Name: 과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 학습하세요 열충격 유도 단백질 발현 시스템을 사용하여 Sf9 곤충 세포에서 외래 단백질의 항세포사멸 활성을 평가하는 방법을. 이 기술은 생명공학 및 단백질체 연구에서 단백질 기능과 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 박사 지 앤 Horng 레이 연구소의 해양 생물학과, 국립 대만 해양 대학 3 플라스 미드 구조물을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구에 의해 그랜트 106-2311-B-197-001-과학의 부 및 기술 (대부분)에서 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>곤충 세포 배양<ol>
<li>세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL. 참고: 사용 하기 전에 물 욕조에 30 분 동안 65 ° C에서 소 태아 혈 청을 열.</li>
		<li>Spodoptera frugiperda 를 유지 (나비목: Noctuidae), sf9 곤충 세포. 분리 ca. 25 cm2 셀 문화 플라스 크에서 세포의 80%는 플라스 크를 흔들어 하 고 가벼운 현미경 검사 법에서 확인. 다음, 새로운 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액의 50%를 전송 하 고 실 온에서 15 분 동안 연결할 셀을 허용. 5 mL 신선한 세포 배양 매체와 매체를 대체 하 고 28 ° c.에 인큐베이터에서 성장 통로 세포 세포 성장에 따라 2 ~ 3 일 마다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 transfection 플라스 미드의 준비<ol>
<li>삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 유전자와 그것의 삭제 구조) pDHsp/V5-그의 PCR 기반 복제 방법11. 확인 식민지에 의해 변형 된 식민지의 성장을 PCR PCR 마스터 믹스 (X 2) pDhsp-f 2/Op-IE2R 뇌관을 사용 하 여 설정 합니다. 상업적인 시퀀싱 서비스 여 플라스 미드 시퀀스를 확인 합니다. 참고: 표 1 뇌관 PCR 및 해당 구문 사용을 보여 줍니다.</li>
		<li>문화 단일 시퀀스 세균성 식민지, 200 mL 파운드 매체 포함 하에서 상기 플라스 미드 구조물 (1.2 단계)를 포함 하는 항생제 (50 µ g/mL), 각각 선택 합니다.</li>
		<li>제조 업체의 지침12에 따라 미디 플라스 미드 키트를 사용 하 여 교양된 대장균 에서 플라스 미드를 추출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 매체와 8.5 mL 혈 청 무료 세포 배양 매체의 1.5 mL를 혼합 하 여 도금 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>악티노마이신 D (ActD) 세포 배양 세포 배양 매체의 10 mL로 ActD 주식 (1 mg/mL)의 1.5 µ L을 추가 하 여 준비 (최종 농도 = 150 ng/mL). 4 ° c.에 게</li>
</ol>2. 단백질 과도 식
<ol><li>시드 셀<ol>
<li>Sf9 셀 문화 플라스 크를 흔들어 수확, 전복 그리고 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에가 P10 피펫으로 여 hemocytometer를 10 µ L를 전송. 가벼운 현미경 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 24-잘 접시에 각 음에 3 × 105 sf9 세포를 플레이트. 중 도금의 0.5 mL에 매체를 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드의 transfection<ol>
<li>희석 세포 transfection 시 약: 100 µ L 세럼 무료 세포 배양 매체에 혼합 1 vortexing에 의해 세포 transfection 시 약의 희석 8 µ L s.</li>
		<li>혈 청 무료 세포 배양 매체와 혼합의 100 µ L에 플라스 미드 DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의)의 2 µ g 1에 대 한 vortexing에 의해 추가 (그림 2).</li>
		<li>희석된 플라스 미드 DNA 및 희석된 세포 transfection 시 약 (210 µ L), 결합 하 고 실 온에서 30 분 동안 1 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.</li>
		<li>P1000 피 펫에 의해 셀에 dropwise DNA transfection 시 혼합물의 210 µ L를 추가 합니다. 28 ° C 5 h에서 품 어.</li>
		<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 세포 배양 매체의 0.5 mL에 도금 매체를 바꿉니다. 24-잘 접시 테이프로 밀봉 하 고 셀을 16 h 28 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 충격 transfected 세포: (물 표면에 떠 있는) 42 ° C 물 욕조에 접시를 넣어. 30 분 동안 열 고 28 ℃ 배양 기에 24-잘 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>단백질 발현의 탐지<ol>
<li>1 h 5 h 열 충격 후, 셀 1 x PBS 버퍼의 0.5 mL을 짧게 세 번 씻어. 참고: 9 mL 소독 ddH2O 10 x PBS 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 PBS 버퍼 PBS 버퍼 x 1 배 희석</li>
		<li>아래로 pipetting으로 SDS 로드 염료 x 1의 40 µ L로 세포를 lyse. 참고: PBS 버퍼 x 1의 30 µ L SDS 샘플 버퍼 x 4의 10 µ L를 혼합 하 여 SDS 로드 염료 x 4를 희석.</li>
		<li>10 분 열 블록에 98 ° C에서 단백질 견본을가 열 하 고 1 분 동안 스핀 다운 서쪽 오 점 분석 결과 대 한 얼음에 넣어.</li>
		<li>서쪽 오 점 분석 결과 Eslami 및 Lujan13에서 서쪽 오 점 분석 결과의 절차를 따릅니다. SDS 페이지 젤14실행: Coomassie 파란 얼룩 (각 로드 단백질 견본의 수량 잘 같은 금액은 확인 하기 위한 로딩 제어)를 받게 한 젤과 다른 서쪽에 들어서는 오 점 분석 결과, Eslami와 Lujan13 .</li>
		<li>토끼 안티-v 5 항 체 (5 mg/mL) (1: 5000 희석 농도 1 µ g/mL 작업 TBST 버퍼에서)와 염소-토끼 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 공액 (0.8 mg/mL) (1:10000 희석 작업 TBST 버퍼에서 V5 태그 융해 단백질 검출 농도 0.08 µ g/mL)입니다. 참고: Polyacrylamide 17.5%의 비율을 조정 하면 될 단백질 분자량 < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 안티-apoptotic 활동 분석 결과
<ol><li>유전자 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 공동 1 µ g의 플라스 미드 DNA와 pDHsp/D-rpr/플래그-그의 플라스 미드 DNA (포함 apoptosis 유도 유전자)의 1 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격 치료, 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)을 수행 합니다.</li>
	<li>화학 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 2.1.2 단계에서 6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀 sf9 플레이트. 플라스 미드 DNA의 4 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격에 16 h ActD 세포 배양 매체의 2 mL와 sf9 세포를 치료 하 고 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)를 수행 합니다. 참고: 6 잘 플레이트의 한 잘 커버를 최소 볼륨 1 mL 이다.</li>
	<li>위의 안티 apoptotic 활동 분석 결과 실험, 3.1과 3.2 triplicates에 포함을 수행 합니다.</li>
</ol>4. 세포 생존 능력 분석 실험
<ol><li>3 시간 1 분 1 x PBS 버퍼의 1 mL를 추가 하 여 치료 세포를 씻어. Pipetting 1 mL 1 x PBS 버퍼 0.04 %trypan 파랑을 포함 하 여 셀을 resuspend 하 고 실내 온도에 3 분 동안 얼룩. 세포 현 탁 액 1.5 mL microtube 전송할. 참고: 1 x PBS 버퍼 및 1 mL 0.4 %trypan 블루 솔루션의 9 mL를 혼합 하 여 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.</li>
	<li>P10 피 펫과 hemocytometer를 10 µ L trypan 블루 스테인드 세포 현 탁 액을 전송 하 고 가벼운 현미경 가능한 그대로 셀.</li>
	<li>통계 분석<ol>
<li>기록 된 데이터를 계산 하 고 모든 계산에 대 한 의미 ± 사 우 스 다코타 존재.</li>
		<li>Microsoft Excel과 학생의 두 꼬리 t-검정에 의해를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. P로 통계적으로 중요 한 데이터를 정의-값 < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 19948에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀10높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedrovirus (NPV)의 단백질 기능 분석에 대 한 적용 IAP 단백질9,11. 6 플라스 미드 구조물의 총이이 프로토콜에서 사용한: 3 (pDHsp/V5-그의 pDHsp/Ac-p35/V5-그의 그리고 pDHsp/D-rpr/플래그-그의) 지 앤 Horng 레이<sup class="x...

두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)1. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids2baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스3되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자4등으로 분류 될 수 있습니다.
매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동안 운전 하는 데 사용 되었다 BEVSs 지정 되었다. 재조합 잠재 하 여 곤충 세포에서 외국 단백질의 표정은 포유류 단백질 (당단백질 생산에 적합 한) 포스트 번역 상 수정에서의 비슷합니다. 따라서,는 잠재 널리5,,67되었습니다. 그러나, 한 가지 한계 곤충 세포7다른 N glycosylation 통로의 존재입니다.
따라서, 새로운 잠재 식 시스템, 변이 유전자 표현 시스템 개발 되었다. 이 시스템은 곤충 세포에서 baculoviral 즉시 초기 발기인 (발기인즉-1 )의 드라이브에서 외국 유전자를 표현합니다. 이 시스템을 사용 하 여 대상 단백질 표현할 수 있습니다 즉시 즉-1 발기인의 통제에 곤충 세포에서 N glycosylation 통로 더 나은 N 연결 oligosaccharides7에 결과 수정 하는 동안. 또한, baculoviral 즉시 이른 유전자 호스트 세포 RNA 중 합 효소 II에 의해 복사할 수 있습니다 그리고 어떤 바이러스 성 요인 활성화4에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 외국 단백질 곤충 세포는 짧은 시간 내에 표현할 수 있습니다. 날짜 하려면, 과도 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 잠재 또는 외국 단백질의 기능을 분석 하는 시스템을 적용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 변이 유전자 표정 시스템 중 하나는 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 및 OpIE1 발기인)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인을 기반으로 합니다.
그러나, 곤충 세포에서 외국 유전자의 식 저수준은 여전히 문제가 OpIE 과도 유전자 발기인 기반 식 시스템은 사용된8,,910. 따라서, 다른 변이 유전자 표현 시스템 초파리 열 충격 단백질 70 (hsp70) 유전자8,9발기인에 따라 건설 되었다. H s p 70의 발기인 baculoviral IE 발기인 곤충 세포10열 충격에 의해 유도 된 때 보다 더 효율적으로 작동 합니다. 이 시스템에서 대상 유전자는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 드라이브에서 표현 되었다. 외국 유전자 PCR 기반 복제 방법으로 일시적인 유전자 식 플라스 미드에 쉽게 복제 수 있습니다. 또한, 열 충격 유도 의해 유전자 발현에 대 한 타이밍의 제어를 수행할 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 접근 따르고 (apoptosis 3의 억제 물, iap3 Lymantria xylina MNPV에서에서) baculoviral 유전자의 3 개의 다른 잘림 열 충격에 기초를 둔 일시적인 단백질 식 시스템을 사용 하 여 표현 하 고 추가 안티-apoptotic 활동 분석에이 표현한 단백질을 적용 합니다. 이 시스템 수 중 외국 단백질 신속 하 게 또는 또한 다른 단백질 활동 분석 실험에 적용할 가능성을 하면서 sf9 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동의 평가에 적용할 추가.

<table><tbody><tr><td>곤충 세포 배양을 위한</td> <td>항생제-항진균제, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td></tr><tr><td>인증된 소 태아 혈청</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>무혈청 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>반전광 현미경 WHITED</td><td></td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT 유능한 세포</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>LB Broth (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>한천, 세균 등급</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>선택 항생제</td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스 (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL 원심분리기 튜브</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 mL 튜브</td></tr><tr><td>혈구분석기</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>Cellfectin II 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>cell transfectin 시약</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate-Buffered 식염수 (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4회; SDS 로딩 염료</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF 블로팅 멤브레인)</td><td>Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF 멤브레인</td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 셀 시스템</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>블로팅 장치</td></tr><tr><td>Ponceau S 솔루션</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>rabbit anti-V5 항체</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG-horseradish peroxidase (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0.4 % trypan blue solution</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>테이프</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 웰 테이프 ( 19 mm&times; 36 M)</td></tr></tbody></table>

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.

전체 길이 LyxyMNPV에서 Ly-IAP3의 다른 두 잘림 (BIR 및 도메인) 했다 overexpressed sf9 셀에는 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 기반 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템. pDHsp/V5-그의 초파리 열 충격 단백질 발기인, 셀룰러 transcriptional 요인과 번역 시스템 (그림 1)8 를 사용 하 여 다운스트림 유전자 발현 온도 42 ° C 조건에서 드라이브 포함 9,11. 전체 기술 흐름도 그림 2에 표시 됩니다. 1 h 5 h 열 충격 후, 세포 단백질 견본 버퍼와 lysed 되었고 서쪽 오...

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

이 열 충격 유도 단백질 발현 시스템의 전반적인 목표는 곤충 세포에서 잠재적으로 기능적으로 길항하는 두 단백질에서 단백질 항 세포사멸 활성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 생명공학 및 단백질체학에서 후보 단백질의 기능 및 활성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 항세포사멸 활성 및 단백질 상호 작용과 같은 단백질의 기능에 대한 답변이 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 타이밍이 열 충격 유도에 의해 제어된다는 것입니다.따라서 이 방법은 단백질 기능 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 포유류 단백질 발현과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 Spodoptera frugiperda 또는 Sf9 곤충 세포는 섭씨 28도의 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크에서 세포 배양 배지에서 성장합니다.세포 배양 플라스크를 흔들어 플라스크에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 세포의 약 80%가 분리되었는지 확인합니다. 세포 현탁액의 50%를 새로운 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮기고 세포를 실온에서 15분 동안 부착합니다.15분 후, 배지를 5ml의 신선한 배양 배지로 교체하고 섭씨 28도의 인큐베이터에서 자랍니다. 세포 성장에 따라 2-3일마다 세포를 통과시킵니다. Sf9 세포를 채취하기 전에 박테리아 또는 기타 미생물에 의한 오염이 없는지 광학 현미경으로 세포를 확인하는 것이 중요합니다.Sf9 세포를 채취하려면 배양 플라스크를 흔들어 세포를 분리한 다음 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. P10 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 세포 현탁액을 혈구계로 옮기고 광학 현미경으로 세포 수를 계수합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 10-5번째 셀을 3회 플레이트하고 15분 동안 실온에 둡니다.15분 후 배지를 0.5ml의 도금 매체로 교체하십시오. 세포 transfection regent를 준비합니다. 각 transfection에 대해 8μl의 cell transfection 시약을 100μl의 무혈청 세포 배양 배지로 희석하고 1초 동안 와류로 혼합합니다.본 연구에서는 초파리 열쇼크 70 프로모터, 전장 IAP3, RING 도메인이 없는 절단, BIR 도메인이 없는 절단의 제어 하에 세포사멸 3 억제제인 Baculoviral 유전자의 세 가지 절단이 발현됩니다. 각 플라스미드 DNA 2마이크로그램을 100마이크로리터의 무혈청 세포 배양 배지에 첨가하고 1초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다. 포지티브 컨트롤도 준비합니다.희석된 plasmid DNA와 희석된 세포 transfection 시약을 결합하고 vortexing으로 혼합합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. P1000 피펫을 사용하여 각 DNA transfection 시약 혼합물 210마이크로리터를 세포에 적가합니다.섭씨 28도에서 5시간 동안 배양합니다. 5시간 후 도금 배지를 0.5ml의 세포 배양 배지로 교체한 다음 24웰 플레이트를 테이프로 밀봉합니다. 28도에서 배양합니다.다음 날에는 섭씨 42도의 수조에 접시를 30분 동안 띄워 단백질 발현을 유도하는 열 충격. 30분 후 24웰 플레이트를 섭씨 28도의 인큐베이터로 되돌립니다. 단백질 발현은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 이후에 확인됩니다.유전자 유도 세포 사멸을 검사하려면 먼저 앞서 설명한 대로 Sf9 세포를 준비합니다. 다음으로, 이전과 동일한 방식으로 세포를 transfection하되, 각 transfection 반응에 apoptosis inducer 유전자를 함유한 플라스미드 1마이크로그램을 포함시킵니다. 섭씨 28도에서 5시간 동안 배양하고 배지를 교체하고 16시간 동안 배양합니다.형질주입된 세포를 섭씨 42도에서 30분 동안 열충격을 가합니다. 세포 생존율 분석을 수행하기 전에 섭씨 28도에서 5시간 동안 세포를 배양합니다. 화학적 유도 세포 사멸의 경우, 6개의 Sf9 세포에 대해 10배의 플레이트를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다.실온에서 15분 동안 그대로 둔 다음 배지를 1ml의 도금 매체로 교체하십시오. 각 플라스미드 DNA 4마이크로그램으로 세포를 transfection합니다. 5시간 후, 도금 배지를 1ml의 세포 배양 배지로 교체하고 섭씨 28도에서 16시간 동안 세포를 배양합니다.그런 다음 섭씨 42도에서 30분 동안 열 충격을 줍니다. 열 충격 후 5시간 동안 섭씨 28도에서 세포를 배양합니다. 그런 다음 형질주입된 세포를 actinomycin D로 처리하여 세포사멸을 유도합니다.세포 생존율 분석을 수행하기 전에 섭씨 28도에서 16시간 동안 배양합니다. 처리된 세포를 세척하여 이 절차를 시작합니다. 각 웰에서 매체를 제거하고 PBS 1ml를 첨가한 다음 1분 동안 그대로 둡니다.이런 식으로 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 04%트리판 블루를 함유한 PBS 1ml로 각 웰의 세포를 재현탁시키고 실온에서 3분 동안 염색합니다. 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.트리판 블루 염색 세포 현탁액 10마이크로리터를 혈구계로 옮기고 광학 현미경으로 생존 가능한 온전한 세포를 계수합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 통계 분석을 수행합니다. Lymantria xylina MNPV에서 유래한 IAP3의 전체 길이와 두 번의 절단은 Sf9 세포에서 과발현되었으며, 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 용해물에 웨스턴 블롯을 수행했습니다.항세포사멸 단백질인 Ac-P35는 양성 대조군으로 포함되었습니다. 모든 단백질은 열 쇼크 후 1시간 또는 5시간에 형질 주입된 세포에서 검출될 수 있으며, 5시간에서 더 높은 발현을 보입니다. 이 시스템은 항세포사멸 활성을 평가하도록 조정할 수 있습니다.유전자 유도 세포 사멸의 경우, 세포사멸 유도제인 Drosophila Reaper를 표적 유전자 플라스미드 구조체와 함께 Sf9 세포에 동시 형질 주입한 후, 열 충격을 가하여 유전자 발현을 활성화했습니다. Drosophila Reaper 벡터와 비교하여 양성 대조군은 생존율의 최대 80%에 도달하는 높은 항세포사멸 활성을 보였습니다. 다른 구성물은 항-세포사멸 활성에 대한 다양한 효과를 보여주었습니다.화학적 유도 세포 사멸의 경우, 단 하나의 구조체만 Sf9 세포에 transfection하고 악티노마이신 D를 열 충격 후 5시간 후에 첨가했습니다. 양성 대조군 또는 음성 대조군과 비교하여, 다른 구성물은 항-세포사멸 활성에 다양한 효과를 보였다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 2-3일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 층류에서 세포 배양의 작동 규칙을 준수하고 세포의 상태를 부지런히 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 곤충 세포에서 동시 발현된 두 단백질 사이에 상호 작용이 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 동시 면역침전법(co-immunoprecipitation)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생명 공학 분야의 연구자들이 동물 또는 미생물의 단백질 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 이 시스템을 사용하여 외부 단백질을 발현하거나 곤충 세포에서 잠재적으로 기능적으로 길항하는 단백질을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 악티노마이신 D와 같은 일부 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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연구

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유전학

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과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

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