Name: 정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 수정된 롤러 튜브 방법을 사용하여 포유류 뇌 조각을 장기간 배양하고 동일한 뉴런을 반복적으로 고해상도 이미징하는 기술입니다. 이 방법은 신경 발달 및 퇴행성 뇌 질환 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+neuronal+circuits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).</li>
<li>Roo, M. D., Ribic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+structural+plasticity+of+dendritic+spines+in+organotypic+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture.</a> Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).</li>
<li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li>
<li>Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cofilin-actin+rods+in+stressed+hippocampal+slices+and+the+role+of+cdc42+in+amyloid-beta-induced+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods.</a> J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents%2C+monkeys%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Rahman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+rods+and+aggregates+concur+with+tau+pathology+and+the+development+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li>
<li>Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li>
<li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).</li>
<li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li>
<li>Matsushita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+can+be+efficiently+produced+without+helper+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.</a> Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+of+rAAV+vector+into+the+AAVS1+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region.</a> Virology. 433 (2), 356-366 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).</li>
<li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26611582">Lentivirus production and purification.</a> Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).</li>
<li>Huang, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoprocessing+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+miniprecursor+fusions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells.</a> AIDS Res Ther. 7, 27(2010).</li>
<li>Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibson+assembly%3A+an+easy+way+to+clone+polyviral+full-length+infectious+cDNA+clones+expressing+an+ectopic+VPg%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg.</a> Virol J. 12, 89(2015).</li>
<li>Er, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuO%3A+a+fluorescent+chemical+probe+for+live+neuron+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+aggregation+blocks+intracellular+trafficking+and+induces+synaptic+loss+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons.</a> J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).</li>
<li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).</li>
<li>Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-secretase-cleaved+amyloid+precursor+protein+accumulates+at+actin+inclusions+induced+in+neurons+by+stress+or+amyloid+beta%3A+a+feedforward+mechanisms+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).</li>
<li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+dimers%2Ftrimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10(2011).</li>
<li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).</li>
<li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A%CE%B2+pathologies%3A+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6(2015).</li>
<li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS%3A+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li>
</ol>

여기에 설명 된 롤러 튜브 메서드 장기 배양 및 슬라이스 뇌 조직의 고해상도 라이브 이미징에 대 한 수 있습니다. 장착 및 유지 보수의 조각에 슬라이스 기법으로 여기 적용 한 주요 문제가입니다. Coverslip 코팅 슬라이스 접착을 지 원하는 홍보 조각 조각;에서 셀의 마이그레이션 및 neurites의 파생물을 강화 하 여 숱이 따라서, 우리는이 기판의 사용을 피 했다. 3-aminopropyltriethoxysilane와 함께 처리 하 여 유리에 아미노 그룹의 삽입 향상 조각, 준수 하지만 coverslip에 너무 약간 또는 너무 많은 치킨 플라즈마 준수 문제를 슬라이스 잃게 발생할 수 있습니다. 적절 한 접착에 필요한 플라즈마의 볼륨 교양된 뇌 조각의 크기에 따라 이며 따라서 쥐 hippocampal 슬라이스는 약 4 배 더 큰 영역에 마우스 뇌 조각 보다 큽니다. 만약 너무 많은 플라즈마는 조각 아래에서 응고, 세포 접착 하는 coverslip 장애인 이며 plasmin 치료 위치를 변경 하거나 완전히 분리 되도록 분할을...

해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m2 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상1을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된2되었습니다.
두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스3 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭4를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표5를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경6을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화5에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트7에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.
플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한8에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.
우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애9, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD8의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율10,11, 12. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia8, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβo)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.

<table><tbody><tr><td>15cm 배양 접시의 바닥</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>필립스 헤드 머신 스크류 (#10-32)</td><td>에이스 하드웨어</td><td></td><td>2.5" 길이와 3/16" 지름</td></tr><tr><td>플랫 와셔 #10</td><td>ACE 하드웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>머신 스크류 너트 (#10-32)</td><td>ACE 하드웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고무 그로밋&nbsp;</td><td>ACE 하드웨어</td><td></td><td>5/16", 두께; 5/8", 구멍 직경; 1.125", OD</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 (5/16"; OD, 3/16"; ID)</td><td>ACE 하드웨어</td><td></td><td>1.8" 길이로 절단</td></tr><tr><td>잠금 와셔 #10</td><td>ACE 하드웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드릴 프레스, 5 속도&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech 모델 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 평면 튜브</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>드릴 비트, 3 mm, 6 mm 및 15 mm&nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo freud 브랜드</td><td>플라스틱 절단용 드릴 비트.</td></tr><tr><td>목재용 드릴 비트, 1.5cm 및 1mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wood file, 1/4" 원형</td><td>Ace Harware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프링 클립, 16mm 스냅 홀더</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스위블 헤드 디버링 도구, 5"</td> <td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>접착 실리콘 시트(보안 씰)</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>0.5mm 두께</td></tr><tr><td>6mm 홀 펀치</td><td>Office 최대</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm 홀 펀치</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포토테크 커버 슬립, 직경 12mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>나노 순수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-아미노프로필트리에톡실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 듀몬트 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 조직 헬기</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>더블 엣지 면도날</td><td>테드 펠라</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>직경 5.8cm 원으로 절단</td></tr><tr><td>폴리-클로로-트리플루오로-에틸렌 (Aclar)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>5.8 cm 직경의 원으로 절단</td></tr><tr><td>#21 수술용 칼날</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>주걱, 스테인레스 끝이 테이퍼된</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) 용액, 0.2mm 필터 멸균</td></tr><tr><td>닭 플라즈마</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>멸균수, 2500 x g에서 원심분리기, 4°C에서 30분 재수화; C, 액체 질소에 있는 급속 동결 분취액 및 저장&nbsp; -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>트롬빈, 국소 (소)</td> <td>화이자</td><td>트롬빈-JMI</td><td>급속 동결 분취액을 액체 질소에 1,000 국제 단위/mL로 희석액으로 제공하고 -80°C에서 보관합니다. 250 units/mL에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>Cell Roller System</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>롤러 인큐베이터</td><td>Forma</td><td>Model 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM Glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) 용액, 0.2 mm 필터 멸균</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&nbsp;</td><td>완전한 배지: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM 글루타민, 0.180 mL 25% 포도당, 0.250 mL 100x 펜/스트렙.</td></tr><tr><td>3세대 렌티바이러스 패키징</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K 컷오프 원심분리 필터 (Centricon)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>렌티바이러스 클로닝 시스템 (InFusion)</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids 30323, 50856, 51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuronal cell viability dye (NeuO)</td><td>Stemcell technologies</td><td>1801</td><td>한 번 해동하고 4 &micro에서 급속 동결; L 부분 표본. -20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈</td><td>올림푸</td>스 <td>공기: 4X, 20; 오일: 40X, 60X,</td><td></td></tr> <tr><td>회전 디스크 컨포칼 시스템</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>현미경 EMCCD 카메라</td><td>광도</td><td>캐스케이드 II</td><td></td></tr><tr><td>선형 인코딩(x,y), 피에조 z 플랫 탑 스테이지</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 레이저 및 통합</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasmin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0.002 U/mL in 0.1% 소 혈청 알부민(0.2mm 필터 멸균), 액체 질소에서 급속 동결 및 -80°C에서 보관.</td></tr></tbody></table>

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

교양된 설치류 두뇌 분할은 신경 및 그들의 정상적인 vivo에서 상호 작용의 대부분을 유지 하는 환경에서 명과의 세포질이 고 분자 행동을 공부 하 고 유용 합니다. 다양 한 유전자 변형 마우스 라인 또는 붙일 태그가 단백질 또는 야생 타입 두뇌 조각에서 기자 들의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터의 사용에서 얻은 조각 고해상도 이미징 형광 현미경 검사 법에 의해 허용. 비록 뇌 조각, 조각 문화를 결합 하 여 수행 하는 기능을 영상에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다 오래 기간 동안 라이브 분할 영역에 특정 셀의 반복적인 고해상도 이미징 문제 행 세 하고있다. 이것은 최고의 사용자를 보호 하 고 교차 오염을 방지 하는 닫힌된 시스템에서 수행 하는 이후 외 인 단백질의 표현에 대 한 바이러스 성 벡터 사용 하는 경우 이것은 특히 사실. 간단한 수정 롤러 튜브 뇌 조각 문화 방법에 많은 주 동안 조각의 반복 고해상도 이미징 동봉된 시스템에서 허용 하는 보고 됩니다. 경작 photoetched coverslips에서 조각 신속 하 고 정확 하 게 다른 치료 전후 시간이 지남에 동일한 필드를 이미지를 무대 위치를 표준 마크의 사용을 허용 합니다. 예 특정 신경 얼룩 및 hippocampal 조각 건축에서 변화를 관찰 하는 식, 형광 단백질의 바이러스 중재 신경 식 및 cofilin 병리학의 개발이이 방법의 사용에 대 한 표시 됩니다. 이전 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드의 올리고 슬라이스 치료 응답에 Alzheimer의 질병 (광고)의 해 마에서 관찰 되었다.

얼마나 정확 하 게 확인 하려면 표준 마크를 활용할 수 있는 시간이 지남에 같은 필드 내에서 동일한 셀을 이미지 복원, 하 우리 검사 photoetched coverslips (그림 6A)에 성장 하는 조각. 뉴런은 중요 한 염료와 염색 법에 의해 시각 (100 nM 2 h;에 대 한 비 신경 세포를 얼룩이 되지 않습니다)는 셀25를 해치지 않고 시간이 지남에 따라 뉴런에서 사라집니다. 우리는 표준 식별 마크 단일 그리드 스퀘어 (그림 6A, B), 라벨, 후의 중요 한 염료-표시 24 h 지역 발견 기록 x 그리고 y 오프셋 위치 표준 마크 (그림 6의B)에서 수집, 4 연속적인...

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

뇌 절편 배양을 위한 이 변형된 롤러 튜브 방법의 전반적인 목표는 장기 절편 생존을 위한 밀폐된 배양 시스템을 제공하는 것입니다. 반복적인 고해상도 형광 이미징 기능을 갖추고 있습니다. 이 방법은 시냅스 형성 또는 손실에 관여하는 주요 단백질의 국소화와 같이 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 관찰해야 하는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 단백질 발현을 위해 바이러스를 안전하게 사용할 수 있는 완전 밀폐형 배양 시스템과 이미징을 위해 동일한 세포를 국소화하기 위해 포토 에칭된 커버슬립을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 롤러 튜브 내부의 커버슬립에서 슬라이스를 배양할 때 처음 떠올랐지만, 시간이 지남에 따라 살아있는 슬라이스에서 발생하는 변화를 시각화할 수 있는 더 나은 방법이 필요했습니다. 현미경 이미징을 위해 transgenes 및 특정 세포 집단을 발현하기 위해 바이러스 벡터가 널리 사용됨에 따라 사용자를 보호하고 현미경 대물렌즈의 오염을 제거하기 위한 밀폐형 시스템을 개발하게 되었습니다.시간이 지남에 따라 뇌 절편 내의 동일한 세포 집단을 추적할 수 있는 능력은 인간 신경 장애의 설치류 모델에서 병리학적 변화 및 시냅스 변화의 발달에 대한 연구를 가능하게 합니다. 시작하려면 롤러 튜브 랙을 준비하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 롤러 튜브에 구멍을 뚫는 데 도움이 되는 지그를 만듭니다. 지그를 사용하여 평평한 면이 1cm의 플라스틱 배양 튜브를 제자리에 고정하여 평평한 면이 위를 향하도록 합니다.그런 다음 중심이 바닥에서 1cm 떨어지고 튜브 측면 사이의 중앙에 6mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 회전식 디버링 도구를 사용하여 구멍의 가장자리를 매끄럽게 만들고 구멍의 안쪽 가장자리에 4개의 홈을 만들어 회전 중에 구멍을 쉽게 배수할 수 있습니다. 다음으로, 튜브를 70% 에탄올로 헹구고 생물학적 안전 캐비닛에서 자연 건조합니다.UV 램프 아래에서 40분 동안 약 12mm 펀칭 접착 실리콘 고무 디스크의 튜브를 살균합니다. 20분 후 노출된 모든 표면이 멸균되도록 튜브와 디스크의 위치를 변경합니다. 그런 다음 접착 디스크에서 흰색 뒷면을 떼어내고 구멍을 정렬한 다음 실리콘 고무를 튜브 외부에 부착합니다.슬라이스를 얻으면 준비된 커버 슬립의 사진 에칭 면 중앙에 2 마이크로 리터의 치킨 플라즈마를 놓습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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이 비디오는 설치류 모델에서 뇌 절편을 장기간 배양하기 위한 수정된 롤러 튜브 방법을 보여줍니다. 먼저, 뇌 절편을 커버슬립에 부착합니다. 그런 다음 평평한 면에 구멍이 있는 편평한 롤러 튜브를 취하고 접착 디스크를 사용하여 커버슬립을 구멍에 배치합니다. 마지막으로, 영양 매체와 이산화탄소 및 공기 혼합물을 튜브에 첨가하고 튜브를 롤링 동작으로 배양합니다.

설치류 뇌 절편의 장기 배양을 위한 수정된 롤러 튜브 방법

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

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여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

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배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

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FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

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정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

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