정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

뇌 절편 배양을 위한 이 변형된 롤러 튜브 방법의 전반적인 목표는 장기 절편 생존을 위한 밀폐된 배양 시스템을 제공하는 것입니다. 반복적인 고해상도 형광 이미징 기능을 갖추고 있습니다. 이 방법은 시냅스 형성 또는 손실에 관여하는 주요 단백질의 국소화와 같이 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 관찰해야 하는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 단백질 발현을 위해 바이러스를 안전하게 사용할 수 있는 완전 밀폐형 배양 시스템과 이미징을 위해 동일한 세포를 국소화하기 위해 포토 에칭된 커버슬립을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 롤러 튜브 내부의 커버슬립에서 슬라이스를 배양할 때 처음 떠올랐지만, 시간이 지남에 따라 살아있는 슬라이스에서 발생하는 변화를 시각화할 수 있는 더 나은 방법이 필요했습니다. 현미경 이미징을 위해 transgenes 및 특정 세포 집단을 발현하기 위해 바이러스 벡터가 널리 사용됨에 따라 사용자를 보호하고 현미경 대물렌즈의 오염을 제거하기 위한 밀폐형 시스템을 개발하게 되었습니다.

시간이 지남에 따라 뇌 절편 내의 동일한 세포 집단을 추적할 수 있는 능력은 인간 신경 장애의 설치류 모델에서 병리학적 변화 및 시냅스 변화의 발달에 대한 연구를 가능하게 합니다. 시작하려면 롤러 튜브 랙을 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 롤러 튜브에 구멍을 뚫는 데 도움이 되는 지그를 만듭니다. 지그를 사용하여 평평한 면이 1cm의 플라스틱 배양 튜브를 제자리에 고정하여 평평한 면이 위를 향하도록 합니다.

그런 다음 중심이 바닥에서 1cm 떨어지고 튜브 측면 사이의 중앙에 6mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 회전식 디버링 도구를 사용하여 구멍의 가장자리를 매끄럽게 만들고 구멍의 안쪽 가장자리에 4개의 홈을 만들어 회전 중에 구멍을 쉽게 배수할 수 있습니다. 다음으로, 튜브를 70% 에탄올로 헹구고 생물학적 안전 캐비닛에서 자연 건조합니다.

UV 램프 아래에서 40분 동안 약 12mm 펀칭 접착 실리콘 고무 디스크의 튜브를 살균합니다. 20분 후 노출된 모든 표면이 멸균되도록 튜브와 디스크의 위치를 변경합니다. 그런 다음 접착 디스크에서 흰색 뒷면을 떼어내고 구멍을 정렬한 다음 실리콘 고무를 튜브 외부에 부착합니다.

슬라이스를 얻으면 준비된 커버 슬립의 사진 에칭 면 중앙에 2 마이크로 리터의 치킨 플라즈마를 놓습니다. 플라즈마를 약간 펴서 3-4 밀리리터 직경의 스폿을 만듭니다. 그런 다음 멸균되고 끝이 좁은 주걱을 사용하여 준비된 뇌 조각을 들어 올립니다.

닫힌 집게를 사용하여 슬라이스를 들어 올리는 동안 주걱 끝에 슬라이스를 유지합니다. 주걱을 커버슬립의 플라즈마 스폿에 대고 집게를 닫아 슬라이스를 커버슬립에 밀어 넣습니다. 슬라이스를 놓기 전에 커버슬립에 병아리 혈장을 얇게 바르고 슬라이스를 덮을 수 있도록 최소한의 트롬빈 처리 혈장을 덮습니다.

슬라이스가 뜨면 구름이 제거될 때 부착된 상태로 유지되지 않습니다. 다음으로 2.5마이크로리터의 혈장과 2.5마이크로리터의 트롬빈을 별도의 튜브에 혼합합니다. 이 혼합물 2.5마이크로리터를 슬라이스와 피펫 위와 주위에 빠르게 놓고 부드럽게 위아래로 섞습니다.

이전에 롤러 튜브에 부착된 실리콘 고무 접착제의 노출된 면에서 투명한 플라스틱 덮개를 제거합니다. 그런 다음 브레인 슬라이스가 있는 커버슬립을 접착제에 놓고 구멍 안의 슬라이스를 정렬합니다. 접착력을 보장하기 위해 엄지 손가락으로 커버 슬립을 균일하게 눌러 커버 슬립을 부드럽고 균일 한 압력으로 가하고 약 1 분 동안 유지하면서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.

누출 없이 튜브에 부착하기 위해 커버슬립에 가해지는 압력은 적절해야 하며 돌출부의 공기 채널을 제거할 수 있을 만큼 충분히 오래 유지되어야 합니다. 너무 많은 압력을 가하면 커버슬립이 깨질 수 있습니다. 생물 안전 캐비닛에서 각 튜브에 0.8ml의 완전 neurobasal a 배양 배지를 추가합니다.

그런 다음 클램프로 단단히 고정된 멸균 면으로 연결된 파스퇴르 피펫을 통해 5%의 이산화탄소와 95%의 공기 혼합물을 흐릅니다. 이를 사용하여 롤러 튜브를 가스 혼합물로 세척하고 피펫 주변에서 튜브를 빼낼 때 튜브를 빠르게 캡핑합니다. 그런 다음 튜브에 슬라이스 번호와 랙 번호를 표시합니다.

튜브를 롤러 랙에 삽입하십시오. 기하학적으로 균형을 이루고 있는지 확인합니다. 홀수의 튜브가 있는 경우 빈 튜브를 추가하여 균형을 맞춥니다. 랙을 섭씨 35도의 롤러 인큐베이터에 넣고 롤러가 롤러 랙을 시간당 10-13회 회전으로 돌립니다.

인큐베이터의 전면을 보드에 올려 인큐베이터를 약 5도 뒤로 기울입니다. 슬라이스 배양이 있는 튜브를 여기에 표시된 것과 같은 맞춤형 튜브 홀더로 옮깁니다. 그런 다음 튜브 홀더를 스테이지 어댑터에 넣어 이미징하는 동안 커버슬립을 대물렌즈에 수직으로 유지합니다.

그런 다음 스테이지 어댑터의 슬라이더를 튜브에 단단히 밀어 튜브를 제자리에 고정합니다. 명시야 투과 조명에서 4배 대물렌즈를 사용하여 슬라이스 아래의 사진 에칭 그리드 기간에 초점을 맞춥니다. 초기 이미징 세션의 경우, 슬라이스 주위를 빠르게 스캔하여 더 높은 배율의 이미징이 필요한 다양한 영역의 번호를 찾고 기록합니다.

관심 영역이 식별되면 관심 영역이 포함된 첫 번째 그리드 사각형으로 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 20 강도 오류 목표로 전환하고 기준 표시를 찾습니다. 그런 다음 더 높은 전력 목표로 전환하고 동일한 기준 표시를 지역화하고 스테이지의 x 및 y 위치를 기록합니다.

스테이지를 이동하여 근처에 있는 다른 관심 필드를 찾고 기준 마크에서 x 및 y 오프셋을 기록합니다. 오프셋 위치를 사용하면 튜브 또는 스테이지 어댑터를 제거하고 교체할 때 기준 표시의 원래 x, y 설정이 변경되더라도 슬라이스를 이미징할 때 동일한 커버슬립 위치를 일관되게 파악할 수 있습니다. microscope objective control 또는 Piezo stage control(사용 가능한 경우)을 사용하여 선택한 각 필드 내에서 이미지 Z-stick을 캡처합니다.

여기에 표시된 이미지의 컨포칼 스택은 신경 세포의 바이탈 염료를 사용하여 신경돌기와 세포체의 3D 구조를 강조하지만 염색은 핵에서 제외됩니다. 장기 배양 중 슬라이스 내 성장 슬라이스 형태 및 생존력의 시간에 따른 변화를 조사하기 위해 이미징 24시간 전에 동일한 슬라이스에 일주일에 한 번 형광 뉴런 바이탈 염료로 라벨링했습니다. 시간 경과에 따른 동일한 세포 이미징의 재현성을 입증하기 위해 13일에 뉴런 바이탈 염료로 표지된 슬라이스의 동일한 필드를 14일, 15일, 16일 및 17일에 이미징했습니다.

매일 3개 세포의 위치는 핵 위에 기호로 표시됩니다. 신경 세포의 필수 염료 외에도 바이러스 매개 형광 단백질을 이 시스템과 함께 사용하여 세포를 라벨링할 수 있습니다. 여기에서 칼슘에 민감한 보고자와 코필린 함유 간상체는 감염 후 10일이 지나면 명확하게 식별할 수 있습니다.

이 절차를 성공적으로 구현하려면 모든 튜브, 커버슬립 및 용액을 미리 준비해야 합니다. 짧은 사후 분석 간격으로 슬라이스를 얻을 수 있는 것도 성공에 매우 중요하며 많은 연습이 필요합니다. 이 기술을 마스터하면 약 90분 안에 수행하여 해부 및 도금 시간을 포함하여 새끼 쥐에서 12-18개의 해마 조각을 얻을 수 있습니다.

이 절차에 따라 뇌 절편은 형광 표지된 단백질의 세포 유형 특이적 발현을 달성하기 위해 바이러스에 여러 번 감염되거나 유전자 기능을 조사하기 위해 작은 간섭 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA로 유전자 발현을 위해 침묵할 수 있습니다. 재조합 바이러스로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이러한 시약으로 작업할 때는 항상 보안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.