Name: 샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에서 측정 가능한 잔여 질환을 정확히 검출하고 백혈병 줄기 세포를 정량화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 높은 재현성과 임상 의사결정에 필수적인 정보를 제공합니다.

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이 연구는 VONK 네덜란드 암 협회 (알프 2013-6371)와 Egbers 기초에 의해 지원 되었습니다. 우리는 네덜란드 AML MRD 작업 그룹 공동 작업에 대 한 및 지속적인 개선 및 AML MRD의 표준화에 대 한 유익한 토론 감사합니다.

<ol><li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+AML+in+adults%3A+2017+ELN+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel.</a> Blood. 129 (4), 424-447 (2017).</li>
<li>Zwaan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Efforts+Driving+Progress+in+Pediatric+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2949-2962 (2015).</li>
<li>Cornelissen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+European+LeukemiaNet+AML+Working+Party+consensus+statement+on+allogeneic+HSCT+for+patients+with+AML+in+remission%3A+an+integrated-risk+adapted+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (10), 579-590 (2012).</li>
<li>Grimwade, D., Freeman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+minimal+residual+disease+in+acute+myeloid+leukemia%3A+which+platforms+are+ready+for+%26%2334%3Bprime+time%26%2334%3B%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for &#34;prime time&#34;?</a> Hematology. 2014 (1), 222-233 (2014).</li>
<li>Krönke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+minimal+residual+disease+in+NPM1-mutated+acute+myeloid+leukemia%3A+a+study+from+the+German-Austrian+acute+myeloid+leukemia+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group.</a> J Clin Oncol. 29 (19), 2709-2716 (2011).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prognostic+impact+of+flow+cytometric+minimal+residual+disease+detection+in+acute+myeloid+leukemia%3A+data+from+the+HOVON%2FSAKK+AML+42A+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study.</a> J Clin Oncol. 31 (31), 3889-3897 (2013).</li>
<li>van der Velden, V. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+flowcytometric+minimal+residual+disease+detection+in+pediatric+acute+myeloid+leukemia+patients+treated+according+to+the+DCOG+ANLL97%2FMRC+AML12+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol.</a> Leukemia. 24 (9), 1599-1606 (2010).</li>
<li>Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRD+in+AML%3A+time+for+redefinition+of+CR%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">MRD in AML: time for redefinition of CR?</a> Blood. 121 (12), 2166-2168 (2013).</li>
<li>Feller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRD+parameters+using+immunophenotypic+detection+methods+are+highly+reliable+in+predicting+survival+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 18 (8), 1380-1390 (2004).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Paietta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+minimal+residual+disease+%28MRD%29+in+leukemia%3A+a+changing+definition+and+concept%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept?</a> Bone Marrow Transplant. 29 (6), 459-465 (2002).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+disease+detected+by+multidimensional+flow+cytometry+signifies+high+relapse+risk+in+patients+with+de+novo+acute+myeloid+leukemia%3A+a+report+from+Children%27s+Oncology+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group.</a> Blood. 120 (8), 1581-1588 (2012).</li>
<li>Zeijlemaker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+one-tube+assay+for+immunophenotypical+quantification+of+leukemic+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 30 (2), 439-446 (2015).</li>
<li>Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. , 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html">https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html</a> (2017).</li>
<li>Bachas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+minor+subpopulations+within+the+leukemic+blast+compartment+of+AML+patients+at+initial+diagnosis+in+the+development+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse.</a> Leukemia. 26 (6), 1313-1320 (2012).</li>
<li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li>
<li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li>
</ol>

여러 독립적인 기관에 줄기 세포 관의 유효성 검사에 사용 하는 항 체 칵테일 친절 하 게 BD에 의해 제공 되었다. 저자는이 원고에 관하여 공개 없다.

충분 한 데이터는 사용할 수 있는 MRD 양성 가난한 생존와 관련 된 것에 대 한 증거를 보여 및 따라서 MRD 평가는 임상 결정을 만들 수 있습니다 추가 전조 정보를 제공 하 여 환자의 결과 향상 될 수 있습니다. 그러므로, MRD의 면역 phenotypic 평가 대 한 일관 되 고 통일 된 방법 궁극적으로 환자 치료를 개선 하기 위해 필수적입니다. 이것은 또한 중요 한 여러 임상 사이트에서 임상 연구를 비교할 때 고 있습니다 궁극적으로 임상에 도움이 결정 하 고 전반적인 생존을 위한 대리 임상 끝점으로 제공. 단단한 지침 서는 정확 하 고 일관 된 MRD 측정에 대 한 보증 개념 디자인의 지침을 유럽 백혈병 네트워크 (ELN)의 공동된 작업을 주도하 고 있다. 이 포괄적인 문서 출판된 늦은-2017, 되며 많은 연구 그룹 및 앞으로 이동 하는 실험실에 대 한 도구가 될 것 이다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
MRD 분석의 중요 한, 그리고 종종 간과 측면 MRD의 정확한 결심에 샘플 품질의 영향 이다. 이 때 더 명백한 물자는 주어진이 설정에서 고려 되어야 하는 데 필요한 추가 작업 고려 글로벌 임상 실험에서 다른 기관에 이송 됩니다. 환자를 혼합의 위험을 줄이기 위해 정보 및 샘플 적절 한 관리의 적시 납품은 중요 합니다. 다시, 전송의이 단계에서 올바른 양식 또는 가져오기 요청된 분석의 명확한 지정 전자 병원 시스템에는 필요 합니다. MRD 샘플링의 치료에서 무대를 지적 또한 중요 한 임상 의사 결정 (예 후 치료의 두번째 과정)와 관련이 있을 수 있습니다 때문 이며 따라서 명확 하 게 정의 해야 합니다. 모의 데이터 (예를 들어 1 월 1 일 출생의 년 당) 사용 환자 또는 분석을 혼합의 위험을 증가 시킵니다. 법에 의해 필요한 경우 익명된 식별 방법은 사용 되어야 한다.
모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 수행할 수 있는 가장 메 마른 조건 하에서 (로컬) 바이오 뱅크에 셀의 추가 cryopreservation 남아 관련: 많은 임상 연구는 더 이상 백혈병 세포를 조사 하는 추가 분석 이후 단계에서 수행을 분자, 면역 phenotypic 및 기능 기능을 존중 합니다. 그러나 biobanking의 내용은이 원고의 범위 내에서 않습니다.
진단 도구를 사용 하 여 MRD cytometry, 뿐만 아니라 MRD 평가의 품질 관리에 관한 공인된 실험실 필요한 의미 합니다. 이 특정 참조 실험실 또는 (재) 참조 팀 MRD 측정 흐름 파일을 분석 하는 샘플을 배포 해야 합니다.
이 문서는 임상 샘플-효과적인 요구 하는 특정 작업, 책임, 그리고 자주 통신 전문가의 전체 팀에에서 MRD의 결심에 골 aspirate 컬렉션에서 가장 중요 한 작업을 설명 합니다. 특성화 및 분석입니다. 각 작업 절차에 중요 한 이기 때문에, 사운드 물류 각 실험실과 특별히 훈련을 받은 작업에 대 한 충분 한 백업 인재에 프로토콜을 포함 하는 것이 좋습니다. 또한, 몇 가지 상대적으로 주관적인 단계 절차 (특히 LAIP 및 LSC 탈 마커 식별)의 부분에서, 이후 그것은 최종 결과 대 한 토론 팀, 여 고의 팀에 의해 허가 하는 최종 보고서에 필수적 감독자입니다. 현재 노력 (LAIP 및 LSC) MRD 분석 표준화 하는 것을 도울 것 이다 컴퓨터 소프트웨어 개발을 추구 하 고는.
수정 및 문제 해결
각 실험실 MRD 측정 문서 ELN의 지침에 설명 된 대로 비교 결과 대 한 필수적입니다 마커의 표준화 된 백본 데 있지만 다른 부분 모집단을 정의 하는 데 사용할 수 있는 항 체의 그것의 자신의 세트를 가질 수 있습니다. 위의 참조. 고려 될 필요가 및 결과의 분석을 어렵게 만들 수 있는 몇 가지 문제는 선택한 마커의 불문.
기술의 한계
LAIP 및 LSC 탈 마커 식의 식별 처음 진단에서 평가 하 고 (중과 치료 후) 시간이 지남에 MRD의 표현 형의 정확한 특성화에 대 한 모니터링. 이상 환자의 95% LAIP LSC (또는 둘 다)을 통해 평가 될 수 있다, 그러나 아직도 일부 환자 없다 정의 된 LAIPs 또는 아무 CD34 + CD38-LSCs CD34 부정적인 폭발, 제시 또는 누락 된 진단 샘플을가지고. 이러한 경우에, 그것은 여전히 가치가 시도 하 고 사용 가능한 셀 수 있으며 다음 가장 신뢰할 수 있는 (주는 leukemic 세포의 가장 강한 구별)을 선택으로 광범위 한 항 체의 패널 MRD 측정 LAIP. 고려 할 궁극적으로 재발 하는 환자의 비율 완전히 진단 immunophenotype AML 질병의이 성분으로 인해 유사 하지 않습니다 어쨌든 권장 MRD에서 항 체의 광범위 한 패널을 측정. 이러한 immunophenotypic 교대 LSCs 폭발 세포 등 치료16 동안 발생을 표시 하 고 측정 가능 질병이 소위 곧 인구에 기반 할 수 있습니다. 그러나이 시간에, 그것은 되었습니다 결정 되지 여부 모든 immunophenotypic 부분 모집단 질병 재발으로 이어질 것입니다 하 고 따라서 MRD 맞춤형 치료를 보고 하지 관행에 따라 임상 시험에서이 세포. 그것은 중요 인구 변화 때문 LSC를 누락의 위험에 가장 중요 한 aberrancy 정의 마커 있는 하나의 cytometry (PE) 채널141 개의 관 접근에 의해 감소 된다.
기존의 방법에 관하여 의미
이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 하나 이상의 LAIPs, 치료 하는 동안 뒤에 셀의 정의에 의존 합니다. 이 방법의 단점은 최근에 보였다 LAIP 치료 동안 변경 될 수 있습니다. 이런식으로 다른 탈 선 마커 일부 곧 인구를 놓칠 수 있습니다. 이 회피, 진단에만 그 대신 모든 탈 마커 측정 하 기쁠 것 이다. 다음 여러 실험실17에서 사용 되는 "정상에서 다른" 접근 방식에 비슷한 것입니다.
미래의 응용 프로그램
최근, MRD는 새로운 임상 시험 디자인에 대 한 여분의 관심을 받고 있다. 전문된 치료 옵션 및 대상된 약물 치료의 시대에서 결과 조치로 MRD 사용 하 여 궁극적으로의 빠른 소개는 급히 치료 필요 수 있도록 새로운 치료의 임상 효능을 설정 하는 데 필요한 시간이 줄어듭니다. 병원에 옵션입니다. 적절 한 물류의 중요성 및 조화 MRD 평가의 실제적인 실행은 FDA MRD를 사용 하 여 전반적인 생존 대신 대리 끝점으로의 타당성을 조사 하 고 현재로 미래 급성 골수성 백혈병 치료 성공에 중요 한 18를 측정합니다.

급성 골수성 백혈병 (AML)은 골 수의 악성 특징 결함 비정상적인 증식 및 골수성 조상 세포의 축적으로 성숙 프로그램에 의해 정상 조, 그리고 궁극적으로 골 수 실패의 저해 . 질병은 매우 이질적인 형태, immunophenotype, 세포 유전학, 분자 착오 및 유전자 식 서명, 뿐만 아니라 치료 반응과 치료 결과1,2. 완전 한 죄 사 함 (CR), 분자, cytogenetic의 결과 의해 크게 유도 후 죄 사 함 치료 뒤 달성을 목표로 유도 화학요법을 포함 하는 현재 관리 및 immunophenotypic 연구의 구성 추가적인 화학요법 또는 헌 (수용자) 줄기 세포 이식3의 여러 코스. 높은 면제 율에도 불구 하 고 후 최대 90%, 성인 5 년 생존의 집중적인 화학요법만 약 30%-40%, 주로의 개발 때문입니다 일반적으로 화학 요법에 저항 하 고 그로 인하여 매우 취급 하기 어려운 relapses. 아이 들에 있는 결과가 낫다, 약 1/3도 재발 하는 비록. 따라서, 절박 한 재발의 조기 발견 unmet 의학 필요를 채울 것입니다 고 후 사 함 치료4가이드 수 있습니다.
잔여 질병 치료의 모든 진단 및 사후 진단 저항 메커니즘/요인; 합계를 반영 수 있습니다 후 따라서 측정 예 후 및 치료 지침에 대 한 수단이 있을 수 있습니다. Deﬁning 잔여 질병 (최소 잔여 질병 및 지금 추천된으로 측정을 잔여 질병 또는 MRD 이전의 함) 5% 폭발 세포의 형태학 기준 보다 훨씬 가능성 위험 classiﬁcation의 풍경이 변하고 있다. 현재 주로 MRD를 감지 하는 데 사용 하는 두 가지 방법 교류 cytometry-및 분자 기반, 후자는 역전사 PCR (RT-정량)5 에 의해 평가 되 고 또는, 다음 세대에 의해 조기 단계에 있지만 (NGS)를 시퀀싱. 성인 뿐만 아니라 아이 들에서 많은 연구는 이미 다양 한 MRD 접근 AML 모두 후 유도 및 통합 치료6,7, 그리고 질병 부담 (새로운 정의에 강한 전조 정보 제공 증명 우수한 형태 CR) 지금 나오고 있다8. MRD 흐름에 의해 평가 및 분자 기술 되어야, 그리고 사실 이미 되고있다, AML에 모든 임상 시험에서 표준 제안 합니다.
이 원고에서는 골 수 샘플, 골 샘플링을 포함 하 여 및 처리 절차 cytometry 앞에 MRD의 정확 하 고 재현 immunophenotypic 특성을 얻기 위해 상세한 흐름 cytometry 절차를 설명 합니다. 진단 및 속 행에서 좋은 품질의 골 샘플의 가용성은 임상 사이트 및 임상 시험이이 측정의 성공에 결정적 이다. 사실, 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. MRD의 immunophenotypic 특성, aberrantly 표현된 마커 보통 골수성 및 조상 마커, 백혈병 관련 된 immunophenotype (LAIP)9를 식별 하기 위해 결합 됩니다. MRD는 치료, 내장 또는 취득 백혈병 약물 저항, pharmacodynamics 등 치료, 면역 감시 및 규정 준수의 활동에 대 한 응답에 영향을 미치는 많은 요인의 결과 측정 합니다. 따라서, MRD는 매우 강한 후 진단 전조 매개 변수 수신기 작동 특성 (ROC) 분석에 의해 결정 된 커트 오프 수준에 dichotomized 때 임상 결과와 관련 된입니다. HOVON 42a의 우리의 성인 AML 일대에 대 한 연구, 인하 수준 LAIP 긍정적인 세포/총 백혈구의 0.1%에서 설정 됩니다. 부정적인 대 긍정적인 MRD 상태를 결정 하기 위한이 기준을 사용 하 여, 환자의 그룹 식별할 수 있습니다 크게 악화 재발 발생률, 재발 및 전반적인 생존6을. 또한, 우리는 환자 결과10의 강력한 예측을 제공 하는 줄기 세포와 같은 기능 (CD34 + CD38-백혈병 줄기 세포, 또는 LSC), 미 숙, 약물 내성 백혈병 세포의 측정을 설명 합니다. 함께 LAIP 및 LSC 양식 흐름 cytometric MRD 접근 접근 한다. LAIP 접근 LSC 접근 약 80%의 환자에 적용할 수 있는 하는 동안, 환자의 약 90% 위해 적당 하다. 매개 변수 하나 또는 둘 다 함께 이상 환자의 95%를 평가할 수 있다.
마지막으로,이 게시 cytometry MRD 평가를 상세한 작업 설명이 제공 됩니다. 이것은 포함 한다: 1) 조화 및 골 샘플링 절차의 표준화, 샘플 2) 교통 지도 3) 상세한 설명 leukemic 세포 검출의 FACS 단일 셀 튜브 접근을 포함 한 여러 가지 항 체 패널을 사용 하 여 함께 LSC, 4 하)는 FACS의 표준화 된 측정, 5 기계) MRD 측정 및 6에 대 한 분석 프로그램) LSC 탐지에 대 한 분석 프로그램.
우리는 거의 그것은 최종 결과의 품질에 대 한 중요 한 문제 논의 이후 샘플 준비를 포함 하 여 프로시저의 모든 측면을 표시 하고자 합니다. 골 수 포부와 생 검 임상 절차 골 수 내 조 혈 모 세포를 평가 하는 데 사용 되는. 이러한 완전 한 혈액 검사 (CBC) 및 혈액 얼룩 수행 됩니다. 골 수 포부에 대 한 최적의 방법 정확한 진단과 후속 MRD 측정에 대 한 결정적 이다. 또한, 성공적인 골 수 aspirate LAIP 및 LSC 흐름 분석 (10 백만 이상 실행 가능한 세포)을 수행할 충분 한 세포를 포함 해야 합니다. 여기, 우리 골 수 포부를 수행 하기 위한 방법을 설명 해야 적절 한 셀 샘플링 (및 결과 제한 hemodilution에 대 한 잠재력) 필요한 정확한 진단 및 추가 연구에 대 한 지침을 제공 하 고. 이러한 사전 분석 고려 사항은 중요 한 분자 (PCR 및 NGS) MRD 접근의 있습니다. 모든 표본 immunophenotyping에 대 한 컬렉션의 24 시간 이내에 우선적으로 처리 한다. 비록 하지 추천, 골 수 및 말 초 혈액 샘플 수 여전히 처리 되며 분석 72 h 최대 주위 온도에 유지 될 때. 또한, 재료와 함께 모든 보정 나중 연구/품질 평가 등을 위한 무 균 세포의 cryopreservation 수 있도록 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>120995496,060996589 및 013729</td><td>FACS Canto II&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>벡크만 쿨터</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD 생명과학</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>CST 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Pharm 용해 솔루션</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td>Multicolor CompBeads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>CST 비즈</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva 소프트웨어</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Tuerk 솔루션</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>빈 보정 입자 비즈</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>증권 시세</td></tr> 표시기<tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>아지드</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>DDH2O</td></tr></tbody></table>

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

환자는 완전 한 죄 사 함 (CR) 달성 여부를 확인 하기 위해 활용 하는 형태 론 적 검사와 급성 골수성 백혈병 (AML)에 응답 기준을 다시 설정 하 고, 최근 되었습니다 수 있습니다. 약 한 CR 성인 환자의 절반 골에 있는 잔여 AML 셀의 파생물 인 12 개월 이내 재발 됩니다. 남아 있는 백혈병 세포, 또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)로 알려진이 정량이이 relapses의 예측에 대 한 강력한 바이오 마커를 될 수 있습니다. 또한, 여러 연구의 회 고 분석 AML 환자의 골 수에서 MRD의 존재와 가난한 생존 상관을 보이고 있다. 뿐만 아니라 총 leukemic 인구, 반영 세포 면역-표현 형 (LAIP), 임상 결과와 관련 된 관련 된는 백혈병을 품고 있지만 그래서 백혈병 줄기 세포 (LSC), 둘 다 수의 미 숙 저주파 부분 모집단 cytometry MRD 또는 MRD와 같은 접근 방식을 통해 모니터링. 질병 또는 질병 관련 기능 (비정상적인 분자 마커 또는 탈 선 immunophenotypes) 기준으로 잔여 백혈병 (stem) 세포의 탐지를 가능 하 게 하는 중요 한 분석의 여부는 대폭 향상 된 MRD 평가 급성 골수성 백혈병. 그러나, 고유의 고 질병으로 AML의 복잡성을 감안할 때, 골 수를 샘플링 및 MRD 및 LSC 분석 방법 해야 될 조화를 이루고 가능 하면. 이 원고는 적절 한 골 수 aspirate 샘플링에 대 한 상세한 방법론 설명, 수송, 최적의 멀티 컬러 흐름 cytometry 평가 대 한 처리 및 게이팅 MRD LSC 치료 결정에 도움이 평가 전략 대 한 AML 환자.

AML 환자의 90%에서 적어도 1 개의 LAIP은 확인할 수 있습니다. LAIP + 진단에서 원시 폭발 세포의 세포의 정확한 비율을 생성 하기 위해 폭발 게이트의 적절 한 설정을 중요 하 고 그림3에서 시각으로 확인 필요 합니다. CD34 + 기본 셀에 aberrancy의 특정 종류를 품고 각 환자의 예는 그림 5에 시각 이다. 에 따라 업 MRD의 측정, 이전 정의 된 LAIP + 셀 문이 고 WBC의 LAIP + 셀의 비율로 정의. 따라서이 게이트의 설정은 바로 MRD 결과 달성 하기 위해 중요 합니다. 그림 6 유도 치료의 두 번째 주기 후 완전 한 죄 사 함에는 환자와 relapses MRD 긍정적인 결과 (≥ 0.1%) 후 환자를 보여준다.
현재 프로토콜은만이 구획의 철저 한 특성화 CD38-인구 분수 처럼 가장 유력한 줄기 세포 비호 나타났습니다 CD34 + 세포, 줄기 세포 정의 적당 하다. 이 분수에서 HSC에서는 LSC를 분리 하기 위하여 추가 마커 사용 됩니다. LSC 구별을 가장 많이 선택 된 표식은 CD45RA 및 PE 표시 6 특정 LSC 마커 은닉 콤 채널 있습니다. 추가 임상 평가 바탕으로, ≥ 0.004%의 커트 오프 수준을 LSC 양성으로 정의 된 고 0.0001%의 커트 오프 수준을 follw 업10에 사용 되었다 하는 동안 진단에 더 생존에 연관 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> 그림 1 : 골 수 얼룩. A) 건강 한 기증자와 B) AML 환자 (팹 5 하위). Giemsa 얼룩 100 배 확대 표시입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> 그림 2 : 생물 학적 체액에 대 한 포장 재료 수정. 생물 학적 체액을 운반의 규정과 규칙에 세부 사항 더 질병 통제 및 예방 센터의 웹사이트15 에서 찾을 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> 그림 3 : 폭발 셀을 정의 하기 위한 전략을 게이팅. A) 게이팅 CD45dim, B) 게이팅 CD34 + 폭발.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> 그림 4 : 림프 톨 게이트. A) 블루 셀은 B) 녹색 세포는 림프 톨 CD45높은/SSC낮은, C 특징 FSC/SSC 작 에서처럼 WBC) CD34, D) CD117과 E) CD13에 대 한 부정을 위한 부정에 대 한 부정적의 예제 F)는 다른 세포 유형에 표시 되는 개요 인구 나무입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> 그림 5 : 급성 골수성 백혈병 진단에 LAIPs. A) LAIP에 따라 혈통 aberrancy 크로스 (CD7 CD33 표현 셀에), B) 비동기 차별화를 기반으로 하는 LAIP (CD13 표현 셀에 CD11b), 정상 세포 (CD34매우 높은 CD13에 표현 하는 셀)에 비해 overexpression를 기반으로 하는 C) LAIP D) LAIP underexpression (HLA-DR낮은 CD33에 표현 하는 세포) 정상 세포에 비해 기반으로 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> 그림 6 : LAIP 치료 동안 다음. 진단에서 A) LAIP 정의 (CD34 + CD13 + CD33-) 연속 완전 한 죄 사 함, 진단에서 B) LAIP 정의에 남아 있던 환자에서 속 행 동안에 LAIP의 손실 (CD117 + CD7 + CD33 +) 및 환자에 속 행 동안 LAIP의 지 속성 들 relapsed. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> 그림 7 : 줄기 세포 게이팅. A) Gating의 다른 CD34 + / CD38 인구 기반 구슬 (CD38매우 낮은 LSC를 나타내는 진정한 부정적인 세포로 정의 되어 있으며 구슬의 중간 아래 위치 하면서 구슬의 상단 테두리 아래 CD38낮은 이다), B) 2 환자 CD45RAneg 와 CD45RApos 식에 따라 후속에 HSC 및 LSC 사이 구별의 예. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>
보조 파일 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>
보충 파일 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">여기를 클릭 하십시오 다운로드가이 파일.</a>

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 백혈병 줄기세포의 정량화를 포함하여 측정 가능한 잔류 질환에 대해 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에 대한 정확한 검사를 수행하는 것입니다. 이 방법은 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에서 측정 가능한 잔류 질환을 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 프로토콜을 면밀히 따르면 재현성이 높은 고품질 결과를 얻을 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 치료에 대한 환자의 반응을 판독하는 데 사용될 수 있기 때문에 임상 의사 결정으로 확장됩니다. 혈액학자인 Jeroen Janssen, 진단 혈액학 실험실의 기술자인 Gerrit Sijm, MRD 팀의 기술자인 Jennifer Scheick과 Sander Snel이 절차를 시연할 것입니다. 환자가 외측 욕창 위치에 있는 상태에서 펜으로 상부 후방 장골 척추를 표시하고 바깥쪽 원을 그리며 에탄올 중 0.5-1%클로르헥시딘으로 원하는 생검 부위의 피부를 소독합니다.국소 마취제를 투여한 후 손바닥의 근위 끝과 검지 손가락이 끝 근처의 바늘 샤프트 측면에 닿는 15게이지 2.8인치 바늘을 집어 올려 조절합니다. 부드럽지만 단호한 압력을 사용하여 마취된 피부를 통해 장골 척추를 향해 빠르게 교대로 내팽 외위 움직임을 통해 바늘을 삽입합니다. 바늘이 후방 장골 척추에 닿으면 스틸렛을 제거하고 빈 10ml 주사기를 바늘에 부착합니다.최대 10ml의 골수 스피큘이 채취될 때까지 플런저를 부드럽게 당겨 주사기 내에 음압을 생성합니다. 혈액 희석을 피하기 위해 흡인당 10mil 이상의 골수를 섭취하지 마십시오. 주사기를 제거하고 스틸렛을 바늘에 다시 놓습니다.그런 다음 약 2ml의 골수를 시계 유리에 넣고 헤파린으로 코팅된 8mm 튜브에 주입할 수 있을 만큼 충분한 샘플을 추출한 다음 즉시 튜브를 뒤집습니다. 응고를 예방하기 위해서는 골수를 넣자마자 항응고제가 함유된 튜브를 투입하는 것이 중요합니다. 최적의 형태학적 평가를 위해 플라스틱 주걱을 사용하여 시계 유리의 흡인에서 유리 슬라이드로 스피큘을 옮기고 골수 위로 다른 유리 슬라이드를 조심스럽게 미끄러지듯 움직입니다.건조 후 광학 현미경으로 분석하기 위해 May-Grunwald Giemsa로 스피큘을 염색합니다. 골수 튜브를 플라스틱 홀더에 넣고 홀더를 주변 젤 팩과 작성된 요청 양식과 함께 플라스틱 용기에 넣습니다. 유세포 분석으로 골수를 분석하기 전에 유세포 분석기를 시작하고 유세포 분석 소프트웨어를 열어 전방 산란 대 측면 산란 점도 플롯으로 새로운 실험을 만듭니다.세포의 크기와 세분도를 평가하려면 건강한 기증자로부터 라벨링되지 않은 용해된 말초 혈액 세포를 로드하고 Acquire Cells 기능을 선택합니다. 림프구를 게이트하고 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 게이트 세포 집단에 대한 적절한 평균 목표 값에 도달합니다. 그런 다음 최소 10, 000개의 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다.표적 개광 수로 사진 승수 관 전압을 놓기 위하여는, 첫째로 제조자의 지시에 따라 8 봉우리 무지개 구슬 구경측정 입자를 10의 낮은 흐름율로 000의 사건을 취득하기 위하여 사용하십시오. 전방 대 측면 산점도 점도표에서 singlet beads를 게이트한 다음 FITC-PE 점도표에서 7번째 피크를 게이팅합니다. 각 형광단에 대한 결과 비드 집단을 게이트합니다.8개 피크 레인보우 비드 현탁액을 계속 획득하고 제조업체의 지침에 따라 목표 MFI 값에 도달하도록 모든 형광 채널에서 PMT 전압을 조정 및 미세 조정합니다. Record를 사용하여 약 2, 000개의 이벤트 데이터를 수집하고 MFI에서 7번째 피크 비드를 확인합니다. 다음으로, 각 실험용 플루로크롬 접합 항체를 충분한 부피로 추가하여 해당 형광 튜브의 비드를 염색하고 대조군 1개를 뺀 후 튜브를 완전히 와류시킵니다.전방 산란 임계값이 5, 000으로 설정되고 모든 플루로크롬 보정 값이 0이 되도록 주의하면서 동일한 보정 매개변수를 사용하여 새 빈 실험을 만듭니다. 보정 컨트롤을 만들려면 보정 컨트롤 생성 기능을 선택하고 염색되지 않은 컨트롤 튜브를 로드합니다. singlet bead population 주위의 P1 gate를 조정하고 P1 gate에 singlet beads만 포함되어 있는지 확인합니다.P1 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Apply to All Compensation Controls(모든 보정 컨트롤에 적용)를 선택합니다. 그런 다음 P2 게이트가 각 형광 히스토그램의 양성 모집단을 포함하는지 확인하는 모든 단일 라벨링 형광 튜브에 대한 데이터를 기록합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 염색하려면 골수를 실험실로 운반하고 요청 양식을 확인하여 환자 연구 번호와 생년월일을 확인하고 염색이 필요한 항목을 결정합니다.MRD의 경우 4개의 튜브로 구성된 염색 패널을 사용합니다. 여기에서는 하나의 튜브로 구성된 LSC 패널의 염색을 보여줍니다. 세포 계수 후 적절한 양의 골수를 새 15ml 튜브로 옮깁니다.적혈구를 용해하기 위해 실험 세포 부피의 10배에서 용해 완충액을 추가합니다. 튜브를 뒤집어 세포를 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 용해 기간이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.실온에서 15ml의 세척 완충액에 세포를 재현탁시키고 원심분리로 세포 펠릿을 다시 수확합니다. 그 동안 5ml FACS 튜브에 적절한 양의 항체 칵테일 용액을 피펫팅합니다. 여기에 보이는 것은 줄기 세포 튜브용 패널입니다.펠릿을 세척 완충액에 재현탁하고 세포의 현탁액을 단클론 항체 칵테일 용액이 들어 있는 FACS 튜브에 추가하여 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 세척 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 원심분리 후 펠릿을 400마이크로리터의 신선한 세척 버퍼에 재현탁합니다.백혈병 줄기세포를 분석하기 위해 줄기세포 항체 칵테일로 염색된 세포 현탁액에 4마이크로리터의 빈 비드를 추가합니다. 그런 다음, 이전에 설정된 파라미터를 사용하여 샘플을 읽고, 실험 환자 샘플에서 10부터 6번째 이벤트를 최소 4번 획득합니다. 급성 골수성 백혈병 환자의 약 90%에서 관찰되는 백혈병 관련 면역표현형을 식별하려면 그림과 같이 폭발 게이트를 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.여기에서는 CD34 양성 원시 세포에 다양한 유형의 이상을 품고 있는 개별 환자의 데이터 예를 보여줍니다. 이 그래프에서 완전 관해를 유지하는 환자와 유도 요법의 두 번째 주기 후 측정 가능한 잔류 질환 양성 결과를 얻은 후 재발한 환자를 관찰할 수 있으며, 이는 샘플 분석 전에 정확한 게이트 설정의 필요성을 강조합니다. LSC의 식별 및 정량화를 위해서는 이 그래프에서 볼 수 있듯이 CD34 양성 CD38 음성 blast cell에 대한 수차에 대한 추가 분석이 필요합니다.이 프로토콜을 수행하는 동안 이 절차의 골수 샘플링, 운송, 실험 작업 및 분석 단계를 위한 전문 및 백업 인력을 보유하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차는 또한 세포 유전학 및 분자 분석을 수행하여 특정 세포 집단과 관심 분자 이상 간의 상관 관계에 대한 추가 질문에 답하거나 임상 결과를 예측하기 위해 환자의 위험 그룹을 구체화하는 데 사용할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 치료 후 AML 환자의 잔류 질환을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 AML 환자의 골수 샘플 채취 및 운송을 포함하여 유세포 분석을 사용하여 잔류 질환을 정확하게 식별하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 장골 척추에서 골수를 흡인하는 기술과 생검을 위한 도말 준비에 대해 설명합니다. 이 예에서는 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 골수 흡인을 수행하고 세포를 검사하여 중요한 예후 바이오마커인 측정 가능한 잔류 질환(MRD)을 확인합니다.

골수 흡인: 세포 형태를 검사하기 위해 골수를 얻는 방법

우리는 cytometry에 의해 동시 표현의 기본 급성 골수성 백혈병 세포에 백혈병 줄기 세포 마커를 감지 하는 프로토콜 개요. 우리 3 조상 인구와 성숙의 정도 증가 함께 상 상속 LSC 인구를 측정 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 이러한 인구에 해당 환자-파생-xenografts의 존재를 확인 했다.

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

여기에서는 인류 세포 분석 기반 방법을 사용하여 마우스에 이종 이식하고 골수 흡인에서 얻은 급성 인간 골수성 백혈병 세포에서 mTORC1, JAK/STAT5 및 MAPK 경로의 다운스트림 신호를 분석합니다. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 및 p-ERK1/2 수준은 고감도의 차세대 스펙트럼 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정됩니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다.

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

배우세요 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에서 측정 가능한 잔여 질환을 정확히 검출하고 백혈병 줄기 세포를 정량화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 높은 재현성과 임상 의사결정에 필수적인 정보를 제공합니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

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