식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

이 방법은 세포에서 단백질을 어떻게 만들 수 있는지와 같은 식물 분자 및 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 발현 벡터에서 세포 융합 단백질을 공동 발현하는 높은 효율성입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Guitao Zhong

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 단편의 분자 클로닝을 위한 프라이머를 설계합니다. 해당 프라이머 및 high-fidelity 중합효소를 사용한 표준 PCR 반응으로 semi-independent protein expression cassette의 구성에 필요한 DNA 단편을 증폭합니다. 여기에는 promoter, fluorescent reporter, target gene 및 terminator가 포함됩니다.

1%아가로스 겔을 사용하여 DNA 전기영동으로 DNA 분해 및 오염을 찾아 1차 PCR 산물의 품질을 검사합니다. 분광 광도계로 PCR 산물을 정량화합니다. PCR 산물의 260 및 280 나노 미터에서 판독 값의 비율은 1.6에서 1.8 사이 여야합니다.

동일한 단백질 발현 카세트를 위해 설계된 DNA 단편을 하나의 PCR 튜브에 함께 혼합하여 최종 부피 5마이크로리터로 만듭니다. 다른 표현 카세트 데이터의 DNS 혼합에 대해. 동일하면 연결해야 하는 DNA 분자의 수가 증가하기 때문에 DNA 조립의 효율성이 감소하기 때문입니다.

이제 5마이크로리터 DNA 혼합물에 15마이크로리터의 2x 마스터 혼합물을 추가하고 섭씨 50도에서 60분 동안 배양합니다. PCR의 두 번째 라운드로 전체 반독립적인 단백질 발현 카세트를 증폭합니다. 첫 번째 라운드 등온 어셈블리 반응에서 생성된 생성물의 0.5-1 마이크로리터를 가장 바깥쪽 프라이머의 템플릿으로 사용합니다.

50마이크로리터 반응 부피에서 1단위의 고충실도 중합효소를 30회 동안 사용한 다음 섭씨 68도에서 5분 동안 최종 연장합니다. 다음으로, 최종 단백질 발현 백본 벡터 POC 18 및 벡터 CAMBIA 1300을 최종 10 마이크로리터 반응 부피에 4 단위의 작은 것을 추가하여 선형화합니다. 이 벡터는 단백질 일시적 발현 및 유전적 변형을 위해 설계되었습니다.

제한 다이제스트를 섭씨 25도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 분해 후 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 비활성화합니다. 다음으로, 단백질 발현 카세트와 선형화된 최종 벡터의 등몰 DNA 분자를 5마이크로리터의 최종 반응 부피로 혼합합니다.

마지막으로, 15마이크로리터의 2x 마스터 버퍼와 반응을 혼합하고 섭씨 50도에서 60분 동안 배양하여 DNA 재조합의 두 번째 라운드를 수행합니다. 담배 BY-2 현탁 세포를 충격에 대비하려면 진공 압력을 40mbar로 설정하여 진공 펌프를 통해 70ml 오토클레이브 여과지 조각에 30ml의 3일 배양 BY-2 세포를 여과 수집합니다. 한편, 페트리 접시에 BY-2 세포 액체 배양 배지 몇 방울을 추가합니다.

BY-2 셀이 있는 여과지를 페트리 접시에 옮깁니다. 포격을 위해 애기장대 어린 식물을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 7일 된 샘플 식물을 준비합니다. 그런 다음 새로운 절반 강도 MS 중형 플레이트의 중앙에 있는 직사각형으로 변환하여 포격 효율성을 높입니다.

식물을 옮겨 접시에 놓을 때 식물이 겹치지 않도록 주의하십시오. 식물이나 조직의 표면에 절반 강도의 MS 액체 배지를 몇 방울 떨어뜨려 수분을 보존하고 나머지 단계에서 식물이 건조해지는 것을 방지합니다. 금 입자를 플라스미드 DNA로 코팅하려면 먼저 금 마이크로캐리어 용액을 3분 동안 완전히 볼링합니다.

이제 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 25 마이크로 리터의 금 입자를 넣고 10 초 동안 소용돌이 치십시오. 리터당 25.46mg의 스페르미딘 10마이크로리터를 넣고 10초 동안 소용돌이칩니다. 다음으로, 마이크로리터 플라스미드 DNA당 1마이크로그램의 5마이크로리터를 추가하고 3분 동안 와류를 일으킵니다.

마지막으로 25 마이크로 리터의 277.5 밀리그램 염화칼슘 용액을 넣고 1 분 동안 소용돌이칩니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 5초 동안 최대 속도로 골드 마이크로캐리어를 회전시킵니다. 원심분리 후에는 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 파이프로 배출합니다.

다음으로, 200마이크로리터의 절대 에탄올로 펠릿을 세척하고 5-10초 동안 볼텍싱하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 획득하면 5초 동안 최대 속도로 골드 마이크로캐리어를 회전시키고 에탄올을 제거합니다. 금 입자를 18 마이크로 리터의 절대 에탄올에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 6마이크로리터의 입자 현탁액을 3개의 마이크로캐리어 중간에 분취하고 자연 건조시킵니다. 입자 충격을 통해 DNA를 세포와 식물로 전달하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 입자 전달 시스템을 설정합니다. 그런 다음 농업 매체 플레이트의 세포나 식물을 세 가지 다른 위치에서 세 번 폭격합니다.

형광 신호를 관찰하기 전에 6시간에서 72시간 동안 식물 생장실에서 충격을 받은 세포와 식물을 어두운 곳에 두십시오. 식물 생장실을 24시간 어둡고 섭씨 22도로 설정합니다. 어린 식물 또는 현탁 세포를 기존의 유리 슬라이드로 옮기고 표준 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 이미징할 수 있도록 상단에 커버 슬라이드를 부드럽게 놓습니다.

텍스트 프로토콜에 나열된 설정을 사용하여 485나노미터에서 GFP 태그가 지정된 단백질을 여기시키고 525나노미터에서 형광을 검출합니다. RFP 태그가 지정된 단백질의 경우 585나노미터에서 여기하고 608나노미터에서 검출합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 신호의 collocalization ratio를 계산합니다.

담배 BY-2 세포에서 애기장대 VSR-2 및 애기장대 SCAMP4의 동시 발현은 입자 충격을 통해 달성되었으며 정확한 국소화를 보여줍니다. RFP 애기장대 VSR-2는 애기장대 SCAMP4-GFP의 원형질막 국소화와 구별되는 반점 패턴을 보여주며, 일부 세포질 반점 점이 있습니다. 또한, 애기장대 SCAMP4-GFP 및 RFP 애기장대 VSR-2를 함께 발현하는 애기장대 형질전환 식물은 농균 매개 형질전환을 통해 생성되었습니다.

뿌리 유모 세포와 뿌리 유모 세포에서 두 개의 키메라 단백질을 공동 발현하는 세포 내 국소화가 표시됩니다. 이전 연구와 일치하게, 형질전환 애기장대(transgenic arabidopsis)의 치료는 RFP 애기장대 VSR-2 표지된 체포 전 구획(prevacualar compartments)을 유발하여 작은 고리 모양의 구조를 형성했습니다. 반면 프리폴딘 A 유도 애기장대 SCAMP GFP로 치료하면 트랜스골드 G-네트워크 응집체가 표시되었습니다.

음성 대조군으로, 담배 BY-2 세포와 애기장대 뿌리 및 뿌리 유모 세포에서 동일한 이미지 수집 설정을 적용하여 자가 형광 신호가 거의 관찰되지 않습니다. 이 방법은 단백질의 세포 내 국소화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 단백질 방향에 대한 연구에 적용할 수도 있습니다.

개발 후 이 기술은 식물 세포 생물학 분야의 연구자들을 위한 길을 열었습니다. 살아있는 식물 세포에서 단백질의 세포 내 국소화 및 공간적 상호 작용을 편리하게 내보냅니다. 이 절차에 따라 PET 매개 형질전환 및 유전자 교차와 같은 다른 방법을 수행하여 식물에서 여러 융합 단백질을 공동 발현하는 방법과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

폭격으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 눈 보호구와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.