Name: 인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 인간 탯 줄 혈액에서 내피 조상 세포를 고립하는 방법을. 이 기술은 혈관 재생 연구와 심혈관 질환 바이오마커 개발에 활용됩니다.

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이 자료는 부여 번호 아래 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업 기반 CMMI 1452943 고 아칸소 대학 명예 대학에 의해. 우리 또한 아칸소 코드 혈액 은행 코드 혈액 단위를 제공 하 고 싶습니다.

이 연구 아칸소 기관 검토 위원회 (승인 번호 16-04-722) 대학교의 승인을 실시 되었다. 탯 줄 혈액 단위 구 연산 인산 포도 당 (일일) 솔루션 아칸소 코드 혈액 은행에서 수집 그리고 저장에 대 한 요구 사항을 충족 하지 않았다 단위 연구에 대 한 기증 했다. 코드 혈액 단위 했다 주위 온도에 컬렉션의 24 시간 이내 실험실에 couriered.
 1. 절연의 내 피 조상 세포 탯 줄 혈액에서 <ol><li>시 약의 준비.
	인슐린 같은 성장 인자 (IGF)의 20 ng/mL, 1 µ g/mL 의약품, 5 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (rhEGF), 22.5 µ g/mL <ol><li>준비 EGM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 내 피 기저 매체 (EBM)을 추가 하 여 보완 헤 파 린, 그리고 0.5 ng/mL 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 10 ng/mL의 재조합 인간 섬유 아 세포 성장 인자 B (rhFGF-B), 0.2 µ g/mL 날린, 2% 페니실린-스-글루타민. 0.2 µ m polyethersulfone (PES) 멤브레인 진공 필터를 사용 하 여 배양 소독.</li>
		<li>준비 쥐 나 콜라겐 솔루션 0.02 N 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL의 농도에서 꼬리. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여이 솔루션을 소독.</li>
		<li>사전 코트 6-잘 접시 준비 쥐의 2 개 mL 나 각 잘 콜라겐 솔루션 꼬리. 뿌리기 전에 5% CO 2와 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 유지 하는 인큐베이터에 배치.</li>
		<li>탯 줄 혈액으로 행 크 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1:1 농도의 약 25 mL를 희석.</li>
		<li>준비 라디오 면역 강 수 분석 결과 150 m m 염화 나트륨, 1% 트라이 톤 X-100, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 1 m m β-glycerophosphate, 0.1 %SDS, 및 50 mM Tris (pH 8.0)를 사용 하 여 (RIPA) 버퍼.</li>
	</ol></li> <li>내 피 조상 세포의 고립.
	<ol><li>따뜻한 모든 준비 물 목욕 격리 전에 37 ° C에서 유지 시 약.</li>
		<li>밀도 그라데이션 중간 시 약 20 mL 50 mL 원심 분리기 튜브 추가.</li>
		<li>신중 하 게 20 mL 튜브의 측면 벽 쪽으로 피 펫을 목표로 하 여이 레이어를 깨지 않고 밀도 그라데이션 매체를 포함 하는 원심 분리기 튜브에 희석된 코드 혈액의 레이어.</li>
		<li>에서 원심 분리기 회전자의 브레이크와 함께 실 온에서 30 분 동안 800 x g에서 centrifuging 그들의 밀도 ( 그림 1)에 따라 혈액의 구성 요소를 구분 합니다. 다른 레이어를 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>다른 셀 피 펫 팁 MNC에 도달할 수 있게 될 때까지 레이어 레이어 ( 그림 1 참조)을 방해 하지 않고 튜브에서 신중 하 게 pipetting으로 플라즈마 레이어를 제거 합니다. 제거 된 플라즈마 삭제. 
		참고: 피 펫 팁을 사용 하 여 플라즈마를 제거를 하는 동안 떠나 MNC 레이어 ( 그림 1) 장애를 줄이기 위해 위에 플라즈마의 작은 층.</li>
		<li>MNCs 18 게이지 바늘에 장착 한 주사기를 사용 하 여 포함 된 버 피 코트를 수집 하 고 신선한 원심 분리기 튜브 전송.</li>
		<li>EBM의 동일한 볼륨 수집된 MNCs. 원심 분리기를이 관에 추가 10 분 동안 500 x g 4에 ° C. 삭제는 상쾌한. 
		참고: 셀 펠 릿 나타납니다 붉은 적혈구/적혈구의 존재 때문에.</li>
		<li>붉은 혈액 세포를 lyse 염화 염화 물 해결책의 5 mL를 추가 합니다. 가끔 흔들어와 5-10 분 동안 얼음이 튜브를 품 어. 
		참고: 주의 고려 해야한다이 단계 동안에 지속 시간을 초과 하지 그것은 MNCs에 유해할 수 있다.</li>
		<li>원심 4 ° C에서 10 분 동안 500 x g에서 튜브와 삭제는 상쾌한. 적혈구 계속 되 면, 단계 단계를 반복 1.2.8 및 1.2.9 아니 붉은 색 펠 릿에서 관찰 됩니다.</li>
		<li>준비 EGM에 펠 릿을 resuspend를 사용 하는 hemocytometer는 MNCs 계산.</li>
		<li>Aspirate 쥐 꼬리를 나 콜라겐 코팅 6 잘 플레이트 (1.1.3 단계)에서 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1와 3 번 웰 스 세척.</li>
		<li>1 x 10 7에 각 잘 MNCs의 농도에 콜라겐 플레이트 EGM에 resuspended MNC 펠 렛 씨앗. 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에.</li>
		<li>후 24 h 매체를 발음 하 고 한번 EGM와 웰 스를 씻어. 각 잘을 EGM 매체의 3 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 배치.</li>
		<li>신선한 EGM 매체와 접시 7 일 동안 매일 보충. 7 일 후 변경 EGM 매체 매일.</li>
		<li>식민지 내 피 세포의 진행을 추적 하기 위해 매일 6 잘 플레이트의 이미지를 받아 밝은 분야 현미경을 사용 하 여. 식민지 그들의 성장을 위해 발생 하는 플레이트 표시. 
		참고: 그것은 일반적으로 5 ~ 9 일 문화에 식민지를 위한 걸립니다.</li>
	</ol></li> <li>내 피 조상 세포의 확장.
	<ol><li>코트 쥐와 T-25 문화 플라스 크 나 콜라겐 (50 µ g/mL) 꼬리를 37 ° C, 5% CO 2 인큐베이터 적어도 60 분 Aspirate에에서 배치 하 고 셀을 뿌리기 전에 1 x PBS와 세 번 T-25 셀 문화 플라스 크를 씻고.</li>
		<li>Trypsinize 내 피 세포 식민지 각 우물에서 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 150 µ L를 사용 하 여 크기 약 3 m m를 도달할 때. 6 잘 플레이트 37 ° C, 5% CO 2 배양 기 2-3 분에 대 한 다시 넣습니다</li>
		<li>는 부드럽게 연결 된 셀을 꺼내 려 6 잘 플레이트를 누릅니다. 즉시 EGM의 2 개 mL를 추가 하 고 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 복구.</li>
		<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 초기 시드 밀도 계산.</li>
		<li>스핀 15 mL 원심 분리기 튜브 5 분에 대 한 400 x g에서 EGM에 셀 펠 릿 Resuspend 고 ~ 500000 셀 T-25 플라스 크를 시드합니다. 통로 1이 술병을 표시 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 다시 T-25 플라스 크를 배치. 
		참고: 셀은 EBM과 DMEM EGM와 성장 비교에서 도금 될 수 있다.</li>
		<li>추가 구절에 대 한 플라스 크에 도달 하면 90% 합류, 단계 1.3.1-1.3.5 고 T-75 또는 T-175 셀 문화 플라스 크에 10 4 셀/c m 2에서 셀을 다시 시드합니다. 고립 된 세포 (2 단계와 3 단계)의 특성을.</li>
	</ol></li></ol> 2. 격리 된 셀 사용 하 여 서 부 럽의 격리 된 셀 특성 확장 단계를 따라 모든 통로에 <ol><li>추가 50-100 µ L의 세포의 용 해 버퍼. 약 500000 이상의 세포에서 단백질을 수집.</li>
	<li>세포 파열 풀어 단백질을 적극적으로 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 수집 하 고 전송 버퍼 microcentrifuge 튜브.</li>
	<li>500 x g에서 microcentrifuge 튜브를 회전 하 고 신중 하 게 새로운 microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송. 레이블 및 장기 저장을 위한-80 ° C에서 튜브를 저장.</li>
	<li>어느 브래드 퍼 드를 사용 하 여 각 튜브에 있는 단백질의 양을 계량 &#39; s 또는 BCA 시험 27 , , 28 29.</li>
	<li>서양 blotting 표준 절차 27 , , 28 29를 사용 하 여 수행 합니다. 5 µ g CD31, CD34, VEGFR2, 및 α-SMA의 표현에 대 한 총 단백질의 분석. 데이터 정규화에 대 한 α-tubulin 사용.</li>
</ol> 3. 간접 면역 형광 <ol><li>Sonicate 50% 에탄올에서 18 m m 유리 coverslips 고 그들을 건조. 두고 깨끗 한 coverslips biosafety 두건에서 하룻밤 12-잘 접시에 UV 빛에 그들을 소독.</li>
	<li>코트 50 & # 18와 coverslips1; g/mL의 쥐 나 콜라겐 꼬리 및 접시를 37 ℃, 5% CO 2 배양 기 적어도 60 분에 대 한 전송</li>
	<li>는 콜라겐을 발음 하 고 씻고는 coverslips 12-잘 접시에 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다. 1 x PBS를 발음 하 고 두 번 반복.</li>
	<li>씨앗 250000 경작에 각 잘 37 ° C, 5% CO 2 배양 기 immunostaining를 수행 하기 전에 적어도 3 일 동안 다시 Epc.</li>
	<li>세척 3 번 1 x PBS 가진 접시. 각 우물에 얼음 처럼 차가운 메탄올의 1 mL을 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>Immunostaining 표준 프로토콜 27 , , 28 29를 사용 하 여 수행 합니다. 그들의 적절 한 희석에 항 체를 사용 하 여 (예를 들어, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100), 및 VEGFR2 (1:50)).</li>
	<li>Epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained coverslips의 이미지.</li>
</ol>

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</ol>

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앞에서 설명 했 듯이, 점착 Epc 조약돌 형태를가지고 있습니다. 우리의 절연된 MNCs 진행 스핀 들 모양의 셀 식민지 (그림 2A 2D)에서 초기 단계에 조약돌 식민지 (그림 2E-2 층) 문화에 10 일의 기간 동안. Epc는으로 분류 되었습니다 다른 연구 그룹에 의해 다르게 즉 늦은 내 피 조상 세포10, 셀5또는 내 피 조상 세포12형성 내 피 식민지. 이 세포는 기능적으로 동일 및 유사한 세포 표면 마커 익스프레스 주목 한다. 기간 문화 (그림 3) 거의 108 셀 이전 게시에 유사한과 Epc3,</su...

여러 조사 특성 및 인간의 Epc5,,1011,,1213의 잠재력을 공부 했다. Epc 세포 저 산소 증, 허 혈, 부상, 또는 종양 형성의 사이트에 내 피 조직에 고착 하 고 새로운 혈관 구조4,14의 형성에 기여 하는 능력을가지고 순환 이라고 할 수 있습니다. 출생 후 vasculogenesis의 형태로 neovascularization에 그들의 관찰된 관련 이상 이러한 세포의 치료 응용 프로그램4,15, 에 그들의 사용에 대 한 이해를 주도하 고 있다 16. 개인의 Epc 수 심장 혈관 병 리9,15,,1617,18,19와 상관을 보였다 ,20. 다른 연구는 Epc 밸브 구와 같은 표현 형으로 분화 또한 있고이 세포 조직 공학 심장 밸브7,21사용할 수 제안.
Epc를 분리 하는 데 필요한 특정 세포 표면 분자는 하지 명확 하 게 확인 되었습니다 조사4사이 불일치 때문에. 다양 한 문화 조건에 노출 특정 매트릭스 MNCs의 접착 여러 그룹1,17,,2223, putative Epc 수 있습니다 제안에 의해 수행 되었습니다. 다른 phenotypic 속성을 표시 합니다. 이러한 속성에는 phagocytotic, Matrigel에 관 형성 능력과 Dil acetylated 저밀도 지 단백질의 이해의 부족 포함 됩니다. 높은 clonogenic 및 증식 잠재력 어떤 Epc hierarchized5수 하는 두 개의 속성이 있습니다. Epc 또한 생체 외에서 tubules 때 인간의 태아 폐 섬유 아 세포4cocultured를 형성할 수 있습니다. 이 세포는 내 피 세포 표면 마커를 표현 하 고 조 혈 마커13,,2425의 일부를 공유 하 알려져 있습니다. 긍정적으로 표현된 마커를 형질 Epc에 대 한 널리 받아들여진다는 CD31, CD34, 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 2 (VEGFR2), 폰 Willebrand 인자 (vWF), CD133, c-Kit 및 혈관 내 피 cadherin (VE-cadherin)4 , 18. 공동 CD90, CD45, CD14, CD115, 또는 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 표현 하는 세포 phagocytose 박테리아와 드 노 보 인간을 형성 하는 무 능력을 그들의 한정 된 증식 잠재력, 능력 때문에 Epc 수로 간주 되지 않습니다 선박 vivo에서4,7. 이 문서는 수정 된 프로토콜 프로토콜 정렬 셀에 대 한 필요 없이 인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립에 대 한 설명. 이 문서에 대 한 CD31, CD34, 및 VEGFR2 부정적인 지표로 α-SMA와 긍정적인 마커로 사용 우리.
이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 셀을 사용 하 여 정렬 없이 탯 줄 혈액에서 내 피 뿌리 세포를 배양 하는 방법 전문 성장 요인 (EGM) 보충 하는 내 피 성장 매체 제안 합니다. 이 EGM이 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF), 생존, 확산, 그리고 내 피 세포26의 마이그레이션 향상 포함 되어 있습니다. 그것은 또한 포함 하는 셀;의 조약돌 형태를 유지 하는 의약품 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 신생 및 철새 기능; 그리고 헤 파 린,26의 중간 성장 요인의 향상 된 장기 안정성을 하면. 내 피 세포 배양에 추가 다른 성장 인자 자극 세포 증식 및 분화, EGF26 하 셀 sensitizes 날린 데 도움이 표 피 성장 인자 (EGF)와 보완을 포함 . 우리는이 특정 성장 매체를 사용 하 여 내 피 기저 매체 (EBM) 또는 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)에 비해 Epc의 높은 숫자를 생성 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>A) 격리 및 배양을 위해</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td> 이 제품은 내피 성장 매체 태아 소 혈청 Thermofisher Scientific 26140079 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td>를 만드는 데 필요한 모든 성장 인자가 포함되어 있습니다. <td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>줄기세포 기술</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충액 식염수</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>랫 테일 I 콜라겐</td><td>코닝</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>B) 항체 및 세포 용해물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1:250 희석&nbsp; 웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 희석용 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>&알파;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>1:100 희석용 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>&알파;-튜불린</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>1:2,500 웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td>희석 VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>1:100 희석 for Western blotting</td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cell lysate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>밸브 간질 세포 용해물</td><td></td><td></td><td>자체 실험실에서 배양하고 RIPA 완충액으로 용해된 1차 세포주</td></tr><tr><td>C) 웨스턴 블로팅 및 면역 염색</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS 완충액</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>러닝 완충액으로 사용</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine 완충액</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>전달 완충액으로 사용</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 전사 멤브레인</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>이것은 45 &micro; m 기공 크기 및 프로토콜에 Western Blot Membrane</td></tr><tr><td>4x Laemmli sample buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% Criterion TGX 프리캐스트 겔</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>장기 보관을 위한 면역 염색 커버슬립 장착에 사용됩니다</td>.</tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR 분석</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

내 피 조상 세포 (Epc) 말 초 혈액에서의 존재와 vasculogenesis에의 참여 Ashara와 동료1에 의해 처음 보고 되었다. 나중에, 다른 비슷한 유형의 골2,3에서 발생 하는 Epc의 실존 문서화. 더 최근에, 요더와 Epc 탯 줄 혈액에서 파생 했다 잉 그램은 높은 증식 잠재력 성인 주변에서 고립 된 사람에 비해 혈액4,,56했다. 출생 후 vasculogenesis에 참여 하 고, 떨어져 Epc 또한 나타났습니다 약속 만드는 조직 설계 혈관 및 심장 밸브 구조7,8셀 원본으로. 존재 하는 다양 한 격리 프로토콜, 일부는 포함 하는 단 세포 (MNCs) 내 피 및 조 혈 마커의 도움으로 설명한 소스에서 파생 된 셀 정렬 또는 특수 내 피 성장 이러한 MNCs를 경작 중간, 또는 이러한 기법9의 조합. 여기, 선물이 고립에 대 한 프로토콜 및 사용 하 여 Epc의 문화 전문 내 피 중간 immunosorting, 뒤에 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 격리 된 세포의 특성의 사용 없이 성장 인자를 보충 하 고 immunostaining입니다.

절연 및 내 피 조상 세포의 확장: 회로도 (그림 1) 전체 프로토콜을 묘사한 제공 됩니다. 다른 혈액 구성 요소 레이어 밀도 밀도 그라데이션 매체와 인간 탯 줄 혈액의 그라데이션 원심 다음 관찰 되었다. 콜라겐 치료 접시에 MNCs를 시드 시 식민지의 파생물 일 5와 7 (그림 2A) 사이 처음 관찰 되었다. 이러한 식민지 성장을 계속 하 고 나중 조약돌 모양의 형태 (그림 2E-2 층) 진행 초기 단계에서 스핀 들 모양의 세포 형태학 (그림 2A-2D)를 했다. 그림 3 <str...

이 프로토콜의 목표는 내 피 뿌리 탯 줄 혈액에서 세포를 분리. 조직 설계 만드는 혈관 및 심장 밸브 구성 및 응용 프로그램의 일부는 biomarker로 심혈 관 위험, 허 혈 성 질환 치료 환자를 식별 하는 데 이러한 세포를 사용 하 여 포함 됩니다.

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

이 절차의 전반적인 목표는 인간 제대혈에서 혈관내피전구세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 혈관 이식편의 조직 공학을 위한 자가 세포로 활용될 가능성이 있는 제대혈 유래 혈관내피전구세포의 분리 과정을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 별도의 면역 sorting 과정 없이 특수 배지를 사용하여 분리 절차를 수행할 수 있다는 점입니다.분리된 혈관 내피 전구세포는 신생 혈관 형성을 연구하는 데 사용할 수 있으며, 이러한 세포를 심혈관 질환 위험군 환자를 식별하는 바이오마커로 활용할 수 있다는 보고도 있습니다. 분리 절차를 시작하기 전에, 6-웰 플레이트의 각 웰에 갓 제조한 쥐 꼬리 1형 콜라겐 용액 2 mL를 처리하여 사전 코팅하십시오. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 평형화하십시오.그런 다음 제대혈 약 25 milliliters를 HBSS로 1:1 비율로 희석합니다. 다음으로 50 milliliter 원추형 튜브에 밀도 구배 매질 시약을 20 milliliters 넣고, 희석된 제대혈 20 milliliters를 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 분주하여 매질 위에 혈액 층을 형성합니다. 원심분리를 통해 세포를 분리한 후, 혈장 층을 조심스럽게 제거합니다.18게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여, 단핵구가 포함된 버피 코트(buffy coat)를 새 50 milliliter 튜브에 수집합니다. 그런 다음 세포에 동일한 부피의 혈관 내피 세포 기초 배지를 추가합니다. 원심분리를 통해 세포를 세척하고, 얼음 위에서 5 milliliter의 염화암모늄 용액을 사용하여 생성된 펠렛 내의 적혈구를 용해시킵니다.가끔씩 흔들어주며 5~10분 동안 둔 후, 원심분리를 통해 세포를 수집하고 흰색 펠렛을 신선한 혈관내피세포 성장 배지에 다시 현탁합니다. 세포 수를 센 후, 6웰 플레이트의 각 웰에서 콜라겐을 흡입하여 제거하고 PBS로 웰을 3회 세척합니다. 단핵구 세포를 웰당 배지 2 mL당 1 × 10⁷ cells 농도로 분주합니다.그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 신선한 혈관내피세포 성장 배지로 세포를 1회 세척합니다. 그 후 세척액을 3 mL의 신선한 혈관내피세포 성장 배지로 교체하고, 세포를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다.명시야 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 매일 촬영함으로써 혈관 내피세포 콜로니의 진행 상황을 모니터링하고, 콜로니가 발생한 플레이트를 표시하여 성장을 추적합니다. 혈관 내피세포 콜로니의 크기가 약 3 mm에 도달하면, T25 배양 플라스크를 신선한 rat tail one collagen으로 코팅하여 세포 배양 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 둡니다. 그 후, 웰당 150 µL의 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 2~3분 동안 세포를 회수합니다.플레이트를 가볍게 두드려 부착된 세포를 떼어냅니다. 세포가 떨어지기 시작하면 즉시 2 mL의 신선한 혈관 내피 성장 배지를 넣고, 세포를 15 mL 원추형 튜브 하나에 모읍니다. 원심 분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 신선한 혈관 내피 성장 배지에 재현탁합니다.세포 수를 센 후, 플라스크당 3mL의 배지에 5×10⁵ cells의 밀도로 콜라겐 코팅 플라스크에 세포를 분주하고, 해당 플라스크를 계대 1세대로 표시합니다. 그 후 플라스크를 인큐베이터에 넣고, 콜로니가 90% 합류도(confluency)에 도달할 때마다 세포를 재분주합니다. 콜라겐 처리된 플레이트에 분주한 후, 일반적으로 5일에서 9일 사이에 첫 번째 콜로니 성장이 관찰됩니다.콜로니는 배양 초기 단계에서 계속 성장하며 방추형 세포 형태를 띠게 되고, 이후 자갈 모양의 형태(cobblestone-like morphology)로 진행됩니다. 각 계대 배양 시 수확되는 총 세포 수는 총 배양 일수와 직접적인 상관관계를 가지며 증가합니다. Western blot 분석 결과, 배양된 혈관 내피 세포에서 CD 31 및 CD 34가 초기에 발현되며, 이는 후속 계대 배양을 거치면서 감소하는 것으로 나타납니다.하지만 vascular endothelial growth factor receptor two의 발현은 시간이 지나도 유지되며, 다만 첫 번째 계대 배양 후에 관찰된 것보다 약간 낮은 수준으로 발현됩니다. 주목할 점은, 양성 대조군으로 포함될 수 있는 판막 간질 세포 용해물(valvular interstitial cell lysates) 등과 달리, 혈관 내피 전구 세포는 중간엽 세포 마커인 alpha smooth muscle actin에 대해 양성 반응을 보이지 않는다는 것입니다. 전체 분리 과정은 확보한 제대혈 단위에 따라 5시간 이내에 완료될 수 있습니다.단핵 세포를 분리하여 혈관 내피 성장 배지에 파종한 후, 배양액에서 EPC 콜로니가 나타나기까지는 보통 5일에서 9일 정도가 소요됩니다. 제안된 분리 방법은 혈관 내피 전구 세포 배양을 위한 특수 배지를 사용하며, 혈관 내피 마커 확인이 필요한 경우에도 유세포 분석기의 사용을 배제합니다. 또한, 이 방법은 짧은 시간 내에 다량의 혈관 내피 전구 세포를 얻을 수 있는 효율적인 프로토콜을 제공합니다.본 영상을 시청하신 후에는 인간 제대혈 유닛에서 혈관 내피 전구세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 인간 제대혈은 위험할 수 있으므로, 폐혈액 및 세포 배양 생성물의 적절한 폐기 절차를 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오 프로토콜은 인간의 탯줄에서 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 고립과 문화를 보여줍니다. 일단 이러한 세포도 휴스 연구소에 의해 입증 최적화된 섬유소 젤 비드 분석처럼 체외의 angiogenesis의 assays에서 사용할 수 있습니다 고립.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs) 본질을 표시하는 강력한 clonal proliferative 잠재력과 내피 세포를 순환하고...

내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

이 프로토콜은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 안정적으로 생성하고 특성화할 수 있도록 합니다. BOEC는 혈관 질환 환자의 내피 세포의 대리 및 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 기질로 사용할 수 있습니다.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

여기, 우리는 전 설명 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장+ 세포 탯 줄 혈액에서 파생 된 칵테일 cytokine VPA의 조합으로 치료. 이 메서드 중 하나에 대 한 기본 HSCs의 비보 확장 전의 상당한 정도로 리드 임상 또는 실험실 응용 프로그램.

인간 탯 줄 혈액 파생 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장 전+ 세포 Valproic 산 사용 하 여

여기서, 우리는 4개의 골수성 혈통에 제대혈 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 면역표현특성 및 사이토카인 유도분화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 적용은 CD34+ 세포의 골수성 분화에 대한 골수성 질환 돌연변이 또는 소분자의 영향에 대한 조사를 포함한다.

인간 코드 혈액 유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 범골수성 분화

배우세요 인간 탯 줄 혈액에서 내피 조상 세포를 고립하는 방법을. 이 기술은 혈관 재생 연구와 심혈관 질환 바이오마커 개발에 활용됩니다.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

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