포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

이 실험의 전반적인 목표는 DNA를 관련 단백질에 공유 가교 결합한 다음 유리 DNA의 정제 및 정량화를 통해 유전자 자리의 염색질 접근성을 결정하는 것입니다. 이 방법은 처리되지 않은 세포와 염색질 리모델링을 받는 세포의 세포 유형에 관계없이 DNA 접근성을 결정할 수 있으므로 염색질 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각 실험 환경에서 적정해야 하는 DNA나 항체를 절단하기 위해 효소를 사용할 필요가 없다는 것입니다.

이 프로토콜은 초음파 처리기 이외의 특수 장비가 필요하지 않다는 추가적인 이점이 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Olesja Ritter와 Tabea Riedlinger인데, 이들은 제 연구실의 박사 과정 학생입니다. 프로토콜을 시작하려면 하루 전에 파종된 세포의 성장 배지에 포름알데히드를 직접 첨가하여 부피 기준 1%부피의 최종 농도에 도달합니다.

실온에서 10분 동안 배지를 배양하고 2분마다 수동으로 플레이트를 돌립니다. 다음으로, 포름알데히드를 담금질하기 위해 최종 농도 0.125 몰에 글리신을 첨가합니다. 용액을 실온에서 5분 동안 배양하고 2분마다 돌립니다.

배지를 흡입 한 다음 접시 측면에 얼음처럼 차가운 PBS를 조심스럽게 추가하여 세포를 씻습니다. 매체를 흡입하고 조심스럽게 두 번 세척을 반복합니다. 세 번째 세척 후 얼음처럼 차가운 PBS 1ml에 세포를 다시 현탁시키고 필요한 경우 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다.

얼음 위의 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 냉각된 탁상용 원심분리기에서 섭씨 300g과 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 조심스럽게 흡입하고 상층액을 버리십시오.

1ml의 FAIRE 용해 완충액에 세포 펠릿을 여러 번 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, 가교 결합 DNA를 초음파 처리하여 평균 200-300 염기쌍 크기로 공유하고 초음파 처리 중에 샘플을 냉각시켜 샘플 가열을 방지합니다.

DNA의 단편화는 단편의 크기가 전체 기술의 용액 감도에 영향을 미치기 때문에 이 실험에서 매우 중요하므로 사전에 초음파 처리 조건을 주의 깊게 설정하고 모든 단일 실험에서 염색질 단편의 크기를 확인하는 것이 중요합니다. 15 분 및 13, 4 섭씨 온도에 000g 동안 표본을 분리기로 만드십시오. 그런 다음 상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다.

샘플을 100마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 100 마이크로리터 분취액을 사용하여 교차결합을 역전시키고 전체 DNA에 대한 참조로 사용합니다. 10마이크로리터의 RNase A를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.

다음으로, 10 마이크로 리터의 proteinase K.Use를 사용하여 섭씨 37 도에서 4 시간 동안 샘플을 배양 한 다음 섭씨 65 도에서 6 시간 동안 단백질을 절단하고 가교 결합을 역전시킵니다. 새로운 100 μl 부분 표본을 얻고, 10 μl의 RNase A를 첨가한 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후, 이전 섹션의 비가교결합 샘플과 비가교결합 샘플을 병렬로 진행합니다.

H2O를 첨가하여 최종 부피 300마이크로리터에 도달합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 흄 후드에 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다. 13, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리하십시오.

다음으로, 280 마이크로 리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 단백질을 포함하는 계면에서 파편을 취하지 않도록 하고 나머지 하상은 유기 용매 폐기물로 폐기하십시오. 처리를 반복하고 270 마이크로 리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

흄 후드에 270마이크로리터의 클로로포름을 넣고 격렬하게 소용돌이칩니다. 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 250마이크로리터의 상부 수성상을 새 반응 튜브로 조심스럽게 옮기고 계면에서 파편이 나오지 않도록 주의하십시오.

남은 샘플은 유기 용매 폐기물로 폐기합니다. 그런 다음 25 마이크로 리터의 5 몰 염화나트륨, 250 마이크로 리터의 이소프로판올을 첨가하고 5 마이크로 리터의 글리코겐을 DNA 운반체로 추가합니다. 튜브를 뒤집어 실온에서 배양합니다.

배양 후 샘플을 원심 분리하여 DNA를 침전시킵니다. 다음으로, DNA 펠릿을 400마이크로리터의 70% 부피 에탄올로 세척하고 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 실온에서 10분 동안 건조시킵니다.

펠릿이 건조되면 100마이크로리터의 TE 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 교차결합되지 않은 유리 DNA 샘플을 섭씨 65도에서 4시간 동안 배양하여 DNA 간 교차결합을 제거합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 DNA의 양을 정량화하고 작은 부분 표본을 실행하여 2%중량별 아가로스 겔의 단편 크기를 확인합니다.

HeLA 세포를 1시간 동안 TNF로 자극하고 FAIRE로 분석했습니다. ACTB의 프로모터, 베타 액틴과 양성 대조군을 암호화하는 유전자, 염색체 12의 헤테로크로마틴 영역, 음성 대조군 및 IL8-프로모터에 대해 유리 DNA와 총 DNA의 비율을 결정했습니다. 서로 다른 초음파 처리 시간을 특징으로 하는 에티듐 브로마이드 염색 겔이 생성되었으며 초음파 처리 20분 후에 200 내지 300 염기쌍의 최적 염색질 크기가 얻어졌음을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 게놈 전체 수준에서 염색질 접근성을 결정하기 위해 심층 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 포름알데히드 및 페놀 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하여 흄 후드에서 작업하고, 장갑을 착용하고, 폐기물을 적절하게 처리하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.