Name: 포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 포르말데히드 기반 FAIRE 방법을 사용하여 포유류 세포의 크로마틴 접근성을 분석하는 기법입니다. 이 비용 효율적인 프로토콜은 특수 장비 없이도 유전자 조절 연구에 활용됩니다.

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저자는 친절 하 게 공유 쥡니다 장치에 대 한 Tilman Borggrefe (Giessen의 대학)를 감사 하 고 싶습니다. M.L.S.에서 일 도이치 가운데 (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, 우수 클러스터 심장-폐 시스템 (ECCPS, 147/2 실), 독일 Krebshilfe (111447)와 IMPRS HLR 프로그램에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 최대 Planck 학회.

1. 주 1: 세포 배양
<ol><li>원하는 금액에 분석할 셀 문화. 세포 배양 조건 및 미디어 조사 셀 형식에 따라 달라 집니다. 참고: 원칙적으로, 모든 진 핵 세포는 의무가 넘어갈 여 chromatin 접근성의 분석. 이 실험에 대 한 4 x 106 HEK 293T 세포는 10% (v/v) FBS와 1% (w/v) 페니실린/스, 보충 하 고 5% CO2 와 셀 70-80%의 합류를 도달할 때까지 24 시간 동안 37 ° C에서 incubated DMEM 매체에 단일 10 cm 접시에 시드 (~ 8 x 10 6 셀 접시 당)입니다.</li>
</ol>2. 주 2: 포름알데히드 가교와 셀 수확
주의: 포름알데히드는 매우 독성이 고 증기 두건에서 항상 사용 해야 합니다. 착용 보호 옷 (장갑 및 실험실 외 투). 폐기물을 적절 하 게 삭제 합니다.
<ol><li>1% (v/v) (세포 배양 매체의 10 mL을 37% (v/v) 포름알데히드의 270 µ L)의 최종 농도 도달 하는 증기 두건에서 세포 배양 매체에 직접 포 름 알 데히드를 추가 합니다. 실내 온도 (20-25 ° C)에서 10 분 동안 incubate 고 슬루 판 수동으로 모든 2 분. 참고: 가교 시간 셀 형식을 조정할 수 있습니다. 셀 라인의 대부분에 대 한 가교의 10 분의 적절 한입니다. 조직에 대 한 더 이상 외피 수 있도록 모든 셀의 고정 해야 수 있습니다.</li>
	<li>해소는 포 름 알 데히드 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가 (문화 매체의 10 mL를 2.5 M 글리신 주식 500 µ L 추가). 실 온에서 5 분 동안 incubate 고 슬루 마다 2 분.</li>
	<li>3 세포를 씻어 얼음 차가운 PBS와 x (8 g/L NaCl, KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0.24 g/L KH2포4, 0.2 g/L 조정 7.4 HCl 이나 NaOH를 pH). 매체를 발음 하 고 PBS의 10 mL를 추가 하 여 셀 문화 접시 또는 플라스 크에 직접 씻어. 두 번 느슨하게 부착 세포 HEK 293T 같은 경우 매우 조심 하 고이 단계를 반복 합니다. 추가 PBS 신중 하 게 접시의 측면에는 세포의 분리를 피하기 위하여.</li>
	<li>3 세척 후 1 ml의 얼음 차가운 PBS와 얼음에 1.5 mL 반응 관에 셀 resuspend. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 필요한 경우 셀을 분리. 참고: 시작할 때 제한 된 소재, 손실을 방지 하기 위해 샘플 절차 동안 낮은 DNA 바인딩 튜브를 사용 합니다.</li>
	<li>300 x g 냉각된 탁상 원심 분리기에 4 ° c에서 5 분 동안 원심 분리기. 신중 하 게 그것을 발음으로 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
</ol>3. 세포 세포의 용 해 및 Chromatin 조각화
<ol><li>1 mL 랑 세포의 용 해 버퍼 (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptin, 10 µ g/mL aprotinin, 2 밀리미터 PMSF)에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 신중 하 게 여러 번 위아래로 pipetting으로 셀을 resuspend. 얼음에 20 분 동안 품 어. 필요한 경우이 단계에서-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>가교 된 200-300 bp의 평균 크기를 기울이려면 DNA sonicate sonicator의 특정 설정은 사용된 쥡니다 장치와 샘플의 각 소스에 대 한 결정 되어야 합니다. 어떤 경우에 DNA 전단 효율적으로 보장 합니다. DNA 전단에 대 한 최적화 단계 단계 5.14 설명 되어 있습니다. 샘플의 난방을 피하기 위해 쥡니다 동안 얼음에 샘플을 냉각 한다.</li>
	<li>15 분 및 4 ° c.에 13000 x g에 대 한 샘플을 원심</li>
	<li>새로운 반응 관에는 상쾌한을 전송. 100 µ L aliquots에서 샘플을 분할. 필요한 경우-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 참고: 프로토콜이 시점에서 중단 될 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 제어 DNA의 드 가교
<ol><li>Aliquot 단계 3.4는 crosslink 반대 하 고 총 DNA에 대 한 참조로 사용할 수에서 100 µ L을 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>10 µ L의 성분 K (20 mg/mL)를 추가 합니다. 프로그래밍 가능 온도-블록을 사용 하 여 37 ° C에서 4 시간 그리고 6 h 65 ° C 단백질을 쪼개 고 리버스는 crosslinks에서 품 어. 마지막으로, 샘플 4 ° C에서 프로토콜 다시 시작할 때까지 누른 다음 5 단계로 진행 합니다. 참고: 다른 시 키 프로토콜 참조, 따라서 데 가교11에 대 한 필요성을 폐지로 가교 화 되지 않은 세포에서 chromatin 샘플을 사용 합니다. 이러한 샘플은 하지 쥡니다 효율 또는 DNA 안정성 가교 된 차이 이어질 수 있는 사실은, 따라서 총 DNA 참조 샘플을 받은 테스트 샘플으로 동일한 절차를 사용 하 여 더 정확 하 게 이다.</li>
</ol>5. 주 3: 페 놀: 클로 프롬 정화 DNA의
<ol><li>3.4 단계에서 aliquot는 비-드-가교 된 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>비 데 가교 된 aliquot 양식 단계 5.1와 드-가교 된 샘플 단계 4.2에서에서 하 고 동시에 진행. H2O 도달 300 µ L의 최종 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>증기 두건 및 소용돌이에서 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1)의 300 µ L를 적극적으로 추가 합니다. 주의: 페 놀 부식성 이며 독성이 고 연기 후드를 항상 사용 해야 합니다. (장갑 및 실험실 코트) 보호 옷을 입고, 반응 관 긴밀 하 게 폐쇄 하 고 폐기물을 적절 하 게 처분.</li>
	<li>4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>신중 하 게 새로운 반응 관에 위 수성 단계의 280 µ L를 전송. Interphase는 또한 단백질을 포함에서 어떤 파편 든 지를 취할 수 없어 있는지 확인 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 낮은 단계를 삭제 합니다.</li>
	<li>5.3-5.5 단계를 반복 하 고 신중 하 게 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 270 µ L를 전송.</li>
	<li>증기 두건 및 소용돌이에서 클로 프롬의 270 µ L를 적극적으로 추가 합니다. 참고:이 단계는 샘플에서 모든 나머지 페 놀을 제거 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>신중 하 게는 interphase에에서 어떤 파편 든 지를 수행 하지 않도록 주의 복용 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 250 µ L를 전송 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>5 M NaCl의 25 µ L 소 프로 파 놀의 250 µ L를 추가 합니다. DNA 운반대로 글 리 코겐 (20 mg/mL)의 5 µ L를 추가 합니다. 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. DNA를 침전 하 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 원심 분리기.</li>
	<li>70% (v/v) 에탄올의 400 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	<li>상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 펠 릿 실 온에서 10 분 동안 건조 하자. 100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA)에 resuspend.</li>
	<li>간 DNA crosslinks 제거를 65 ℃에서 4 h에 대 한 비 데 가교 화 무료 DNA 샘플을 품 어. -20 ° c.에 샘플 저장</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 양을 계량 하 고 2% (w/v) agarose 젤에 조각 크기를 확인 하는 약 수를 실행 합니다. 전단 시간과 농도 조정할 agarose는 DNA 크기 분석의 결과 따라 젤 전기 이동 법, 200-300 bp의 평균 크기를 얻을.</li>
</ol>6. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 무료 대 총 DNA의 결정
<ol><li>(다음 무료 DNA 라고 합니다)에 nucleosome 무료 DNA의 비율 대 총 DNA qRT-PCR17,18에 의해 결정 됩니다. 샘플은 microarray 교 잡 또는 게놈 넓은 결정을 위한 깊은 시퀀싱에 의해 양이 많게 분석 수 있습니다 또한.</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 컨트롤 및 테스트 영역에 대 한 정량 Pcr 뇌관 디자인. 참고: 적합 한 긍정적인 컨트롤은 ACTB, GAPDH, TPI1, TUBA1A 등 적극적으로 베낀된 하우스키핑 유전자의 발기인에 뇌관 (β-말라, GAPDH, TPI 또는 α-Tubulin 인코딩). 적절 한 부정적인 컨트롤 섬으로 지역 또는 유전자 사막에서 발견 된다. 게놈 지역 조사 로컬 복사본 번호 차이 (표 1)에 대 한 제어를 동적으로 레 귤 레이트 된 소재 시에 인접 한 다른 적합 한 부정적인 컨트롤을 디자인할 수 있습니다.</li>
	<li>TE 버퍼 10 ng / µ L의 최종 농도에 DNA 샘플을 희석 하 고 최종 계산에 대 한 계정에 희석 요인 (단계 6.5 참조).</li>
	<li>다음 반응 믹스 잘 당 96 잘 접시에 triplicates에서 정량 반응 설정: 템플릿 DNA: 20 (2 µ L), 앞으로 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L), 역방향 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L) 녹색 염료 (2 배 재고에서 5 µ L), 및 H2O 10 µ L를 포함 하는 반응 혼합을 사용 하 여 상업적인 준비.</li>
	<li>절대 부 량 모드를 사용 하 여 실시간 정량 Pcr 장치에서 실행 하 고 다른 뇌관 쌍으로 샘플의 Ct를 결정. 단계 6.3에서에서 희석 요인 고려 하는 다음 수식을 사용 하 여 각 뇌관에 대 한 총 DNA에 무료 한 DNA의 회복의 비율을 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq1.jpg"> 대표 결과 예제 계산 표 2에 제공 됩니다.</li>
	<li>샘플 간의 차이 대 한 보상, 긍정적인 통제 복구 비율에 정상화: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

넘어갈은 nucleosome 무료 지역 식별 수 있도록 강력 하 고 저렴 한 방법입니다. 그것은 nucleosomes를 감싸 DNA는 히스톤에 가교 된 수 쉽게 원칙을 기반으로 합니다. 페 놀: 클로 프롬 적 출 그리고 interphase (그림 1)에서 어느 정도 낮은 페 놀 단계에서 발견 되는 단백질 바인딩 DNA에서 비 가교 화와 단백질 없는 DNA 파편을 분리 하는 데 사용 됩니다. 따라서, nucleosome 무료 지역 무료 DNA의 분수에서 overrepresented 수성 단계에 있습니다. 간행물의 수 시 키 방법23,24,25,26, 여기에 설명 된 절차를 보완 하기 위해 상담 될 수 있는 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
마찬가지로 염색 질 구조를 결정 하는 데 사용 하는 다른 방법에 넘어갈 메서드 또한 비판적으로 달려 있다 DNA의 최적의 전단. 조각을 너무 긴 경우에, 어떤 nucleosome 무료 지역 인접 chromatin 바인딩된 DNA에 의해 마스크 됩니다. 조각이 너무 작은 경우, 정량 또는 깊은 시퀀싱에 의해 검출 매우 어려워집니다. 이러한 이유로, DNA의 쥡니다 제어 하 고 조각 주위를 얻기 위해 최적화 해야 하는 중요 한 매개 변수는 1-2 nucleosomes (그림 4)를 대표 하는 200-300 bp 길이.
최종 결과 영향을 미칠 수 있는 다른 매개 변수는 샘플의 가교 이다. 여기에 설명 된 고정 절차는 대부분 세포 라인에 대 한 유효, 비록 연구원 해야 합니다 신중 하 게 연구, 특정 샘플에 대 한이 단계 특히 사용할 때 평가 조직, 어디 긴 고정 시간을 허용 해야 할 수도 있습니다는 모든 조직 샘플에서 세포를 도달 하는 포름알데히드.
다른 메서드와 달리 DNase 같은 또는 micrococcal nuclease 과민성, 칩, 또는 ATAC, 시 키에 의존 하지 않는 효소 활동 또는 특정 항 체, 그리고 따라서 그것은 적정 또는 반응 조건의 최적화 필요 하지 않습니다. 이것은 시 키 염색 질 chromatin 필드에서 조금 경험을 가진 실험실에 대 한 내게 필요한 옵션을 측정 하는 이상적인 방법 있습니다. 또한, 파일럿 실험만 DNA 전단 단계와 가교 시간을 최적화 하는 데 필요한 필요한 경우.
메서드를 처음 개발한 것 효 모6, 하지만 그것은 또한 포유류 세포에 확장 되었습니다. Chromatin의 게놈 넓은 특성을 수 있도록 깊은 시퀀싱 시 키 방법으로 정화 하는 DNA는 사용할 수 있습니다. 이것은 이미 연구8,9,10,11,12,13,,1927, 의 수에 유용한 입증 28.
시 키-seq 실험 결과 차이가 발생 하지만 큰 오버랩 DNase-seq14, 등 다른 방법으로 얻은 결과 표시. 이 예를 들면 편안한 또는 리 모델링 nucleosomes 여전히 DNase에 의해 분열을 방해 수 방법론 차이, 이러한 DNA 영역 DNA/단백질 crosslinks를 생산 하는 경향이 덜 될 것 이라고 따라서 결정으로 nucleosome 무료 시 키9를 사용 하 여 영역입니다. 또한, 비 히스톤 단백질 RNA polymerases와 같은 또는 epigenetic 마크 리더 단백질의 존재 수 DNA/단백질 crosslinks 되며 따라서 넘어갈 실험에서 단백질 포장 영역으로 해석 될 것 이다. 이러한 한계는 chromatin 상태, 따라서 포괄적인 통찰력을 얻기 위해 다른 방법의 조합을 사용 하는 필요를 제기의 결정에 사용 되는 모든 방법에.

진 핵 세포의 게놈 DNA는 단단히 nucleosomes 제거 하거나 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 허용 하기 위하여 개조 하는으로 포장 됩니다. 유전자의 transcriptional 활성화 일반적으로 이끌어 낸다1+ 1 nucleosome 특히, nucleosomal 구조의 더 오픈 구성 RNA 중 합 효소에 의해 전사를 촉진 하기 위하여. 또한, 발기인, 증강 등의 규제 지역 chromatin 한정자 또는 녹음 방송 요인2와 상호 작용 수 있도록 그들의 chromatin 접근성에서 동적인 변화를 겪는 다. 몇 가지 방법은 이러한 nucleosome 무료 영역을 식별 하기 위해 개발 되었습니다. 이들은 DNase 같은 nucleases에 감도 나3 또는 micrococcal nuclease4그것은 하지 단단히 감싸 nucleosomes 때 DNA만 액세스할 수 있습니다. 오픈 chromatin 또는 무료 DNA의 식별을 위한 다른 방법을 포함 retrotransposable 요소 (ATAC 염색 질 Transposase 액세스할 수에 대 한 분석 결과)의 중재 하는 transposase 통합5또는 chromatin immunoprecipitation (칩)을 사용 하 여 히스톤에 대 한 항 체 넘어갈 방법은 DNA를 도달 하는 효소의 용량 또는 특정 단백질에 항 체의 바인딩을에 기반 하지 않은 하지만 페 놀: 클로 프롬 추출6,7nucleosome 무료 지역 정화에 의존 하는 대신. 이 방법에서는, DNA chromatin 단백질 covalently 가교 에이전트 포 름 알 데히드에 의해 바인딩되어 고 쥡니다에 의해 작은 조각 나중 전단. 그러나 DNA 영역 또는 몇 nucleosomes 거의 비슷하게 가교 된 DNA/단백질 복합물 해야한다 단단히 포장된 chromatin 지역 풍부한 DNA/단백질 crosslinks, 있을 것 이다. 페 놀: 클로 프롬 추출 정화를 비-가교 된 단백질을 DNA 가교 된 동안 수성 단계에서 무료 DNA 유기 페 놀 단계 또는 단백질 함께 수성 유기 interphase 캡처 수 있습니다. 총 DNA 샘플의 기준에 비해이 무료 DNA의 정량화 chromatin 무료 지역 식별 수 있습니다. 넘어갈 메서드를 사용 하면 여기에 설명 된 대로 개별 게놈 지역 특성에 대 한 사용할 수 있지만 다른 모델8 에 설명 된 대로 깊은 시퀀싱을 결합 하면 게놈 넓은 chromatin 접근성의 식별에 적합 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 시 키-seq와 ATAC seq 같은 다른 방법에 의해 얻은 결과 크게14를 중복. 넘어갈 방법은 매우 강력, 저렴 한, 그리고 nucleosome 무료 영역을 식별 하는 방법을 수행 하기 쉬운. 다른 메서드와 달리 nucleases (DNase seq, MNase-seq) 또는 transposases (ATAC-seq)에 필요한 소화의 적절 한 수준을 결정 하는 시범 실험을 필요 하지 않습니다 그것과 최근 검토15에서 자세히 설명. 조정 해야 하는 유일한 매개 변수는 쥡니다 조건 및 어떤 경우에 고정 시간 있습니다. 이 문서에서는 간단한 프로토콜을 개요로 그림 1 에 표시 되 고 그는 sonicator 이외의 어떤 특별 한 장비를 필요 하지 않습니다 설명 합니다. 프로토콜은 합리적으로 짧은 시간에 수행할 수 있습니다 그리고 다양 한 1 차 셀 마우스 간16에서 얻은 폐 세포11 에서 배열 하는 다른 세포 유형 chromatin 내게 필요한 옵션을 테스트 하는 쉽고 안정적인 방법 시 키 게.

<table><tbody><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐, 20 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB1162B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 20 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, 10 mg / ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>시그마</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>시그마</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>시그마</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>milliTUBE 1ml AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td></td></tr><tr><td>홀더 milliTUBE 1ml</td><td>Covaris</td><td>500371</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 집속 초음파 발생기</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR 시스템</td><td>응용 바이오시스템</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류 세포에 측정 chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Extracellular 신호, 즉, 조직 및 계보 특정 유전자 전사, 응답에 적절 한 유전자 발현은 비판적 chromatin 조직의 높은 정의 상태에 따라 달라 집니다. 핵의 동적 아키텍처는 여러 메커니즘에 의해 제어 됩니다 고 transcriptional 출력 프로그램 모양. 그것은, 따라서, 선호 독립적인 실험 가변성의 잠재적으로 혼동 원천이 될 수 있는 항 체에서 신뢰할 수 있는 패션에 로커 스 특정 chromatin 접근을 결정 하는 것이 중요. 다양 한 방법으로, Formaldehyde-Assisted 절연의 규제 요소 (시 키) 분석 결과 포함 하 여 셀의 상대적으로 낮은 수에서 일반 chromatin 접근성의 결심을 허용 하는 chromatin 접근성을 측정할 수 있습니다. 여기는 낮은 단백질 인 게놈 영역, 신뢰할 수 있는, 간단 하 고 빠른 식별 수 있는 시 키 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법에서는 DNA covalently 교차 결합 시키는 대리인으로 포름알데히드를 사용 하 여 염색 질 단백질에 바인딩된 이며 작은 조각에 전단. 무료 DNA 이후에 페 놀: 클로 프롬 적 출을 사용 하 여 농축입니다. 무료 DNA의 비율 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 또는 전체 DNA를 나타내는 컨트롤 샘플에 비해 DNA 시퀀싱 (DNA-seq)에 의해 결정 됩니다. 패자 chromatin 구조와 지역 무료 DNA 샘플, 낮은 chromatin 압축 게놈 영역 식별 되므로 농축 됩니다.

게시 된19로 HEK293T 세포에 MHC 종류 II 유전자의 chromatin 접근성에 차이 측정을 넘어갈 방법을 사용 했습니다. MHC 클래스 II 인코딩 유전자는 항 원 제시 세포 (Apc), constitutively 또는 cytokine20신호에 대 한 응답에 표시 됩니다. MHCII 유전자의 표현 XY 상자, 발기인 및이 유전자21,22의 강화 되 나 특정 DNA 요소에 바인딩하는 활성기 복잡 한에 의해 구동 됩니다. 이 MHC 종류 II 유전자 HLA DPB1 및 HLA-DMA에서 선택 된 영역의 우리의 시 키 분석에 의해 계시 된 대로, chromatin의 수준에서 반영 됩니다. 이 실험 동안 유전자 시체 (그림 2)에서 더 조밀한 XY 상자를 포괄 하는 지역에는 염색 질은 보여주었다.
예를 들어, 특정 실험에서 계산에 대 한 우리는 총을 희석 DNA 샘플 10 배 (희석 요인 10), 그리고 무료 DNA 샘플 희석 하지은 (희석 비율 1) qRT-PCR를 위한. Cts 테스트 하는 다른 지역에 대 한 고 최종 복구 비율 및 상대 복구 비율 계산에 나열 된 표 2. 이러한 상대 복구 비율 긍정적인 컨트롤로 ACTB 발기인을 사용 하 여 얻은 했다. 참고 그림 2에 표시 된 결과 생성 하는 데 사용 하는 복제의 한이 계산 됩니다.
다른 문맥에서는, chromatin 접근성 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 모델에서 테스트 되었습니다. 이 경우에, chromatin 압축 프로-염증 성 자극 종양 괴 사 인자 (TNF)에 대 한 응답의 급격 한 변화를 측정 했다. 헬러 세포 치료 또는 TNF와 자극 시 키 인코딩 TNF 반응 사이토카인 인터 루 킨 8 (IL8) 유전자의 발기인 지구 제어 식에서 chromatin 압축을 측정 하 여 다음 1 시간 남았다. 이러한 결과 TNF 자극 세포 (그림 3)의 IL8 발기인에 강하게 증가 chromatin 접근성을 보였다. TNF 자극 후 IL-8 발기인에 접근성이 규제 지역에서 개장 하는 chromatin 극적인 보여주는 ACTB 발기인에 있는 보다도 높습니다. 으로 얻은 복구 비율이 경우 긍정적인 제어 (ACTB 발기인)로 사용 하는 지역에서 얻은 것 보다 더 높은 상대 복구 비율 보다 높은 수준 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig1.jpg"> 그림 1:이 시 키 워크플로. 셀 포 름 알 데히드 (A)를 추가 하 여 세포 배양 플라스 크 또는 접시에 직접 가교 된 있습니다. 포 름 알 데히드의 냉각 후 셀 얼음 차가운 PBS (B)로 세 번 세척 하 고 넘어갈 세포의 용 해 버퍼에서 resuspended 하 고 (C) DNA를 기울이려면 sonicated 반응 관에 전송. 추출된 chromatin의 한 약 수 총 DNA 참조 (D)에 65 ° C에서가 열 하 여 드-가교 화 이며 나중 무료 DNA 페 놀: 클로 프롬은 가교 화와 드-가교 된 aliquots (E)에서 모두를 사용 하 여 추출 됩니다. 마지막으로, DNA 정량 하 고 DNA는 총 대 무료의 비율 계산 (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig2.jpg"> 그림 2: HEK293T 세포에 MHC 종류 II 유전자에서 chromatin 접근성의 클러스터. HEK293T 세포는 시 키에 의해 분석 되었다. 사이의 비율 총 DNA 대 무료 (즉,., 상대 복구 비율) ACTB 유전자의 발기인에 대 한 긍정적인 통제, 부정적인 컨트롤로 chr. 12에 섬으로 지역 규제 지역 및는 MHC의 유전자 시체로 결정 했다 클래스 II 유전자 HLA-DMA와 HLA DPB1 상부는 로커 스의 도식 표현 및 뇌관의 위치를 보여줍니다. 오차 막대는 두 생물 복제 triplicates 측정에서 표준 편차를 나타냅니다. 그림19게시 된 보고서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig3.jpg"> 그림 3: TNF 치료에 대 한 응답에서 IL8 발기인에 DNA 접근성의 변화. HeLa 세포는 TNF와 자극 했다 (20 ng/mL) 1 h와 시 키에 의해 분석. 사이의 비율 DNA ACTB (긍정적인 제어)의 발기인, chr. 12 (부정적인 제어), 섬으로 지역 및 IL8 발기인에 대 한 결정은 총 대 무료. 오차 막대는 3 생물 복제 중복 측정에서 평균 (SEM)의 표준 오류를 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57272/57272fig4.jpg"> 그림 4: 쥡니다 조건의 최적화. Chromatin 293T 세포에서 추출한 집중된 sonicator 적절 한 튜브 (자료 테이블)와 함께 사용 하 여 sonified 했다. chromatin 30의 반복으로 지정 된 시간 동안 sonicated은 다음 설정 사용 하 여 s: 피크 파워 150, 듀티 계수 15, 버스트 500, 초당 사이클 버스트 500 초당 사이클 듀티 계수 15, 30 s: 피크 전력 2.5 다음. 결과 chromatin 드-가교 화, 2 %agarose 젤에 로드 및 페 놀: 클로 프롬 추출에 의해 순화 했다. ethidium 평범한 사람 젤을 얼룩이 표시 되 고 분자량 마커의 위치 혈압에 표시 됩니다. 이 실험에서 최적의 chromatin 크기 (200-300 bp) 쥡니다의 20 분 후 얻은 것입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/57272fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-발기인-F</td>
			<td>AAAGGCAACTTTCGGAACGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB-발기인-R</td>
			<td>TTCCTCAATCTCGCTCTCGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12 부정적인 제어-F</td>
			<td>ATGGTTGCCACTGGGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr. 12 부정적인 제어-R</td>
			<td>TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-상자-F</td>
			<td>CATCAGTCACTGGGGAGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-XY-상자-R</td>
			<td>GCTTCCCAGCCCAGTTACAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-F</td>
			<td>GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-5'-R</td>
			<td>AGCTGCTATGTGTGGTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-F</td>
			<td>TGGGGACCTAGTTAGGGAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DMA-3'-R</td>
			<td>AGATCCATGGGAGGAGGCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-상자-F</td>
			<td>GTCCAATCCCAGGGTCACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-XY-상자-R</td>
			<td>TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-F</td>
			<td>GCGTGTTCATGTCTGCATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-5'-R</td>
			<td>TGATCCTCAGAGCCTGGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-F</td>
			<td>CCAGCCTAGGGTGAATGTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DPB1-3'-R</td>
			<td>GCCTGGGTAGAAATCCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 발기인-F</td>
			<td>GTGATGACTCAGGTTTGCCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL8 발기인-R</td>
			<td>CTTATGGAGTGCTCCGGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 정량 Pcr 위한 뇌관입니다.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57272/57272table2.jpg"> 표 2: 예 랑 상대 복구 비율의 계산. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57272/Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

핵 건축의 소성 비 코딩 RNAs, DNA 메 틸 화, nucleosome 위치 뿐만 아니라 히스톤 구성 및 수정 등 동적 후 성적인 기계 장치에 의해 제어 됩니다. 여기는 재현할 싸고 간단 방식 chromatin 접근성의 결정을 허용 하는 Formaldehyde-Assisted 절연의 규제 요소 (시 키) 프로토콜에 설명 합니다.

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

이 실험의 전반적인 목표는 DNA를 관련 단백질에 공유 가교 결합한 다음 유리 DNA의 정제 및 정량화를 통해 유전자 자리의 염색질 접근성을 결정하는 것입니다. 이 방법은 처리되지 않은 세포와 염색질 리모델링을 받는 세포의 세포 유형에 관계없이 DNA 접근성을 결정할 수 있으므로 염색질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각 실험 환경에서 적정해야 하는 DNA나 항체를 절단하기 위해 효소를 사용할 필요가 없다는 것입니다.이 프로토콜은 초음파 처리기 이외의 특수 장비가 필요하지 않다는 추가적인 이점이 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Olesja Ritter와 Tabea Riedlinger인데, 이들은 제 연구실의 박사 과정 학생입니다. 프로토콜을 시작하려면 하루 전에 파종된 세포의 성장 배지에 포름알데히드를 직접 첨가하여 부피 기준 1%부피의 최종 농도에 도달합니다.실온에서 10분 동안 배지를 배양하고 2분마다 수동으로 플레이트를 돌립니다. 다음으로, 포름알데히드를 담금질하기 위해 최종 농도 0.125 몰에 글리신을 첨가합니다. 용액을 실온에서 5분 동안 배양하고 2분마다 돌립니다.배지를 흡입 한 다음 접시 측면에 얼음처럼 차가운 PBS를 조심스럽게 추가하여 세포를 씻습니다. 매체를 흡입하고 조심스럽게 두 번 세척을 반복합니다. 세 번째 세척 후 얼음처럼 차가운 PBS 1ml에 세포를 다시 현탁시키고 필요한 경우 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다.얼음 위의 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 냉각된 탁상용 원심분리기에서 섭씨 300g과 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 조심스럽게 흡입하고 상층액을 버리십시오.1ml의 FAIRE 용해 완충액에 세포 펠릿을 여러 번 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 가교 결합 DNA를 초음파 처리하여 평균 200-300 염기쌍 크기로 공유하고 초음파 처리 중에 샘플을 냉각시켜 샘플 가열을 방지합니다.DNA의 단편화는 단편의 크기가 전체 기술의 용액 감도에 영향을 미치기 때문에 이 실험에서 매우 중요하므로 사전에 초음파 처리 조건을 주의 깊게 설정하고 모든 단일 실험에서 염색질 단편의 크기를 확인하는 것이 중요합니다. 15 분 및 13, 4 섭씨 온도에 000g 동안 표본을 분리기로 만드십시오. 그런 다음 상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다.샘플을 100마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 100 마이크로리터 분취액을 사용하여 교차결합을 역전시키고 전체 DNA에 대한 참조로 사용합니다. 10마이크로리터의 RNase A를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.다음으로, 10 마이크로 리터의 proteinase K.Use를 사용하여 섭씨 37 도에서 4 시간 동안 샘플을 배양 한 다음 섭씨 65 도에서 6 시간 동안 단백질을 절단하고 가교 결합을 역전시킵니다. 새로운 100 μl 부분 표본을 얻고, 10 μl의 RNase A를 첨가한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후, 이전 섹션의 비가교결합 샘플과 비가교결합 샘플을 병렬로 진행합니다.H2O를 첨가하여 최종 부피 300마이크로리터에 도달합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 흄 후드에 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다. 13, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리하십시오.다음으로, 280 마이크로 리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 단백질을 포함하는 계면에서 파편을 취하지 않도록 하고 나머지 하상은 유기 용매 폐기물로 폐기하십시오. 처리를 반복하고 270 마이크로 리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.흄 후드에 270마이크로리터의 클로로포름을 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다. 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 250마이크로리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮기고 계면에서 파편이 나오지 않도록 주의하십시오.남은 샘플은 유기 용매 폐기물로 폐기합니다. 그런 다음 25 마이크로 리터의 5 몰 염화나트륨, 250 마이크로 리터의 이소프로판올을 첨가하고 5 마이크로 리터의 글리코겐을 DNA 운반체로 추가합니다. 튜브를 뒤집어 실온에서 배양합니다.배양 후 샘플을 원심 분리하여 DNA를 침전시킵니다. 다음으로, DNA 펠릿을 400마이크로리터의 70% 부피 에탄올로 세척하고 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 실온에서 10분 동안 건조시킵니다.펠릿이 건조되면 100마이크로리터의 TE 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 교차결합되지 않은 유리 DNA 샘플을 섭씨 65도에서 4시간 동안 배양하여 DNA 간 교차결합을 제거합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 DNA의 양을 정량화하고 작은 부분 표본을 실행하여 2%중량별 아가로스 겔의 단편 크기를 확인합니다.HeLA 세포를 1시간 동안 TNF로 자극하고 FAIRE로 분석했습니다. ACTB의 프로모터, 베타 액틴과 양성 대조군을 암호화하는 유전자, 염색체 12의 헤테로크로마틴 영역, 음성 대조군 및 IL8-프로모터에 대해 유리 DNA와 총 DNA의 비율을 결정했습니다. 서로 다른 초음파 처리 시간을 특징으로 하는 에티듐 브로마이드 염색 겔이 생성되었으며 초음파 처리 20분 후에 200 내지 300 염기쌍의 최적 염색질 크기가 얻어졌음을 나타냅니다.이 기술을 숙달하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 게놈 전체 수준에서 염색질 접근성을 결정하기 위해 심층 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 포름알데히드 및 페놀 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하여 흄 후드에서 작업하고, 장갑을 착용하고, 폐기물을 적절하게 처리하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

관심 있는 특정 게놈 영역과 관련된 분자의 식별은 이러한 영역의 기능 조절 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 특정 게놈 영역과 관련된 단백질 및 RNA를 식별하기 위해 엔지니어링된 DNA 결합 분자 매개 염색질 면역침전(enChIP)을 수행하는 절차를 설명합니다.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

배우세요 포르말데히드 기반 FAIRE 방법을 사용하여 포유류 세포의 크로마틴 접근성을 분석하는 기법입니다. 이 비용 효율적인 프로토콜은 특수 장비 없이도 유전자 조절 연구에 활용됩니다.

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

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