 동안 자극을 가한 후, 더 작은 직경을 가진 T 세포의 수가 그에 따라 감소함에 따라 더 큰 세포 직경으로 주파수 분포의 중앙값이 크게 이동하는 것이 관찰됩니다. 고정된 250나노몰 이오노마이신 농도에서 활성화 자극의 농도를 밀리리터당 2나노그램에서 250나노그램으로 높여도 PMA 효과는 크게 변하지 않습니다.

관찰된 T 세포 증식에도 눈에 띄는 차이는 없다. 칼시뉴린 억제제는 T 세포 배세포 형성과 증식을 부분적으로 억제합니다. 활성화된 T 세포의 칼시뉴린 핵 인자를 표적으로 하는 면역억제 화합물을 사용한 T 세포 치료는 배구 반응을 거의 72% 억제합니다.

라파마이신(Rapamycin)과 FTY720은 모세포형성(blastogenesis)에 대해 중등도이지만 통계적으로 유의미한 효과를 나타낸다. TRAM34는 700나노몰 농도에서도 쥐 T 세포 증식에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 라파마이신과 사이클로스포린 A를 함께 사용하면 배세포 형성이 완전히 억제됩니다.

anti-CD3 및 anti-CD28 conjugated magnetic beads로 활성화된 murine T cell에서도 유사한 결과가 관찰됩니다. 이 분석은 다양한 면역조절 약물의 효과를 성공적으로 정량화하는 데 사용할 수 있으며, 세포사멸 및 괴사 세포의 기여를 포함하는 일반적인 증식 분석에 비해 약물 효능을 더 잘 평가할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 최대 15개의 샘플을 안팎으로 측정할 수 있어 모세포 형성과 증식 속도를 동시에 및 이후에 정량화

때때로 기포가 플로우 셀에 들어가 측정을 사용할 수 없게 될 수 있으므로 각 시험의 데이터를 분석에 적용하기 전에 모든 이미지에 기포가 있는지 검사해야 합니다. 이 절차의 한 가지 한계는 샘플에 잔해가 너무 많으면 측정에서 파편을 생존 가능한 세포로 처리할 수 있다는 것입니다. 적절한 변형을 통해 이 분석법은 호중구 및 간세포의 세포 크기 변화를 연구하는 데 적용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.