인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

이 절차의 전반적인 목표는 인간 제대혈에서 내피 전구 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 혈관 이식편의 조직 공학을 위한 자가 세포로 잠재적으로 사용하기 위해 제대혈에서 내피 전구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 아미노 분류가 필요 없이 특수 배지에서 분리 절차를 수행할 수 있다는 것입니다.

분리된 내피 전구 세포는 신생혈관화를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 보고서에서는 이러한 세포를 심혈관 질환 위험이 있는 환자를 식별하기 위한 바이오마커로 사용할 수 있다고 제안했습니다. 분리 절차를 시작하기 전에 웰당 1개의 콜라겐 용액을 2밀리리터의 갓 준비한 쥐꼬리 용액으로 6개의 웰 플레이트를 사전 코팅합니다. 섭씨 37도와 5%CO2 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 플레이트를 평형을 이룹니다.

그런 다음 약 25ml의 제대혈을 HBSS로 1:1 농도로 희석합니다. 다음으로 50ml 원뿔형 튜브에 20ml의 밀도 구배 배지 시약을 추가하고 20ml의 희석된 제대혈을 튜브 벽 아래로 조심스럽게 분배하여 배지에 혈액을 층을 이룹니다. 원심분리로 세포를 분리한 다음 플라즈마층을 조심스럽게 제거합니다.

18게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 버피 코트가 들어 있는 단핵 셀을 새 50ml 튜브에 모읍니다. 그리고 세포에 동일한 부피의 내피 기저 배지를 추가합니다. 원심분리로 세포를 씻고 얼음에 5ml의 염화암모늄 용액으로 입천장의 적혈구를 용해합니다.

가끔 흔들면서 5-10분 후에 원심분리로 세포를 수집하고 흰색 펠릿을 새로운 내피 성장 배지에 재현탁합니다. 세기 후에, 6개의 좋은 판의 각 우물에서 교원질을 흡인하고, PBS에서 우물을 3 시간 세척하십시오. 단핵 세포를 웰 농도당 배지 2밀리리터당 7번째 세포의 1배에 10배로 파종합니다.

그리고 플레이트를 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음날, 신선한 내피 성장 배지로 세포를 한 번 헹굽니다. 그런 다음 세척액을 3ml의 새로운 내피 성장 배지로 교체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

명시야 현미경을 사용하여 세포의 일일 이미지를 획득하여 내피 세포 군집의 진행 상황을 모니터링하고, 군체가 발생하는 플레이트를 표시하여 성장을 추적합니다. 내피 세포 군집의 크기가 약 3mm에 도달하면 세포 배양 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 T25 배양 플라스크에 신선한 쥐 꼬리 콜라겐 1개를 코팅합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 웰당 150마이크로리터의 0.05%Trypsin-EDTA로 세포를 2-3분 동안 수확합니다.

플레이트를 부드럽게 두드려 부착된 세포를 제거합니다. 세포가 분리되기 시작하면 즉시 2ml의 새로운 내피 성장 배지를 추가하고 단일 15ml 원추형 튜브로 세포를 당깁니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 신선한 내피 성장 배지에 재현탁시킵니다.

계수 후, 콜라겐으로 코팅된 플라스크의 세포를 5 곱하기 10으로 플라스크 밀도당 3밀리리터의 중간 농도의 5번째 세포에 파종하고 플라스크를 통로 1로 표시합니다. 그런 다음 플라스크를 인큐베이터로 다시 가져와 콜로니가 90% 포화도에 도달할 때마다 세포를 다시 파종합니다. 콜라겐 처리된 플레이트에 파종한 후, 첫 번째 콜로니 성장은 일반적으로 5일에서 9일 사이에 관찰됩니다.

군체는 계속 성장하고 배양의 초기 단계에서 방추 모양의 세포 형태를 획득하며, 이는 나중에 조약돌과 같은 형태로 진행됩니다. 각 계대에서 수확된 세포의 총 수는 배양의 총 일수와 직접적인 상관관계로 증가합니다. 웨스턴 블롯 분석은 배양된 내피 세포에 의한 CD 31 및 CD 34의 조기 발현을 보여주며, 이는 후속 계승으로 감소하는 것으로 보입니다.

그러나 혈관 내피 성장 인자 수용체 2의 발현은 첫 번째 통과 후에 관찰된 것보다 약간 낮은 발현 수준이지만 시간이 지남에 따라 유지됩니다. 주목할 점은 내피 전구 세포는 양성 대조군으로 포함될 수 있는 판막 간질 세포 용해물과 달리 중간엽 세포 마커 알파 평활근 액틴에 대해 양성이 아닙니다. 전체 분리 절차는 얻은 제대혈 단위에 따라 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

내피 성장 배지에서 단핵 세포를 분리하고 파종한 후 EPC 콜로니가 배양액에 나타나기까지 일반적으로 5일에서 9일이 걸립니다. 제안된 분리 방법은 내피 전구 세포를 배양하기 위해 특수 배지를 사용하며, 내피 마커가 있어야 하는 요건에 관한 한 유세포 분석기의 사용을 피합니다. 이 방법은 또한 짧은 시간 동안 많은 양의 내피 전구 세포를 얻을 수 있는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 인간 제대혈 단위에서 내피 전구 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간의 탯줄 혈액은 위험할 수 있으므로 폐혈액 및 세포 배양 제품의 적절한 처리를 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.