Name: 외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 학습하세요 외인항원 십자가-프레젠테이션에서 ERAD 유사 분해가 일어나는 막 구획 정화 방법을. 이 기술은 수지상 세포 및 다른 항원제시 세포에서 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가 biotin 단백질 라벨을 사용 하 여 <ol><li>준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 &#39; s 프로토콜. 
	참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균.</li>
	<li>성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습도 인큐베이터에서 % CO 2 (이 언급 없이 세포는 인 큐베이 팅이 조건에서). 그것은 또한 DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 대신 NaHCO 3 (여기서 부터는 DMEM) 3.7 g/L 보충을 사용 하 여.</li>
	<li>주 정화, 전에 분할 RPMI의 셀 사용 하 여 조직 문화 접시에 1 x 10 5 셀/ml. Confluent 상태에서 세포를 유지 하지 마십시오. DC2.4 셀 매우 반 confluent 상태로까지 외 인 항 원을 통합할 수 있지만 빠르게 오버 합칠 상태에 도달 후 능력을 잃고.</li>
	<li>DC2.4 전에 세포는 반 confluent 1 x 10 6 셀/ml bOVA의 250 µ g/mL을 추가 하 고 2-4 헤에 대 한 품 어 
	참고: 다운스트림 실험 동안 모든 버퍼 및 시 약 보관 4 ° C에서 달리 명시 하지 않는 한.</li>
</ol> 2. Microsomes의 준비 <ol><li>새 50 mL 원뿔 관으로 조직 접시에서 부드러운 pipetting으로 DC2.4 세포를 수확.</li>
	<li>5 분, 4 ° C 1000 x g에서 원심 분리기와 포부에 의해 bOVA와 매체를 조심 스럽게 제거.</li>
	<li>DC2.4 셀 1000 x g 5 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 PBS 버퍼 (1.37 m m NaCl, 8.1 m 나 2 HPO 4, 2.68 m KCl, 1.47 m m KH 2 포 4 m m)의 40 mL로 두 번 세척 하 고 상쾌한 포부에 의해 때마다 삭제.</li>
	<li>Resuspend 단계 2.3에서 1-2에서에서 펠 릿 mL (문화 매체의 1/20-1/10 볼륨) 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전송 resuspended DC2.4의 1/1000 양으로 균질 매체 (0.25 M 자당, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4])의 세포에 얼음 처럼 차가운 Dounce 균질 화기.</li>
	<li>차가운 Dounce 균질 화기와 10-20 스트로크에 의해 resuspended DC2.4 세포를 부드럽게 중단. 
	참고: 중단 단계 동안 Dounce 균질 화기는 냉각 얼음에</li>
	<li>새 15 mL 원뿔 튜브 셀 중단 중지 전송.</li>
	<li>10 ml 총 8-9 mL 균질 매체를 추가 하 고 원뿔 튜브 2000 g x 4에서 10 분 원심 ° c.</li>
	<li>새 15 mL 원뿔 튜브 손상 되지 않은 세포와 핵, 제거 하는 상쾌한 전송 및 2000 g x 4에서 10 분 동안 다시 원뿔 튜브 원심 ° c.</li>
	<li>새로운 ultracentrifugation 튜브와 g x 100000 및 4에서 45 분 동안 원심 분리기에는 상쾌한 전송 ° c.</li>
	<li>는 상쾌한 발음 하 고 다운스트림 실험 microsome 분수를 만들기 위해 여러 번 위아래 솔루션 pipetting으로 펠 릿 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 균질 매체의 1-2 mL에 신중 하 게 resuspend.</li>
	<li>새 5 mL 둥근 바닥 관으로 microsome 분수 전송. 
	참고:이 단계 후에 그것은 제조 업체에 따르면 iodixanol 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 객관적인 microsomes을 풍부 하 게 &#39; s 프로토콜, 일반적인 microsomes를 제거 하려면. 외 인 항 원에 대 한 피크 분수 및 수집한 다음 정화 (3 단계)의 다음 단계로 들어서는.</li>
</ol> 3. BOVA와 Microsomes의 정화를 받고 ERAD microsome 분수의 단계 2.11 5 mL <ol><li>신선한의 추가 1/100 볼륨 SA 자석 구슬 원형 하단 튜브. 
	참고:이 단계를 하기 전에 그것은 미리 microsome 분수를 줄이기 위해 일반적인 microsomes의 오염 제어 자석 구슬에 의해 취소.</li>
	<li>부드럽게 잘 혼합 하 고 4 시 30 분 동안 천천히 라운드 하단 튜브를 회전 ° c.</li>
	<li>라운드 하단 튜브에 총 4 mL에 균질 매체의 2-3 mL를 추가 하 고 부드럽게 잘 섞어.</li>
	<li>라운드 하단 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 이후는 소포에 바인딩된 구슬 자석에 끌리는, 갈색 마이크로 구슬 점차적으로 자석에 가장 가까운 튜브 벽에 축적 됩니다.</li>
	<li>튜브와 함께 신중 하 게 언바운드 소포를 제거 하는 열망에 의해 여 supernatants를 버리고 마그네틱 스탠드에 남아.</li>
	<li>자석 구슬 자석에 의해 균질 매체의 5 mL로 두 번 소포에 바인딩된 워시 4 ° C에서 10 분 서 하 고 신중 하 게 열망 하 여는 상쾌한 때마다 삭제. 
	참고: 마그네틱 스탠드, 10 분, 2000 x g에서 centrifugations에 의해 정화 없이 4 ° C는 또한 사용할 수.</li>
	<li>자석 구슬 몇 번 위아래로 솔루션 pipetting 100 µ L 균질 매체에 신중 하 게 소포를 준수할 resuspend.</li>
	<li>다운스트림 실험에 대 한 정화 microsome로 새로운 microtube에 resuspended 소포 전송. 
	참고: 일반적으로, 1 x 10 7 셀에서 5-20 µ g 단백질을 포함 하는 50 µ L microsome 분수 고립 될 수 있다.</li>
</ol> 4. 순화 Microsomes의 분석 <ol><li>Resuspend 자석 구슬에서 소포에 바인딩된 TNE 버퍼의 100-200 µ L 3.8 단계 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 m m NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 볼륨 균질 매체 대신.</li>
	<li>는 lysate에서 전송 단계 4.1 새로운 1.5 mL microtube.</li>
	<li>제조 업체 당 BCA 분석 결과 키트를 사용 하 여 단계 4.2의 단백질 농도 결정 &#39; s 프로토콜. 
	참고: 일반적으로 5-10 µ L 단계 4.2에서에서 lysate 단백질 농도 결정 하기 위해 충분 하다.</li>
	<li>는 lysate에서 전송할 단계 (실버 얼룩에 대 한 단백질의 2 µ g 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 위한 단백질의 10 µ g) 4.2 새로운 microtubes.</li>
	<li>SDS 겔-로딩 버퍼 x 1에서 95 ° C와 종 단백질에서 열 블록에 있는 microtubes를 넣어 (100 mM Tris HCl pH 6.8, 200 m m dithiothreitol, 4 %SDS, 0.2 %bromophenol 블루, 20% 글리세롤) 5 분에 대 한</li>
	<li>21500 g x 4에서 10 분 동안 microtubes 원심 ° C. 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtubes에 있는 supernatants 수집.</li>
	<li>단계 4.6 (2 µ g) 표준 SD-페이지에서 해결된 단백질 분석.</li>
	<li>시각화 실버 얼룩은 얼룩을 사용 하 여 단백질 밴드 키트 제조 업체에 따라 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>표준 SD-페이지와 서 부 럽 4.6 (10 µ g) 단계에서 확인 된 단백질 분석. 시 약 (SA-HRP)를 사용 하 여 제조 업체 당 &#39; s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각화.</li>
</ol> 5. 생체 외에서 BOVA 사용 하 여 정화 Microsomes의 ERAD Ubiquitination의 재구성 단계 3.8 reticulocyte lysate (RL)의 50% 볼륨으로 반응 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 3mm ATP, 0.5 m m MgCl x 1에서에서 <ol><li>이전에 순화 microsomes (5-10 µ g 단백질) 2), 그리고 새로운 microtube에 플래그 태그 유비퀴틴 오후 0 시 2 분. 이 실험의 최종 볼륨은 20-40 µ L.</li>
	<li>품 37에서 2 h microtube ° C. 
	참고: 단계 5 월 12 일에서에서 ubiquitinated bOVA 양의 서쪽 blotting에 의해 감지 너무 작으면, 추가 10 µ M의 MG132 또는 proteasomes에 의해 ubiquitinated bOVA의 처리를 억제 하는 lactacystin의 2 µ M.</li>
	<li>얼음에 microtube 배치 하 여 반응을 중지</li>
	<li>는 microsomes 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 500 µ L TNE 버퍼를 추가 하 여 해결.</li>
	<li>21,50에서 10 분 원심 분리기는 microtubeg와 4 x는 0 ° c.에 생체 외에서 ubiquitination 분석 결과 전에 DC2.4에서 ubiquitinated bOVA 포함 하는 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.</li>
	<li>는 상쾌한 새로운 microtube 전송과 새로운 SA 자석 구슬 (일반적으로 5 µ L supernatants의 500 µ L에 대 한)의 1/100 볼륨 추가.</li>
	<li>부드럽게 잘 혼합 하 고 30 분 동안 천천히 microtube 4 회전 ° c.</li>
	<li>Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C. 삭제 bOVA 및 ubiquitinated bOVA 열망 하 여 상쾌한 바운드 SA 자석 구슬.</li>
	<li>TNE 버퍼의 1 mL와 함께 두 번 수집된 사 자석 구슬 21500 g x 4에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 세척 ° C. 삭제 상쾌한 포부에 의해 각 시간.</li>
	<li>SA 자성 구슬에 의해 순화 된 단백질을 해결 하기 위해 열 블록에 95 ° C에서 5 분에 대 한 버퍼를 로드 하는 SDS 젤 x 1에 SA 자석 구슬 종.</li>
	<li>Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C에 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.</li>
	<li>분석 표준 SD-페이지 및 서쪽 더 럽 히는 단백질에 준수할 SA 자석 구슬. (안티, 안티-멀티-Ub, 깃발과 반대로 마우스 IgG HRP) 항 체 및 시 약 (SA-HRP)의 사용은 제조 업체 당 &#39; s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각.</li>
</ol>

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<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endosome의 이러한 전문된 분야에서 추정 된다 ubiquitinated는 ERAD 같은 처리 마커로 bOVA. 그들의 타고 난 면역 자극 후 CP 효율은 크게 증가, 그리고 높은 밀도 분수 (게시 되지 않은 결과) ubiquitinated bOVA 함께 bOVA의 피크 분수 마이그레이션. 이러한 실험의 목표 응급실 또는 bOVA 또는 ubiquit...

MHC I 분자 cytosol1에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나2MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8+ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 3비 각자 단백질 펩 티 드.
항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가4,5,6,,78 통해 CP, 주로 수행 MHC 시 제시 의해 Dc9,,1011. CP는 필수+ T 순진한 CD8의 활성화를 위한 둘 다 세포와 CD8 메모리+ T 세포의 비활성화에 의해 안티 전염 성 및 안티-종양 Ctl12,13, 그리고 면역 관용의 유지 보수에 자기 행동 naïve T 세포14,15. 그러나 CP CP의 분자 기계 장치는 아직 자세히 설명 될 적합 한 면역 계통에 많은 중요 한 역할을 재생 합니다. CP의 이전 연구 밝혔다 exogenous 항 모두 응급실에는 endosome 현지 했다 ERAD, ERAD 같은 처리 및 펩 티 드16 로드에 대 한 응급실에 외 인 항 원은 endosome에서 이송은 제안 처리 . 그러나, 축적 증거가 나타냅니다 응급실에서 아닙니다 그러나 오히려 응급실 (그림 1)17,18의 독특한 기능을가지고 아닌 클래식 endocytic 구획 밖으로 CP의 펩 티 드 로드 수행 ,19,,2021. Aminopeptidase의 높은 활동에 의해 항 원 펩 티 드 선구자의 저하를 방지 하려면22 cytosol, 처리 및 CP에서 로드 하는 펩 티 드에이 아닌 클래식 endocytic 구획 (그림 1)의 인접 지역에서 발생 합니다. 이러한 endocytic 구획의 characterizations 논란이 있지만, 이외에 외 인 항 원이이 구획에 없는 기존 특정 분자 있다.
ERAD는 세포질 통로, 특히 응급실에서 misfolded 단백질을 제거 하는. ERAD 경로에 misfolded 단백질 retrogradely ER 막 세포질을 통해 운반 되며 유비퀴틴-프로테아좀 시스템23,,2425처리. 큰 분자, 단백질, 등 지질 bilayer를 통해 수송 된다,이 분자를 통과에 복잡 한 복잡 한 Sec61 및 Derlin ER26, 그리고 복잡 한 톰에 복잡 한 팀 같은 translocon 라는 분자 장치는 미토 콘 드리 아27 것 추가 항 ER 막 통해 수송 된다, 그들은 translocons, Sec61 복합 등으로 복잡 한 지질 bilayer를 관통 하 게 해야 합니다. 여기 설명 하는 방법을 endocytic 구획에 대 한 표식으로이 막 관통 분자를 이용 하 여 타겟된 기를 정화.
여기에 설명 된 방법은 외 인 항 원으로는 DC 같은 셀 선 DC2.428 와 biotinylated ovalbumin (bOVA)를 사용 하 여 새로운 기 정화 프로토콜입니다. Endocytic 구획 streptavidin (SA)에 의해 순화 되었다-자석 구슬 메이커로 막 관통 bOVA를 사용 하 여. 이 순화 microsome 일부 것 추가 bOVA 여전히 막 분수에 보존 되었다 하지만 microsome, 및 다음 ubiquitinated의 외부에 이송 되었고 처리29 생체 외에서. 이 순화 microsome endocytic 구획 특정 단백질 뿐만 아니라 ER-상주 단백질 ERAD 및 펩 티 드 복잡 한; 로드 포함 세포질 구획 CP29에 대 한 예비 endocytic 구획 제안. 이 프로토콜은 exogenous 항 원의 종류에 따라 그리고 다른 DC 하위 집합 및 다른 세포 유형, 대 식 세포, B 세포, 내 피 세포, 등 실력 CP에 대 한 Dc의 정확한 분자 메커니즘을 명확 하 게 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr>2<td>-메르캅토에탄올</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>페니시실린-스렙토마이신</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco by life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 단백질 라벨링 키트</td>: <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr>, <tr><td>MG-132</td>, <td>Santa Cruz, Biotechnology</td><td>, 201270</td><td></td></tr>, <tr><td>lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr>, <tr><td>Dounce homogenizer</td>, <td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td>, <td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr>, <tr><td>요오딕산올</td><td>Cosmo, bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-마그네틱 비드</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>제어 마그네틱 비드</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>실버 염색 키트</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td></td><td></td>1730714</tr><tr><td>플래그 태그가 지정된 유비퀴틴</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>항 ovalbumin (OVA, 마우스)</td><td>항체 상점</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubiquitin (마우스)</td><td>MBL</td><td>D058&마이너스; </td><td></td>3</tr><tr><td>안티 플래그(마우스)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극+ T 세포와 CD8 메모리+ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.

CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 30,31,,3233, exogenous 항의 ERAD 같은 처리에 대 ...

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

본 실험의 전반적인 목표는 교차 제시 과정에서 외래 항원의 ERAD 유사 분해가 일어나는 막 구획을 정제하는 것입니다. 이 방법은 교차 제시에서의 세포 구획이나 ERAD 유사 분해의 규명과 같이 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정제된 소포에 모든 분자 작용이 포함되어 있다는 점입니다. 이를 통해 모든 외래 항원의 ERAD 유사 분해가 가능해집니다. 따라서 이 방법은 수지상 세포에 의한 교차 제시 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 교차 제시 능력을 보이는 다른 유형의 항원 제시 세포에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 모든 비특이적 배경을 배제하는 것이 불가능하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 정제 하루 전, RPMI 버퍼가 담긴 조직 배양 플레이트에서 DC2.4 세포를 mL당 0.1 million cells로 분할합니다. 외래 항원 유입 확률을 높이기 위해 세포가 과밀 상태(confluent state)가 되지 않도록 주의하십시오. DC2.4 세포가 반-과밀 상태(semi-confluent)가 되기 전에 외래 항원으로서 비오틴화 오발부민(biotinylated ovalbumin, bOVA)을 첨가합니다. 그런 다음 2~4시간 동안 배양합니다. 조직 플레이트에서 새로운 50 mL 원추형 튜브로 세포를 조심스럽게 피펫팅하여 회수합니다. 세포를 4°C에서 1000 X G로 5분 동안 원심 분리합니다.

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

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연구

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Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

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망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화

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여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

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막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

여기에서는 쥐 대식세포 내에서 자라는 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로부터 박테리아 RNA를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 다른 세포 내 병원체 및 포유류 숙주 세포와 함께 사용할 수 있습니다.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

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