자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

이 방법의 전반적인 목표는 생체 내에서 실험적 뇌성 말라리아의 병리학적 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 전체 뇌의 병리학이 공간과 시간에 따라 어떻게 진화하는지 생체 내에서 시각화할 수 있기 때문에 실험적 뇌 말라리아의 발병 기전에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술을 통해 뇌 병리학을 자세히 평가할 수 있으며 뇌성 말라리아에 대한 새로운 치료 전략의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

MRI 설정은 실험실 관리자인 Manuel Fischer가 수행합니다. 혈액 식사 후 17일에서 22일 후에 우리에서 암컷 모기를 수집하는 것으로 시작하십시오. 집게를 사용하여 3-4마리의 모기를 유리 슬라이드에 놓고 차가운 RPMI 배지 한 방울을 떨어뜨립니다.

그런 다음 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다. 집게로 모기를 머리와 몸통 사이로 조심스럽게 펴고 주사기와 바늘을 사용하여 침샘을 분리합니다. 다음으로, 유리 슬라이드에서 타액선을 유리 피펫으로 빨아들여 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮겨 채취합니다.

그런 다음 작은 플라스틱 막대기를 사용하여 원심분리기 튜브 내에 있는 고립된 타액선을 3분 동안 부수어 타액선 조직에서 포자선을 분리합니다. 1, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용하여 나머지 조직에서 sporozoite를 정화합니다. 포자동물이 포함된 상등액을 새 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 Neubauer 혈구계에서 정제된 포자동굴을 계수합니다.

스포로조이트는 전형적인 반시계 방향 움직임을 보여줍니다. 다음으로, 인산염 완충 식염수를 첨가하여 정제된 포자암의 농도를 밀리리터당 10, 000으로 조정합니다. 마지막으로 C57BL/6 마우스를 구속기에 넣고 꼬리를 따뜻한 물에 넣어 꼬리 정맥을 더 잘 시각화합니다.

그런 다음 총 1, 000 포자 주산 또는 0.1 밀리리터를 꼬리 정맥에 주입하여 감염을 시작합니다. 먼저 무선 주파수 전송을 위해 체적 공진기를 사용하는 9.4T 소형 동물 자기 공명 영상 또는 MRI 스캐너로 마우스를 가져옵니다. 그런 다음 덱스판테놀 안연고를 양쪽 눈에 바릅니다.

마우스의 체온을 유지하기 위해 온도 조절이 가능한 수조를 섭씨 42도까지 켭니다. 그런 다음 꼬리 정맥 카테터를 마우스의 꼬리 정맥에 삽입합니다. 다음으로, 머리 움직임을 최소화하기 위해 헤드록과 치아 막대가 있는 동물 침대에 엎드려 등을 구부리고 MRI를 위해 마우스를 배치합니다.

마우스의 경추를 곧게 펴지 않도록 주의하십시오. 킬로그램당 0.3밀리몰 Gd-DTPA로 채워진 조영제 주입 시스템을 꼬리 정맥 카테터에 연결합니다. 그런 다음 4채널 위상 배열 표면 수신기 헤드 코일을 마우스 헤드에 놓습니다.

마지막으로 마우스 뒷면에 호흡 패드를 놓고 모니터링 장치에서 호흡을 확인합니다. 제어판에서 F2를 눌러 위치 레이저를 켜고 수평 위치 조명이 마우스 머리를 덮는 코일의 작은 부분 중앙에 올 때까지 마우스를 움직입니다. F2를 다시 눌러 위치 레이저를 끈 다음 제어판에서 F3을 눌러 마우스를 최종 위치로 이동합니다.

먼저 국소화 스캔을 수행하여 마우스 뇌가 자석의 등중심에 있는지 확인합니다. 3D T2 가중 이미징을 사용하여 혈관 부종을 정성적으로 평가합니다. 다중 슬라이스 RARE 염기서열을 선택하고 슬라이스 위치를 조정하여 코에서 소뇌까지 전체 뇌가 덮이도록 합니다.

채도 슬라이스를 조정한 후 시퀀스를 시작하고 이미지를 획득할 때까지 10분 48초 동안 기다립니다. 다음으로, T2 이완 측정을 수행하여 다중 슬라이스, 다중 스핀 에코 염기서열을 선택하여 혈관 생성 부종을 정량적으로 평가합니다. 슬라이스 위치를 조정하고 8분 53초가 걸리는 시퀀스 획득을 시작합니다.

혈관성 부종과 세포독성 부종을 모두 정량적으로 평가하려면 스핀-에코 EPI 확산 염기서열을 선택하여 확산 가중 이미징을 수행합니다. 슬라이스 위치와 채도 슬라이스를 조정합니다. 그런 다음 시퀀스를 시작하고 원시 이미지가 획득될 때까지 7분 56초 동안 기다립니다.

그런 다음 3D T2 별 가중 이미징을 사용하여 미세출혈을 평가합니다. 흐름 보상 플래시 시퀀스를 선택하고, 슬라이스 위치를 조정하고, 15분 40초 동안 실행되는 시퀀스를 시작합니다. 그 후, 3D FLASH 시퀀스를 선택하여 비행 시간 혈관 조영술을 사용하여 동맥 개통을 평가합니다.

슬라이스 위치를 조정하고 시퀀스를 시작한 다음 이미지가 획득될 때까지 7분 16초 동안 기다립니다. 마지막으로 혈액뇌장벽 파괴를 평가합니다. FLASH 시퀀스가 있는 3D T1 가중치 이미징을 선택하고 슬라이스 위치를 조정한 다음 시퀀스를 시작합니다.

콘트라스트가 없는 이미지가 획득될 때까지 1분 14초 동안 기다립니다. 그런 다음 킬로그램당 0.3밀리몰의 대비를 주입하고 측정을 반복합니다. 혈액뇌장벽 파괴의 증가와 체액의 증가는 경증의 질환에서 이미 존재하는 후각구의 조기 혈관유발 부종을 나타내며, 질병의 중증도가 증가함에 따라 뇌간으로 퍼지기 시작합니다.

T2 맵에서 혈관성 부종의 중증도는 관심 영역을 특정 해부학적 영역으로 그려 정량화할 수 있습니다. 각 영역에 대해 부종이 증가함에 따라 증가하는 T2 이완 시간을 얻을 수 있습니다. 또한, 부종을 나타내는 뇌 용적은 기준선에 비해 중등도 질환 마우스에서 크게 증가하기 시작하며, 중증 질환 마우스에서는 더욱 증가합니다.

마지막으로, 미세출혈과 혈관 감수성 대비의 증가로 입증된 미세혈관 병리학은 혈관성 부종에서 혈뇌장벽 파괴의 첫 징후가 나타난 후에 발생합니다. 이러한 미세출혈은 주로 후각구에서 발생합니다. 전체 MRI 프로토콜이 얻어지면 적절하게 수행되면 포지셔닝을 포함한 모든 이미지를 1시간 이내에 얻을 수 있습니다.

최소 프로토콜에는 혈관성 부종, 미세혈구 부하 및 미세혈관 손상의 존재를 판단하기 위해 T2 가중 염기서열 또는 T2 이완 측정법과 T2 별 가중 염기서열이 포함되어야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전뇌 MRI가 체외에서 감지하기 어려운 뇌 부종과 같은 변화를 포함하여 실험적 뇌 말라리아의 병리학적 변화를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.