Name: 식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 식물에서 여러 형광 융해 단백질을 효율적으로 공동 발현하는 방법을. 단일 벡터를 사용하여 단백질 상호작용과 세포 내 국소화를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 식물 세포생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

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우리는 유용한 토론 및 의견을 위한 왕 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 호우에는 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 보조금 번호 31570001)와 및에 의해 자연 과학 재단의 광 동성 광저우 시 (no. 2016A030313401 및 201707010024 부여) 지원

1. 뇌관 디자인 전략 및 DNA 증폭
<ol><li>DNA 파편의 분자 클로닝을 위한 뇌관 디자인. 뇌관 20 bp 유전자 특정 바인딩 시퀀스 및 인접 한 DNA 분자의 상호 보완적인 겹치는 순서 (예를 들어 표 1 참조)는 20 ~ 25 bp 5'-끝 오버행 시퀀스 구성. 참고: 각 DNA의 후속 어셈블리 조각, 다른 단백질 식 카세트의 결합 그리고 인접 한 중첩 시퀀스의 인식에 따라 모든 최종 식 벡터와의 통합.</li>
	<li>DNA 파편, 발기인, 형광 기자, 대상 유전자와 터미네이터를 포함 하 여 그들의 해당 뇌관으로 표준 PCR 반응에 의해 반 독립적인 단백질 식 카세트의 건설에 필요한 고 높은 증폭 피델 리 티 중 합 효소입니다. 참고: DNA 증폭에 대 한이 연구에 사용 된 서식 파일은 이전 연구15,,2223에서 파생 됩니다. 어 닐 링 온도 확장 시간 PCR 반응의 뇌관과 유전자 종속 있습니다.</li>
</ol>2. DNA 조각 어셈블리 및 단백질 식 카세트의 건설
<ol><li>DNA 전기 이동 법에 의해 1 라운드 PCR 제품의 품질을 검토 하 고 분 광 광도 계에 의해 계량. 1 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA 저하 및 오염 발생 한 여부를 확인 합니다. PCR 제품의 OD260/OD280 1.6과 1.8 사이 이어야 한다.</li>
	<li>다른 DNA 파편을 혼합 (0.05-0.1 pmol 각 단편에 대 한) 5 µ L의 최종 볼륨을 새로운 PCR 튜브에. 참고: 혼합 DNA 분자를 위한 동일한 단백질 식 카세트 함께 한 PCR 튜브에. 그것은 연결 하는 데 필요한 DNA 분자의 증가 수 때문에 DNA 어셈블리의 효율성을 줄일 수 있기 때문에, 함께, 다른 식 카세트에서 DNAs를 혼합 하지 마십시오. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>5 x ISO 재고 버퍼 준비: 500 mM Tris HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 m m deoxynucleotide (dNTP); 50mm dithiothreitol; 25% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 8000; 그리고 5mm 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD).</li>
	<li>ISO 재고 버퍼, T5 exonuclease, 고 충실도 DNA 중 합 효소의 62.5 단위, Taq 중 합 효소의 5000 단위 단위의 7.5 x 1 mL 마스터 혼합물 400 µ L 5에서에서 x 2를 만들기 ( 재료의 표참조), 및 소독된 이중 증 류 H2o. 참고: 이것은 이전 연구24,25,의26;에서 적응 이러한 볼륨은 최적화 되어야 합니다.</li>
	<li>튜브 및-20 ° c.에 게 마스터 혼합물 x 2의 aliquot 100 µ L 주의: 빈번한 중지 및 재개 2 x 마스터 혼합물의 낮은 DNA 어셈블리 효율을 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>2 x 마스터 혼합물의 15 µ L 5 µ L DNA 혼합물에 추가 하 고 60 분 동안 50 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3. 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 표현 위한 벡터의 건설
<ol><li>전체 반 독립적인 단백질 식 카세트는 제품을 사용 하 여 2 차 PCR에 의해 증폭 (0.5-1.0 µ L) 템플릿과 바깥쪽 뇌관 (예를 들어, 1 FP35S 및 식에 대 한 1-RNOS로 1 라운드 등온선 어셈블리 반응에서 카세트 1)입니다.<ol>
<li>50 µ L 반응 볼륨에서 고 충실도 중 합 효소의 사용 1 단위 다음 30 사이클 (94 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 및 2 분 동안 68 ° C), 뒤에 5 분 동안 68 ° C에서 최종 확장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>최종 단백질 식 백본 벡터 pUC18 및 pCAMBIA1300, 4 단위 Sma 를 추가 하 여 단백질 과도 식 및 유전자 변환, 각각, 디자인 되는 선형화 최종 10 µ L 반응 볼륨으로 나 고 1-잠복기 25 ° c.에서 2 시간 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화.</li>
	<li>5 µ L의 최종 반응 볼륨에 단백질 식 카세트 및 선형화 마지막 벡터의 아데닌 DNA 분자를 혼합. 그런 다음 마스터 버퍼와 60 분 50 ° C에서 배양 x 15 µ L 2와 혼합 하 여 2 차 DNA 재결합을 수행 합니다.</li>
	<li>2 차 등온 재결합 반응의 최종 제품을 사용 하 여 유능한 대장균 을 변형 표준 절차27에 따르면 셀 (예: DH5α). 식민지 PCR와 DNA 시퀀싱에 의해 긍정적인 식민지를 다시 확인 합니다. 미니 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 대장균 에서 긍정적인 플라스 미드를 추출 하 고-80 ° c.에 저장 주의: 장기 저장을 위한 테 버퍼에 녹아 있는 플라스 미드 또는 두 배 증류수 H2O 대장균 변종에서 그들을 유지 하는 것 보다 더 안정.</li>
</ol>4. Biolistic-사격 중재 식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 과도 공동 식
<ol><li>사격에 대 한 담배 BY-2 현 탁 액 셀과 애기 청소년 식물을 준비 합니다.<ol>
<li>두 번 주당 130 rpm에서 설정 하는 통에 25 ° C에서 subculturing에 의해 Skoog (MS)와 村 重 매체에서 문화 BY-2 셀. 70 밀리미터 압력가 필터 종이 통해 진공 펌프는의 조각에 경작 수집 30 mL 3 d BY-2 셀 40 mbar 진공 압력을 설정 하 여 필터링 합니다.</li>
		<li>다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 건조에서 세포를 방지 하기 위하여 여러 방울 추가 BY 2 셀 액체 문화 매체의 페 트리 접시에 필터 종이 배치 하기 전에 (다음 단계).</li>
		<li>그것에 새로운 배양 접시 (85 m m x 15 m m) BY-2 셀으로 필터 종이 전송.</li>
		<li>표면 70% (v/v) 에탄올 0.05% 포함 된 vortexing는 혼합물에 의해 애기 thaliana (열 0) 씨앗을 소독 10 분 트윈 20.</li>
		<li>벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 회전 s는 상쾌한을 제거 하 고 100% 에탄올과 씨앗 30 미 피 펫 멸 균 후드에 새로운 살 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 한 번 세척. 그런 다음, 씨앗을 건조 하 고 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.</li>
		<li>다음 설정 사용 하 여 식물 성장 챔버로 그들을 전송 하기 전에 48 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장: 16 h 120-150 µ m m-2 s-1 강도, 22 ° C. 8 h 어두운 빛
</li>
		<li>폭격의 효율성을 증가 하는 새로운 ½ MS 중간 접시의 중앙에 30mm 직경 원형으로 7-하루 오래 된 샘플 식물을 전송 합니다. 주의: 중복 식물 전송 하 고 새로운 ½ MS 접시에 그들을 배치 하지 마십시오.</li>
		<li>식물의 수 분을 유지 하 고 다음 단계를 수행 하는 동안 밖으로 식물 건조 방지를 조직 표면에 ½ MS 액체 매체의 몇 방울을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드 DNA와 금 입자 코트.<ol>
<li>와 동 골드 microcarrier 솔루션, 철저 하 게 3 분에 대 한 새로운 1.5 mL 튜브 준비.</li>
		<li>튜브와 소용돌이에 다음과 같은 솔루션을 순차적으로 추가: 25 µ L (1.5 m g) 골드 입자, 소용돌이 10 s; 25.46 mg/L spermidine, 소용돌이 10 s;의 10 µ L 5 1µg / µ L 플라스 미드 DNA의 µ L, 소용돌이 3 분; 25 277.5 mg/L CaCl2 솔루션의 µ L, 소용돌이 1 분. 주의:이 단계 동안 vortexing를 유지.</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않고 5 s와 신중 하 게는 상쾌한 밖으로 피 펫에 대 한 최대 속도 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하는 골드 microcarriers 아래로 회전 합니다. 절대 에타 놀의 200 µ L로 세척 하 고 다시 일시 중단 소용돌이 의해 펠 릿 5-10 s. 스핀 다운 5 s와 제거는 에탄올에 대 한 최대 속도.</li>
		<li>절대 에타 놀 및 aliquot 6 µ L 입자 현 탁 액 3 macrocarriers의 중간에 18 µ L에 다시 금 입자를 일시 중단 합니다. 그들이 건조 한 공기 보자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>입자 사격을 통해 식물으로 DNA를 전송.<ol>
<li>다음으로 입자 배달 시스템 설정: 1100 psi, 28 mm Hg 진공, 1 cm 간격 거리 및 9 cm 입자 비행 거리.</li>
		<li>세 가지 다른 위치에서 세 번에 대 한 한 중간 접시에 셀/식물을도 배 하 고 사격 직후 어둠의 셀/식물을 유지. 주의: 시스템에 고압 가스 및 고속 입자의 협회 때문에 입자 배달 시스템을 작동할 때 안전 안경 착용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 신호 관찰 6 ~ 72 시간에 대 한 식물 성장 챔버에 어둠 속에서 포 격하 셀/식물을 유지. 24 h 어두운와 22 ° C에 식물 성장 챔버를 설정 주의: 식 효율과 형광 신호 강도 발기인, 유전자 및 식물/조직-의존 합니다.</li>
</ol>5. 공동 Agrobacterium에의해 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 안정적인 유전자 변형 애기의 생성-변화를 중재.
<ol><li>Thaw Agrobacterium 유능한 세포 (PMP90) 얼음에 30 분 동안 대기 후 2 µ L 이진 벡터 (100-200 ng) (준비 위) 유능한 세포에 추가. 10 분 동안 얼음에 혼합물을 앉아.</li>
	<li>미리 냉장된 0.1 cm electroporation 베트로 혼합물을 전송 합니다. 멧 electroporation 시스템에 삽입 하 고 다음 설정으로 electroporation 수행: 1.6 k v, 600 옴, 25 µ F.</li>
	<li>electroporation 직후는 베트에 SOC 액체 매체의 1 mL을 추가 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 세포를 플라스틱 120 분 200 rpm에서 수평 궤도 통에 28 ° C에서 품 어.</li>
	<li>5 분 동안 실 온에서 2,348 x g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한의 대부분, 부드럽게 다시 피 펫 팁 일지도 셀을 일시 중단, 50 mg/L Hygromycin B를 포함 하는 파운드 접시에 그들을 확산 그리고 28 ° C에서 2-3 일 동안 품 어.</li>
	<li>애기 thaliana Col 0 식물에서 Agrobacterium, 이전에 설명한 대로 꽃 딥28 메서드에서 여러 단백질 식 카세트와 통합 이진 벡터 pCAMBIA1300 포함 된 변환 안정적인 유전자 변형 식물을 생성 합니다.</li>
	<li>0.05%를 포함 하는 70% (v/v) 에탄올과 혼합 하 여 유전자 변형 애기 씨앗의 표면 소독 트윈 20. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 2를 최대 속도로 씨앗 아래로 10 분 회전을 위해 소용돌이 s, 상쾌한, 제거 하 고 씻어 30 한 번 100% 에탄올과 씨앗 s.</li>
	<li>살 균 후드에서 무 균 필터 종이에 씨앗 밖으로 플라스틱. 그 후, 건조 한 공기 하 고 긍정적인 progenies 심사 Hygromycin B를 포함 하는 ½ MS 한 접시에 그들을 확산.</li>
	<li>2 일 동안 4 ° C에서 번호판을 품 어. 그런 다음, 전송 그들 문화와 식물 성장 챔버에 7 일.</li>
	<li>형광 현미경 형광 신호를 확인 하 여 7 일 오래 된 생존 청소년 식물을 선택한 다음 추가 homozygous 식물의 심사에 대 한 토양에 식물을 전송 합니다.</li>
</ol>6. 제약 치료
<ol><li>약 제 치료에 대 한 세포 또는 식물 부 화 하기 전에 그것의 적절 한 작동 농도 액체 MS 매체에서 각 약물을 희석.<ol>
<li>Wortmannin 치료: DMSO에 wortmannin 분말을 용 해 하 여 1 m m wortmannin의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 16.5 µ M wortmammin를 포함 하는 액체 MS 매체로 청소년 식물 또는 식물 세포를 전송 및 이미징 하기 전에 30-45 분 동안 품 어.</li>
		<li>Brefeldin A (BFA) 치료: DMSO에 BFA 분말을 용 해 하 여 1mm BFA의 재고 솔루션을 준비 하 고-20 ° c.에 주식을 저장 식물 세포 또는 식물 청소년 10 µ g/mL BFA 이미징 하기 전에 30-45 분을 포함 하는 액체 MS 매체에 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. confocal 현미경 이미징 및 단백질 Subcellular 공동 지역화 분석
<ol><li>젊은 식물 또는 기존의 유리 슬라이드에 현 탁 액 셀 전송 및 부드럽게 표준 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 이미징에 대 한 상단 커버 슬라이드를 입었다. 다음 설정을 사용 하 여: 63 X 물 목표 (한다 1.4), 0 배경, 700 증가, 0.168 mm 픽셀 크기, 및 광 전 증폭 관 관 탐지기. 485에서 단백질 GFP 태그 자극 nm 525에서 형광을 검출 하 고 nm. 514에 자극 RFP 태그 단백질에 대 한 nm 575에 감지 nm.</li>
	<li>피어슨 Spearman 상관 (PSC) 공동 지역화는 앞에서 설명한8플러그인으로 이미지 J 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 형광 신호의 공동 지역화 비율을 계산 합니다. 피어슨 상관 계수 또는 Spearman의 순위 상관 관계 계수 (그림 4) 결과에 표시 됩니다. 생산된 r 값 1-1에서 될 것입니다. 반면 + 1과-1 완전 긍정적이 고 부정적인 상관 관계, 각각, 2 개의 신호의 0, 2 개의 신호 감지 상관 관계가 보여줍니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 튼튼하게 공동 식물에 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 새로운 방법 설명 했다. 그것은 과도 식 및 유전자 변환 사용할 수 있으며 현재 형광 단백질 기반 바이오 이미징, 분자, 및 생 화 확 적인 응용 프로그램 및 기술9,10,13와 호환 . 또한, 그것은 단백질 공동 식에 대 한 몇 가지 개별 식 플라스 미드를 사용 하는 기존 방법의 어려움을 극복 한다. 대조적으로, 그것은 여러 단백질 식 카세트와 그들의 자신의 개인 발기인, 형광 태그, 대상 단백질, 종결자를 포함 하는 단일 식 벡터를 사용 합니다. 또한, 단백질 식 카세트 관리할 수 있습니다 하지 독립적으로 특정 발기인의 사용 대상 단백질으로 형광 단백질의 N-또는 C 터미널 공상 융합 등 다양 한 식 요구 사항에 맞게. 따라서, 단백질 식 카세트 기능 같은 플라스 미드에 반 독립적으로 작동...

공상 형광 성 융해 단백질 세포 역학 및 subcellular 지 방화를 연구 하 고 그들의 생리 적 기능 및 작동 메커니즘1,2, 양지 유용한 도구로 간주 되고있다 3 , 4. 공동 익스프레스 spatiotemporal 근거, 분포, 그리고 셀4 endomembrane 시스템 내에서 복수 위해 문제의 단백질으로 잘 알려진 세포 기관이 기자 단백질에 특히 유리 하다 , 5 , 6 , 7 , 8.
공상 형광 성 융해 단백질은 과도 식 통해 식물 및 안정적인 유전자 변환, 그들의 각각 장점과 제한9,,1011에 표현할 수 있습니다. 단백질의 과도 식 biolistic 폭격-, 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함 하는 편리한 접근 이다-, 또는 protoplasts 및 AgrobacteriumDNA 과도 식 electroporation 중재-중재 하는 잎에 침투 그대로 식물 세포, 그림 1A, B12,13,14,,1516와 같이. 그러나, 단일 식물 세포에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식 여러 독립 식 플라스 미드의 혼합물을 요구 한다. 따라서, 여러 개의 플라스 미드 단백질 공동 식 식물에 대 한 고용의 단점은 동시에 동일한 셀 단일 플라스 미드에 비해 입력 몇 plasmids의 극적으로 감소 된 우연 저수준 공동 식 그리고 각 유형의 셀17,18에 전송 되는 플라스 미드의 미친 듯이 임의의 금액으로 인 한 단백질 식 레벨의 변형입니다. 또한, 그것은 기술적으로 단일 Agrobacterium 단백질 공동 식9,,1011에 대 한 여러 독립 식 플라스 미드를 도전. 따라서, Agrobacterium-담배의 침투에 의해 과도 식 나뭇잎 중재 단백질은 그림 1B와 같이 한 번에 한 플라스 미드를 표현. 반면, 형광 성 융해 단백질을 표현 하는 유전자 변형 식물의 세대 보통 Agrobacterium 이진 변환 벡터를 전달 함으로써 이루어집니다. 그러나, 유전자 이동 및 식물 게놈으로 삽입 중재 이진 벡터는 단일 형광 성 융해 단백질 (그림 1B)9,,1012표현만 합니다. 여러 공상 형광 단백질을 동시에 표현 하는 유전자 변형 식물 생성 여러 라운드를 유전 교차점 및 심사, 공동 표현 될 유전자의 숫자에 따라 년 개월에서 걸릴 수 있습니다 필요 합니다.
식물에 있는 여러 단백질의 공동 식에 대 한 단일 식 벡터 이전으로 보고 되었습니다 고용 연구19,,2021. 그러나, 효소 소화의 여러 라운드 및 DNA 분자 및 백본 벡터 DNA 결 찰 일반적으로에 단백질 공동 식 또는 오버 식에 대 한 최종 플라스 미드의 생성. 여기, 우리는 공동 식물에 여러 공상 형광 단백질을 표현 하는 새롭고 강력한 방법을 개발 했습니다. 모두 과도 식에 대 한 식물에 여러 단백질 공동 식와 영광 패션에 안정적인 변화는 매우 효율적이 고 편리한 방법 이다. 그것은 단백질 공동 식에 대 한 여러 기능적으로 독립적인 단백질 식 카세트를 포함 함으로써 기존 방법의 단점을 극복 하는 하나의 벡터를 사용 합니다. 또한, 그것은 매우 다양 한 시스템은 dna에서 조작 및 어셈블리 DNA 소화 및 결 찰의 추가 단계 없이 최적화 된 간단한 원스텝 반응에 의해 달성 된다. 작동 원리는 그림 2에 나와 있습니다. 또한, 그것은 공상 형광 성 융해 단백질을 기반으로 하는 현재 세포, 분자, 및 생 화 확 적인 접근을 완벽 하 게 호환입니다.

<table><tbody><tr><td>KOD-FX 중합효소</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 엑소뉴클레아제</td><td>진원지</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 고충실도 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 및 Skoog 기초 염 혼합물(MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>금 마이크로캐리어 입자</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &마이크로; m</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Rupture disk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>정지 스크린</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td> <td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He 입자 전달 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780& 7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 전원 공급 장치</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

단백질의 subcellular spatiotemporal localization(s)에 대 한 정보는 세포에서의 생리 기능을 이해 하는 중요 한. 형광 단백질 및 형광 성 융해 단백질의 생성 격렬 하 게 사용 되었습니다 효과적인 도구로 직접 단백질 지 방화 및 셀에서 역학을 시각화. 특히 관심의 단백질와 공동 식 후 잘 알려진 세포 기관이 마커를 비교 유용 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 단백질 공동 식 식물에 대 한 고전적인 접근 일반적으로 여러 개의 독립 식 플라스 미드를 포함 하 고 따라서 낮은 공동 식 효율, 식 수준 변화, 그리고 높은 시간을 포함 하는 단점을가지고 유전자 교차 및 심사 비용입니다. 이 연구에서 우리는 식물에 여러 공상 형광 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 여러 개의 반 독립적인 표현 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 사용 하 여 기존 방법의 한계를 극복 했다. 각 단백질 식 카세트 자체 기능 단백질 식 요소를 포함 하 고 따라서 그것은 유연 하 게 다양 한 식 수요에 맞게 조정할 수 있다. 또한, 그것은 간단 하 고 편리 하 게 수행 하는 어셈블리 및 조작 DNA의 추가 소화 및 결 찰 단계 없이 최적화 된 원스텝 반응을 사용 하 여 식 플라스 미드에 조각. 또한, 현재 파생 된 형광 단백질 바이오 이미징 기술 및 응용 프로그램, 무서 워, BiFC 등 완벽 하 게 호환 됩니다. 방법의 유효성 검사,으로 우리 붙일 융합 공동 급행 vacuolar 정렬 수용 체와 분 비 캐리어 막 단백질이 새로운 시스템을 채택. 결과 그들의 관점의 subcellular 지 방화는 과도 식과 유전자 변형 식물에 의해 이전 연구에서와 같이 보여.

식물에 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식에 대 한 강력 하 고 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. 그것은 종래의의 장벽을 통해 휴식 같이 그림 1A, B를 통해 접근 단백질 공동 식에 여러 개의 분리 된 플라스 미드를 사용할 과도 식 또는 안정적인 유전자 변환. 이 새로운 방법에서는, 우리는 단백질 공동 식 한 번에 (그림 1 cD)를 달성 하기 위해 여러 단백질 식 카세트의 구성 된 단일 식 벡터를 생성 합니다. 고 단백질 식 카세트 기능 단백질 표정에 대 한 그것의 자신의 필수 DNA 요소와 반 independently. 따라서, 각 단백질 식 카세트 수 사용자 지정할 수 없는 독립적으로 단백질 표정에 대 한 다양 한 요구에 따라. 최종 단백질 공동 식 벡터에 관해서는 그것에...

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

이 방법은 세포에서 단백질을 어떻게 만들 수 있는지와 같은 식물 분자 및 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 발현 벡터에서 세포 융합 단백질을 공동 발현하는 높은 효율성입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Guitao Zhong이 맡을 것입니다.시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 단편의 분자 클로닝을 위한 프라이머를 설계합니다. 해당 프라이머 및 high-fidelity 중합효소를 사용한 표준 PCR 반응으로 semi-independent protein expression cassette의 구성에 필요한 DNA 단편을 증폭합니다. 여기에는 promoter, fluorescent reporter, target gene 및 terminator가 포함됩니다.1%아가로스 겔을 사용하여 DNA 전기영동으로 DNA 분해 및 오염을 찾아 1차 PCR 산물의 품질을 검사합니다. 분광 광도계로 PCR 산물을 정량화합니다. PCR 산물의 260 및 280 나노 미터에서 판독 값의 비율은 1.6에서 1.8 사이 여야합니다.동일한 단백질 발현 카세트를 위해 설계된 DNA 단편을 하나의 PCR 튜브에 함께 혼합하여 최종 부피 5마이크로리터로 만듭니다. 다른 표현 카세트 데이터의 DNS 혼합에 대해. 동일하면 연결해야 하는 DNA 분자의 수가 증가하기 때문에 DNA 조립의 효율성이 감소하기 때문입니다.이제 5마이크로리터 DNA 혼합물에 15마이크로리터의 2x 마스터 혼합물을 추가하고 섭씨 50도에서 60분 동안 배양합니다. PCR의 두 번째 라운드로 전체 반독립적인 단백질 발현 카세트를 증폭합니다. 첫 번째 라운드 등온 어셈블리 반응에서 생성된 생성물의 0.5-1 마이크로리터를 가장 바깥쪽 프라이머의 템플릿으로 사용합니다.50마이크로리터 반응 부피에서 1단위의 고충실도 중합효소를 30회 동안 사용한 다음 섭씨 68도에서 5분 동안 최종 연장합니다. 다음으로, 최종 단백질 발현 백본 벡터 POC 18 및 벡터 CAMBIA 1300을 최종 10 마이크로리터 반응 부피에 4 단위의 작은 것을 추가하여 선형화합니다. 이 벡터는 단백질 일시적 발현 및 유전적 변형을 위해 설계되었습니다.제한 다이제스트를 섭씨 25도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 분해 후 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 비활성화합니다. 다음으로, 단백질 발현 카세트

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

녹색 형광 단백질 유전자가 발견된 이래로 형광 단백질은 분자 세포 생물학에 영향을 미쳤습니다. 이 프로토콜은 유전 공학을 통한 뚜렷한 형광 단백질의 발현이 개별 세포를 바코드로 만드는 데 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 절차를 통해 세포 혼합물에서 고유한 집단을 추적할 수 있으며, 이는 다중화 응용 분야에 이상적입니다.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

배우세요 식물에서 여러 형광 융해 단백질을 효율적으로 공동 발현하는 방법을. 단일 벡터를 사용하여 단백질 상호작용과 세포 내 국소화를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 식물 세포생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

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