과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

이 열 충격 유도 단백질 발현 시스템의 전반적인 목표는 곤충 세포에서 잠재적으로 기능적으로 길항하는 두 단백질에서 단백질 항 세포사멸 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 생명공학 및 단백질체학에서 후보 단백질의 기능 및 활성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 항세포사멸 활성 및 단백질 상호 작용과 같은 단백질의 기능에 대한 답변이 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 타이밍이 열 충격 유도에 의해 제어된다는 것입니다.

따라서 이 방법은 단백질 기능 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 포유류 단백질 발현과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 Spodoptera frugiperda 또는 Sf9 곤충 세포는 섭씨 28도의 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크에서 세포 배양 배지에서 성장합니다.

세포 배양 플라스크를 흔들어 플라스크에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 세포의 약 80%가 분리되었는지 확인합니다. 세포 현탁액의 50%를 새로운 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮기고 세포를 실온에서 15분 동안 부착합니다.

15분 후, 배지를 5ml의 신선한 배양 배지로 교체하고 섭씨 28도의 인큐베이터에서 자랍니다. 세포 성장에 따라 2-3일마다 세포를 통과시킵니다. Sf9 세포를 채취하기 전에 박테리아 또는 기타 미생물에 의한 오염이 없는지 광학 현미경으로 세포를 확인하는 것이 중요합니다.

Sf9 세포를 채취하려면 배양 플라스크를 흔들어 세포를 분리한 다음 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. P10 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 세포 현탁액을 혈구계로 옮기고 광학 현미경으로 세포 수를 계수합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 10-5번째 셀을 3회 플레이트하고 15분 동안 실온에 둡니다.

15분 후 배지를 0.5ml의 도금 매체로 교체하십시오. 세포 transfection regent를 준비합니다. 각 transfection에 대해 8μl의 cell transfection 시약을 100μl의 무혈청 세포 배양 배지로 희석하고 1초 동안 와류로 혼합합니다.

본 연구에서는 초파리 열쇼크 70 프로모터, 전장 IAP3, RING 도메인이 없는 절단, BIR 도메인이 없는 절단의 제어 하에 세포사멸 3 억제제인 Baculoviral 유전자의 세 가지 절단이 발현됩니다. 각 플라스미드 DNA 2마이크로그램을 100마이크로리터의 무혈청 세포 배양 배지에 첨가하고 1초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 포지티브 컨트롤도 준비합니다.

희석된 plasmid DNA와 희석된 세포 transfection 시약을 결합하고 vortexing으로 혼합합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. P1000 피펫을 사용하여 각 DNA transfection 시약 혼합물 210마이크로리터를 세포에 적가합니다.

섭씨 28도에서 5시간 동안 배양합니다. 5시간 후 도금 배지를 0.5ml의 세포 배양 배지로 교체한 다음 24웰 플레이트를 테이프로 밀봉합니다. 28도에서 배양합니다.

다음 날에는 섭씨 42도의 수조에 접시를 30분 동안 띄워 단백질 발현을 유도하는 열 충격. 30분 후 24웰 플레이트를 섭씨 28도의 인큐베이터로 되돌립니다. 단백질 발현은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 이후에 확인됩니다.

유전자 유도 세포 사멸을 검사하려면 먼저 앞서 설명한 대로 Sf9 세포를 준비합니다. 다음으로, 이전과 동일한 방식으로 세포를 transfection하되, 각 transfection 반응에 apoptosis inducer 유전자를 함유한 플라스미드 1마이크로그램을 포함시킵니다. 섭씨 28도에서 5시간 동안 배양하고 배지를 교체하고 16시간 동안 배양합니다.

형질주입된 세포를 섭씨 42도에서 30분 동안 열충격을 가합니다. 세포 생존율 분석을 수행하기 전에 섭씨 28도에서 5시간 동안 세포를 배양합니다. 화학적 유도 세포 사멸의 경우, 6개의 Sf9 세포에 대해 10배의 플레이트를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.

실온에서 15분 동안 그대로 둔 다음 배지를 1ml의 도금 매체로 교체하십시오. 각 플라스미드 DNA 4마이크로그램으로 세포를 transfection합니다. 5시간 후, 도금 배지를 1ml의 세포 배양 배지로 교체하고 섭씨 28도에서 16시간 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 섭씨 42도에서 30분 동안 열 충격을 줍니다. 열 충격 후 5시간 동안 섭씨 28도에서 세포를 배양합니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 actinomycin D로 처리하여 세포사멸을 유도합니다.

세포 생존율 분석을 수행하기 전에 섭씨 28도에서 16시간 동안 배양합니다. 처리된 세포를 세척하여 이 절차를 시작합니다. 각 웰에서 매체를 제거하고 PBS 1ml를 첨가한 다음 1분 동안 그대로 둡니다.

이런 식으로 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 04%트리판 블루를 함유한 PBS 1ml로 각 웰의 세포를 재현탁시키고 실온에서 3분 동안 염색합니다. 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

트리판 블루 염색 세포 현탁액 10마이크로리터를 혈구계로 옮기고 광학 현미경으로 생존 가능한 온전한 세포를 계수합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 통계 분석을 수행합니다. Lymantria xylina MNPV에서 유래한 IAP3의 전체 길이와 두 번의 절단은 Sf9 세포에서 과발현되었으며, 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 용해물에 웨스턴 블롯을 수행했습니다.

항세포사멸 단백질인 Ac-P35는 양성 대조군으로 포함되었습니다. 모든 단백질은 열 쇼크 후 1시간 또는 5시간에 형질 주입된 세포에서 검출될 수 있으며, 5시간에서 더 높은 발현을 보입니다. 이 시스템은 항세포사멸 활성을 평가하도록 조정할 수 있습니다.

유전자 유도 세포 사멸의 경우, 세포사멸 유도제인 Drosophila Reaper를 표적 유전자 플라스미드 구조체와 함께 Sf9 세포에 동시 형질 주입한 후, 열 충격을 가하여 유전자 발현을 활성화했습니다. Drosophila Reaper 벡터와 비교하여 양성 대조군은 생존율의 최대 80%에 도달하는 높은 항세포사멸 활성을 보였습니다. 다른 구성물은 항-세포사멸 활성에 대한 다양한 효과를 보여주었습니다.

화학적 유도 세포 사멸의 경우, 단 하나의 구조체만 Sf9 세포에 transfection하고 악티노마이신 D를 열 충격 후 5시간 후에 첨가했습니다. 양성 대조군 또는 음성 대조군과 비교하여, 다른 구성물은 항-세포사멸 활성에 다양한 효과를 보였다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 2-3일 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 층류에서 세포 배양의 작동 규칙을 준수하고 세포의 상태를 부지런히 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 곤충 세포에서 동시 발현된 두 단백질 사이에 상호 작용이 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 동시 면역침전법(co-immunoprecipitation)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생명 공학 분야의 연구자들이 동물 또는 미생물의 단백질 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이 시스템을 사용하여 외부 단백질을 발현하거나 곤충 세포에서 잠재적으로 기능적으로 길항하는 단백질을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 악티노마이신 D와 같은 일부 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.