샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 백혈병 줄기세포의 정량화를 포함하여 측정 가능한 잔류 질환에 대해 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에 대한 정확한 검사를 수행하는 것입니다. 이 방법은 급성 골수성 백혈병 환자의 골수 샘플에서 측정 가능한 잔류 질환을 정확하게 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 프로토콜을 면밀히 따르면 재현성이 높은 고품질 결과를 얻을 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 치료에 대한 환자의 반응을 판독하는 데 사용될 수 있기 때문에 임상 의사 결정으로 확장됩니다. 혈액학자인 Jeroen Janssen, 진단 혈액학 실험실의 기술자인 Gerrit Sijm, MRD 팀의 기술자인 Jennifer Scheick과 Sander Snel이 절차를 시연할 것입니다. 환자가 외측 욕창 위치에 있는 상태에서 펜으로 상부 후방 장골 척추를 표시하고 바깥쪽 원을 그리며 에탄올 중 0.5-1%클로르헥시딘으로 원하는 생검 부위의 피부를 소독합니다.

국소 마취제를 투여한 후 손바닥의 근위 끝과 검지 손가락이 끝 근처의 바늘 샤프트 측면에 닿는 15게이지 2.8인치 바늘을 집어 올려 조절합니다. 부드럽지만 단호한 압력을 사용하여 마취된 피부를 통해 장골 척추를 향해 빠르게 교대로 내팽 외위 움직임을 통해 바늘을 삽입합니다. 바늘이 후방 장골 척추에 닿으면 스틸렛을 제거하고 빈 10ml 주사기를 바늘에 부착합니다.

최대 10ml의 골수 스피큘이 채취될 때까지 플런저를 부드럽게 당겨 주사기 내에 음압을 생성합니다. 혈액 희석을 피하기 위해 흡인당 10mil 이상의 골수를 섭취하지 마십시오. 주사기를 제거하고 스틸렛을 바늘에 다시 놓습니다.

그런 다음 약 2ml의 골수를 시계 유리에 넣고 헤파린으로 코팅된 8mm 튜브에 주입할 수 있을 만큼 충분한 샘플을 추출한 다음 즉시 튜브를 뒤집습니다. 응고를 예방하기 위해서는 골수를 넣자마자 항응고제가 함유된 튜브를 투입하는 것이 중요합니다. 최적의 형태학적 평가를 위해 플라스틱 주걱을 사용하여 시계 유리의 흡인에서 유리 슬라이드로 스피큘을 옮기고 골수 위로 다른 유리 슬라이드를 조심스럽게 미끄러지듯 움직입니다.

건조 후 광학 현미경으로 분석하기 위해 May-Grunwald Giemsa로 스피큘을 염색합니다. 골수 튜브를 플라스틱 홀더에 넣고 홀더를 주변 젤 팩과 작성된 요청 양식과 함께 플라스틱 용기에 넣습니다. 유세포 분석으로 골수를 분석하기 전에 유세포 분석기를 시작하고 유세포 분석 소프트웨어를 열어 전방 산란 대 측면 산란 점도 플롯으로 새로운 실험을 만듭니다.

세포의 크기와 세분도를 평가하려면 건강한 기증자로부터 라벨링되지 않은 용해된 말초 혈액 세포를 로드하고 Acquire Cells 기능을 선택합니다. 림프구를 게이트하고 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 게이트 세포 집단에 대한 적절한 평균 목표 값에 도달합니다. 그런 다음 최소 10, 000개의 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다.

표적 개광 수로 사진 승수 관 전압을 놓기 위하여는, 첫째로 제조자의 지시에 따라 8 봉우리 무지개 구슬 구경측정 입자를 10의 낮은 흐름율로 000의 사건을 취득하기 위하여 사용하십시오. 전방 대 측면 산점도 점도표에서 singlet beads를 게이트한 다음 FITC-PE 점도표에서 7번째 피크를 게이팅합니다. 각 형광단에 대한 결과 비드 집단을 게이트합니다.

8개 피크 레인보우 비드 현탁액을 계속 획득하고 제조업체의 지침에 따라 목표 MFI 값에 도달하도록 모든 형광 채널에서 PMT 전압을 조정 및 미세 조정합니다. Record를 사용하여 약 2, 000개의 이벤트 데이터를 수집하고 MFI에서 7번째 피크 비드를 확인합니다. 다음으로, 각 실험용 플루로크롬 접합 항체를 충분한 부피로 추가하여 해당 형광 튜브의 비드를 염색하고 대조군 1개를 뺀 후 튜브를 완전히 와류시킵니다.

전방 산란 임계값이 5, 000으로 설정되고 모든 플루로크롬 보정 값이 0이 되도록 주의하면서 동일한 보정 매개변수를 사용하여 새 빈 실험을 만듭니다. 보정 컨트롤을 만들려면 보정 컨트롤 생성 기능을 선택하고 염색되지 않은 컨트롤 튜브를 로드합니다. singlet bead population 주위의 P1 gate를 조정하고 P1 gate에 singlet beads만 포함되어 있는지 확인합니다.

P1 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Apply to All Compensation Controls(모든 보정 컨트롤에 적용)를 선택합니다. 그런 다음 P2 게이트가 각 형광 히스토그램의 양성 모집단을 포함하는지 확인하는 모든 단일 라벨링 형광 튜브에 대한 데이터를 기록합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 염색하려면 골수를 실험실로 운반하고 요청 양식을 확인하여 환자 연구 번호와 생년월일을 확인하고 염색이 필요한 항목을 결정합니다.

MRD의 경우 4개의 튜브로 구성된 염색 패널을 사용합니다. 여기에서는 하나의 튜브로 구성된 LSC 패널의 염색을 보여줍니다. 세포 계수 후 적절한 양의 골수를 새 15ml 튜브로 옮깁니다.

적혈구를 용해하기 위해 실험 세포 부피의 10배에서 용해 완충액을 추가합니다. 튜브를 뒤집어 세포를 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 용해 기간이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.

실온에서 15ml의 세척 완충액에 세포를 재현탁시키고 원심분리로 세포 펠릿을 다시 수확합니다. 그 동안 5ml FACS 튜브에 적절한 양의 항체 칵테일 용액을 피펫팅합니다. 여기에 보이는 것은 줄기 세포 튜브용 패널입니다.

펠릿을 세척 완충액에 재현탁하고 세포의 현탁액을 단클론 항체 칵테일 용액이 들어 있는 FACS 튜브에 추가하여 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 세척 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 원심분리 후 펠릿을 400마이크로리터의 신선한 세척 버퍼에 재현탁합니다.

백혈병 줄기세포를 분석하기 위해 줄기세포 항체 칵테일로 염색된 세포 현탁액에 4마이크로리터의 빈 비드를 추가합니다. 그런 다음, 이전에 설정된 파라미터를 사용하여 샘플을 읽고, 실험 환자 샘플에서 10부터 6번째 이벤트를 최소 4번 획득합니다. 급성 골수성 백혈병 환자의 약 90%에서 관찰되는 백혈병 관련 면역표현형을 식별하려면 그림과 같이 폭발 게이트를 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.

여기에서는 CD34 양성 원시 세포에 다양한 유형의 이상을 품고 있는 개별 환자의 데이터 예를 보여줍니다. 이 그래프에서 완전 관해를 유지하는 환자와 유도 요법의 두 번째 주기 후 측정 가능한 잔류 질환 양성 결과를 얻은 후 재발한 환자를 관찰할 수 있으며, 이는 샘플 분석 전에 정확한 게이트 설정의 필요성을 강조합니다. LSC의 식별 및 정량화를 위해서는 이 그래프에서 볼 수 있듯이 CD34 양성 CD38 음성 blast cell에 대한 수차에 대한 추가 분석이 필요합니다.

이 프로토콜을 수행하는 동안 이 절차의 골수 샘플링, 운송, 실험 작업 및 분석 단계를 위한 전문 및 백업 인력을 보유하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차는 또한 세포 유전학 및 분자 분석을 수행하여 특정 세포 집단과 관심 분자 이상 간의 상관 관계에 대한 추가 질문에 답하거나 임상 결과를 예측하기 위해 환자의 위험 그룹을 구체화하는 데 사용할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 치료 후 AML 환자의 잔류 질환을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 AML 환자의 골수 샘플 채취 및 운송을 포함하여 유세포 분석을 사용하여 잔류 질환을 정확하게 식별하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.