오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포 또는 조직에서 관심 있는 긴 비암호화 RNA의 RNA 분자 파트너를 식별하는 것입니다. 이 방법은 긴 비암호화 RNA에 의한 RNA 조절에 대한 새롭고 중요한 지식을 제공함으로써 긴 비암호화 RNA의 생물학적 기능을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 첫 번째는 여러 개의 긴 비암호화 RNAS에 최적화하고 두 번째는 배양된 세포와 조직 추출물 모두에 최적화했기 때문에 대부분의 응용 분야에 사용할 수 있다는 것입니다.

당사의 방법은 이전의 두 가지 방법, 즉 RNA Purifications에 의한 염색질 분리를 의미하는 ChIRP와 RNA 표적의 포획 혼성화 분석인 CHART의 혼합을 기반으로 합니다. 우리 방법의 특이성은 올리고뉴클레오티드 프로브가 긴 비암호화 RNA의 2차 구조에 대한 생물정보학 모델링을 사용하여 설계되었으며 그 목표는 RNA 표적을 식별하는 것이었습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 두 기술자인 Benedicte Boyer와 Severine Guillen이 맡을 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 GH4C1 세포를 배양한 후 세포 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS 1량을 사용하여 세포를 헹굽니다. PBS에 10ml의 1%PFA를 첨가하여 세포를 고정합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 교반하에서 세포를 가교합니다.

1.25몰 글리신 1ml를 첨가하여 PFA 작용을 억제하고 실온에서 5분 동안 샘플을 교반합니다. 그런 다음 흡인에 의해 용액을 버리고 10ml의 PBS를 사용하여 플레이트를 5분씩 두 번 헹굽니다. 다음으로, PBS 1ml를 첨가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수집한 다음 원심분리 튜브로 옮깁니다.

510g과 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 회전시킵니다. 그런 다음 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 무기한 보관하십시오. 조직 가교를 수행하려면 갓 채취한 마우스 뇌하수체 조직 5mg을 PBS의 10X 부피의 1%PFA에 담그고 샘플을 실온에서 10분 동안 교반합니다.

0.05ml의 1.25몰 글리신 용액을 첨가하여 PFA를 담금질하고 실온에서 5분 동안 조직을 교반합니다. 배지를 흡입하고 0.5ml의 PBS를 사용하여 조직을 두 번 헹굽니다. 가능한 한 많은 상층액을 제거한 후 가교 결합 조직을 섭씨 영하 80도에서 무기한 보관하십시오.

용해 완충액을 준비한 다음 사전 해동 없이 샘플을 용해합니다. 버퍼를 사용하여 세포 펠릿 또는 조직 100mg당 약 1밀리리터로 샘플을 재현탁합니다. 용해된 샘플을 섭씨 4도의 수조에 넣고 텍스트 프로토콜에 따라 최적화된 초음파 처리 시리즈를 시작합니다.

초음파 처리 직후, 5 분 동안 12, 000 g 및 4 °C에서 샘플을 원심 분리하십시오. 그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리 시리즈는 다른 단편화된 RNA를 얻지 않고 DNA의 점도를 감소시킬 수 있을 만큼 충분히 효율적이도록 최적화되어야 합니다.

초음파 처리된 샘플에서 혼성화를 수행하려면 튜브와 와류에 두 부피의 혼성화 버퍼를 추가합니다. 각 시료 20마이크로리터를 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 각 샘플에 100피코몰의 비오틴화 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가합니다.

그런 다음 실온의 튜브 회전기에서 4-6시간 동안 적당히 교반하여 샘플을 배양합니다. 배양 후 RNase 억제제 용액 밀리리터당 200단위와 밀리리터당 5마이크로리터 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 50마이크로리터의 마그네틱 스트렙타비딘 비드를 샘플에 추가합니다. 튜브를 실온에서 밤새 튜브 회전기에서 적당한 교반으로 배양합니다.

다음 날, 튜브를 자기 지지대에 놓고 상층액을 폐기하여 RNA 분리를 수행합니다. 그런 다음 비드에 900마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 실온의 로테이터에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 샘플을 자석에 놓고 버퍼를 버리고 세척을 5회 반복합니다.

최종 세척을 제거한 후 95마이크로리터의 Proteinase K 완충액과 5마이크로리터의 20mg/밀리리터 proteinase-K를 시료에 추가합니다. 그런 다음 얼음에서 입력 샘플을 해동하고 75마이크로리터의 Proteinase K 버퍼와 5마이크로리터의 proteinase-K를 추가합니다. 샘플을 섭씨 50도에서 45분 동안 배양한 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 배양합니다.

샘플을 얼음에서 3분 동안 식힌 다음 자석에 놓고 RNA를 포함하는 상등액을 수집하고 비드를 버립니다. RNA 정제 키트를 사용하여 RNA를 정제합니다. 마지막으로, RNA를 섭씨 영하 80도에서 보관하고 RT 및 qPCR을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 구성합니다.

여기에 설명된 lncRNA 2차 구조의 생물정보학 모델링을 기반으로 프로브는 GH4C1 배양 세포의 경우 Neat1 또는 Malat1 쥐와 뇌하수체 조직 추출물의 경우 Neat1 쥐에 대해 설계되었습니다. Neat1 또는 Malat1의 상대적 농축은 입력 샘플에 상대적인 비특이적 및 특이적 프로브에 대해 계산되었습니다. 이 그림은 쥐 GH4C1 뇌하수체 세포주와 마우스 뇌하수체 조직 추출물에서 Neat1을 끌어내리는 특정 프로브의 효율성을 보여줍니다.

특정 올리고뉴클레오티드 또는 SO 프로브에 대한 프로토콜이 Malat1으로 전달되었을 때, 하나의 효율적인 프로브와 함께 하나의 비효율적인 프로브가 생성되어 버려졌습니다. RNA 풀다운 및 RT qPCR 후, GH4C1 세포 추출물에서 Neat1과 관련된 RNA는 뇌하수체 조직 추출물에서도 Neat1과 연관되었습니다. 실제로, Neat1 RNA 풀다운 후 Malat1은 GH4C1 세포주와 뇌하수체 마우스 조직 추출물 모두에서 Neat1에 의해 표적이 되는 것으로 밝혀졌습니다.

또한, GH4C1 세포에서 프로브와 함께 Malat1 RNA 풀다운을 수행한 후 Neat1이 크게 농축되었습니다. 두 lncRNA 사이에서 확인된 밀접한 관계는 Neat1 RNA 발현의 변이를 나타내는 Malat1 녹아웃 마우스에 의해 제안된 Neat1 및 Malat1의 잠재적인 공동 조절 역할과 일치합니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 2일 또는 3일 안에 원하는 긴 non-coding RNA의 RNA 표적을 포착할 수 있습니다.

생물정보학적 접근법을 사용하면 세포 용해물 제제에 의해 프로브 효율이 변경될 수 있으므로 여러 안티 센스 프로브를 설계한 다음 실험적으로 효율성을 비교하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 관심 있는 긴 비암호화 RNA의 전체 RNA interactome을 제공하기 위해 고처리량 RNA 염기서열분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 2차 구조의 생물정보학 모델링에 의해 결정된 긴 비코딩 RNA의 사용 가능한 영역에 혼성화되는 효율적이고 특이적인 프로브를 사용하여 긴 비코딩 RNA의 RNA 파트너를 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.