Name: 포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 학습하세요 PoGo를 활용한 질량분석 펩타이드의 게놈 매핑 및 정량적 시각화 방법을. 이 도구는 단백질체학 데이터와 게놈 정보를 효율적으로 통합하여 연구자들이 RNA 시퀀싱 데이터와 결합 분석을 수행할 수 있게 합니다.

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이 작품은 Wellcome 신뢰 (WT098051)와 GENCODE 프로젝트에 NIH 교부 금 (U41HG007234)에 의해 투자 되었다.

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 소프트웨어 도구 포고 및 그래픽 사용자 인터페이스 PoGoGUI 게놈 좌표에 펩 티 드의 빠른 매핑을 사용 하는 방법에 대해 설명 합니다. 도구는 양적, 포스트 번역 상 수정 및 게놈 주석 참조를 사용 하 여 매핑을 변형 사용 등 독특한 기능을 제공 합니다. 이 문서는 대규모 proteogenomic 연구에서 메서드를 보여 줍니다 고18다른 사용 가능한 도구 비해 그 속도 메모리 효율을 강조. TrackHubGenerator 도구와 함께,이 게놈의 온라인 접근 허브 만들고 게놈 연결 데이터, 포고, 그래픽 사용자 인터페이스, 게놈 컨텍스트에서 데이터를 신속 하 게 시각화를 가능 하 게 대규모 proteogenomics 연구. 또한, 우리 변형 데이터베이스 및 양적 phosphoproteomics,2229에 대 한 검색 하는 데이터 집합으로 포고의 독특한 기능을 보여 줍니다.
GCT 파일 같은 단일 파일 귀중 한 시각화 및 펩 티 드 기능 및 게놈 loci 사이의 링크를 제공합니다. 그러나, 그것은 혼자이에 따라 해석 어렵거나 고유성, 포스트 번역 상 수정 등 양적 값 proteogenomics의 단일 측면에 그들의 제한으로 인해 오해의 소지가 있을 수 있습니다 주의 하는 것이 중요. 따라서, 그것은 신중 하 게 선택한 출력 파일, 옵션, 및 조합 손을 proteogenomic 질문에 대 한 적절 한 조합을 수정 하는 것이 중요. 예를 들어 특정 한 genomic 소재 시에 매핑의 특수성에 대 한 정보 있을 게놈 기능7의 주석에 대 한 큰 가치 다른 샘플에서 정량화와 관련 된 연구에 대 한 더 적절 한 수도 게놈 기능 변화 단백질 풍부29에. 각 설정에 대 한 포고 하 여 출력을 생성 합니다. 경우에 출력이 생성 되지 않습니다, 또는 빈 파일을 출력 폴더에 표시 됩니다, 원하는 내용과 필요한 파일 형식에 대 한 입력된 파일을 확인 하는 것이 좋습니다. 어디 파일 형식이 나 내용이 따르지 않는 포고의 기대 하는 경우에 (예를 들어, FASTA 파일 기발한 대 본 번역 시퀀스를 포함 하는 성적 증명서의 뉴클레오티드 시퀀스 포함), 오류 메시지가 사용자에 게 묻습니다 입력된 파일을 확인 하십시오.
프로토콜 및 도구 제한 주로 유전체학에 일반적으로 사용 되는 파일 형식의 재사용 기반으로 합니다. Proteogenomic 응용 프로그램에 대 한 게놈에 사용 되는 파일 형식 재사용 특정 한계 동반 된다. 이러한 게놈의 중심 게놈 시각화에 대 한 요구의 다른 세트는 및 proteogenomic 데이터, 포스트 번역 상 수정 단백질 데이터에서를 시각화 하는 필요 등. 이 단일 기능 사용 하 여 게놈 파일 형식으로 제한 됩니다. 많은 방법과 도구 자신 있게 지역화 펩 티 드 순서31,32,,3334내 포스트 번역 상 수정 단백질에 대 한 개발 되었습니다. 그러나, 여러 수정 게놈에 독특하고 뚜렷한 방식으로 시각화 게놈 파일 포맷의 구조에 의해 방해 된다. 따라서, 동일한 유형의 여러 PTMs의 단일 블록 시각화 수정 사이트의 어떤 모호함을 구성 하지 않습니다 하지만 게놈 지역 사회에서 서로 다른 요구 사항만 한 번에 하나의 기능을 시각화의 결과 이다. 그럼에도 불구 하 고, 포고 포스트 번역 상 수정에 단일 뉴클레오티드 변종 같은 게놈 기능 효과에 초점을 맞춘 연구 있도록 게놈 좌표에 매핑 포스트 번역 상 수정의 이점이 있다. 포고를 사용 하 여, 변형 매핑 총 매핑 수를 증가 합니다. 그러나, 매핑된 펩 티 드의 독특한 색 구분 신뢰할 수 없는 것 들 로부터 신뢰할 수 있는 매핑을 강조 한다. 알려진된 단일 뉴클레오티드 변종에서 식별 하는 variant 펩 티 드의 매핑 함께 VCF 형태로 변형 함께 매핑된 펩 티 드를 시각화 수 있습니다. 이 이렇게 변형 펩 티 드의 신뢰할 수 없는 매핑을 나타내는 색상 코드는 알려진된 뉴클레오티드 이체의 존재에 의해 기 각.
포고를 사용 하기 위한 중요 한 단계는 올바른 파일 및 포맷의 사용 이다. 단백질 시퀀스 동반 GTF 형식에서 주석으로 번역 된 사본 시퀀스의 사용은 주요 기준입니다. 포고 펩 티 드 아미노산 불일치와 지도를 사용 하 여 고려할 때 또 다른 중요 한 요소는 메모리입니다. 반면 높은 메모리 효율적인 표준 응용 프로그램에 대 한, 메모리 사용18에서 비슷하게 지 수 증가 크게 하 고 기 하 급수적으로 증가 하나 또는 두 개의 불일치와 가능한 매핑 수 리드. 우리는이 프로토콜을 먼저 불일치 없이 펩 티 드 지도 세트에서 그들을 제거에 설명 된 대로 단계적된 매핑을 제안 합니다. 후속 이전 매핑되지 않은 펩 티 드 다음 매핑할 수 한 불일치를 사용 하 여 그리고 매핑되지 않은 남은 펩 티 드에 대 한 두 가지 불일치와 절차를 반복할 수 있습니다.
질량 분석의 처리량을 크게 증가 연구 인터페이스 genomic와 proteomic 데이터 최근 몇 년 동안에서 더 자주 되 고 있다 때문에, 쉽게 이러한 유형의 동일한 좌표 시스템의 데이터 인터페이스를 사용 하는 도구는 점점 필수. 여기에 제시 된 도구는 게놈 결합 하는 필요 및 더 나은 이해 통합 연구의 크고 작은 데이터 집합에 걸쳐 참조 주석에 펩 티 드를 매핑하여 향상 proteomic 데이터 도움이 됩니다. 격려, 포고 펩 티 드 유전자 후보 참조 주석으로 동일한 형태로 제공 된 인간의 고환35에 표현 하는 새로운 유전자의 주석 노력을 지원 하기 위해 지도에 적용 되었습니다. 여기에 제시 된 접근 펩 티 드 식별을 위해 사용 되는 데이터베이스의 독립적입니다. 프로토콜 식별에 도움이 될 수 있습니다 사용 하 여 소설을 번역 제품의 시각화 번역 시퀀스에서 입력된 파일을 적응 하 고 관련 RNA-seq 실험에서 GTF 파일.
몇 가지 접근 및 다양 한 펩 티 드 펩 티 드 가이드 RNA 시퀀싱 매핑, 게놈 순서에 직접 매핑에서 배열 하는 게놈 좌표에 매핑하는 특별 한 응용 프로그램 시나리오 도구 도입된10, 되었습니다. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 그러나 17., 이러한 포스트 번역 상 수정 고 RNA 시퀀싱 읽기의 기본 매핑에서 오류 펩 티 드 수준에 전파 될 수 있습니다 때 펩 티 드를 올바르게 지도 실패 귀 착될 수 있다. 포고는 구체적으로 그 장애물을 극복 하 고 양적 고해상도 proteomic 집합 직교 유전체학 플랫폼으로 통합의 급속 한 증가 대처 하기 위해 개발 되었습니다. 여기에 설명 된 도구 높은 처리량 워크플로로 통합 될 수 있습니다. PoGoGUI 그래픽 인터페이스를 통해 도구는 사용 하기 간단 하며 전문 생물 정보학 교육.

셀, 게놈, transcriptome, 및 프로테옴에서 내부 및 외부 자극에 대 한 응답을 조절 하 여 건강 및 질병에 지도 하는 특정 기능을 수행 하기 위해 서로 상호 작용 하는 서로 영향을. 따라서, 특성화 및 정량화 유전자, 성적 증명서, 그리고 단백질 세포질 과정을 완전히 이해 결정적 이다. 차세대 시퀀싱 (NGS)를 식별 하 여 유전자 및 식 계량 가장 일반적으로 적용 된 전략 중 하나입니다. 그러나, 단백질 표정은 질량 분석 (MS)에 의해 일반적으로 평가 된다. 지난 10 년간 MS 기술에 있는 중요 한 전진은 더 완전 한 식별 및 proteomes, transcriptomics1대 등 데이터를 만들기의 정량화 활성화 됩니다. Proteogenomics와 멀티-omics NGS와 MS 데이터를 통합 하는 방법으로 되 고 여러 분자 수준에서 세포 프로세스를 평가 하기 위해 강력한 접근 암의 하위를 식별 하 고 암2 소설 잠재적인 약물 표적을 선도 , 3. 그 proteogenomics 유전자 및 주석4proteomic 증거를 제공 하기 위해 처음 사용 되었다 주의 하는 것이 중요 하다. 이전 비 코딩 하는 것으로 생각 하는 몇몇 유전자 최근 대규모 인체 조직 데이터 집합5,,67고려 재평가 받은. 또한, proteomic 데이터는 성공적으로 비 모형 유기 체8,9주석 노력을 지원 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, proteogenomic 데이터 통합 하이라이트 단백질 표정 게놈 기능에 관하여 더 악용 될 수 있습니다 및 결합 된 레퍼런스 시스템 및 방법을 제공 하 여 성적 증명서와 단백질 사이 잡담을 명료 공동 시각화입니다.
Proteomics, transcriptomics, 및 게놈 데이터에 대 한 일반적인 참조를 제공 하기 위해 수많은 도구 매핑 펩 티 드 게놈 좌표10,,1112 에 MS를 통해 식별에 대 한 구현 되었습니다. 13,,1415,,1617. 접근 매핑 참조, 게놈 브라우저, 및 그림 1에서 보듯이 다른 proteomics 도구와의 통합도 지원 측면에서 다르다. 일부 도구 게놈16에 역 번역 된 펩 티 드, 지도 하는 동안 다른 펩 티 드15의 뉴클레오티드 순서를 재구성 하 단백질 및 유전자 주석 내의 검색 엔진 주석 위치를 사용 합니다. 아직도 다른 사람11,13에 대 한 펩 티 드를 지도 하는 게놈의 3 또는 6 프레임 번역을 사용 합니다. 마지막으로, 여러 가지 도구 뉴클레오티드 순서를 생략 하 고 중간으로 RNA 시퀀싱 매핑된 성적표에서 아미노산 시퀀스 번역을 사용 하 여 연결 된 게놈 좌표10,12, 펩 티 드 지도 14,17. 그러나, 뉴클레오티드 시퀀스의 번역은 느린 과정 그리고 사용자 지정 데이터베이스 오류 펩 티 드 매핑 전파를 하는 경향이 있다. 신속 하 고 높은 처리량 매핑에 대 한 작고 포괄적인 참조 중요 하다. 따라서, 관련 된 게놈 좌표와 표준화 된 단백질 참조 게놈 매핑 정확한 펩 티 드에 대 한 필수적입니다. 소설 측면 proteogenomics, 변형 및 포스트 번역 상 수정 (PTMs)2,3, 법인 등에서 최근 연구를 통해 추진력을 얻고 있다. 그러나,이 일반적으로 지원 되지 않습니다 그림 1에 표시 된 대로 도구를 매핑 현재 proteogenomic에 의해. 속도 매핑의 품질을 개선 하기 위해, 포고, 개발 되었다 게놈18펩 티 드의 빠르고 양적 매핑 수 있는 도구입니다. 또한, 포고 2 개의 순서 이체와 주석된 포스트 번역 상 수정와 펩 티 드의 매핑이 있습니다.
포고는 proteomes 및 글로벌 수정 캡처 양적 고해상도 데이터 집합의 급속 한 증가 대처 하기 위해 개발 되었습니다 하 고 개인적인 변이 및 정밀 의학 같은 대규모 분석에 대 한 중앙 유틸리티를 제공 합니다. 이 문서에서는 게놈 기능에 관하여 포스트 번역 상 수정의 존재를 시각화 하기 위해이 도구의 응용 프로그램을 설명 합니다. 또한,이 문서에는 매핑된 펩 티 드를 통해 다른 접합 이벤트의 식별 및 사용자 지정 variant 데이터베이스 참조 게놈을 통해 식별 하는 펩 티 드의 매핑 강조 표시 합니다. 이 프로토콜에서 포고의 이러한 기능을 보여 주기 위해 자존심 아카이브19 다운로드 공개적으로 사용 가능한 데이터 집합을 사용 합니다. 또한,이 프로토콜 대규모 proteogenomics 연구에 대 한 게놈에 매핑된 펩 티 드의 온라인 접근 허브의 창조에 대 한 TrackHubGenerator의 응용 프로그램을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>PoGo (소프트웨어)</td><td>NA</td><td></td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGo</td></tr><tr><td>PoGoGUI (소프트웨어)</td><td>NA</td><td></td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGoGUI</td></tr><tr><td>TrackHubGenerator (소프트웨어)</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/TrackHubGenerator</td><td></td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer (소프트웨어)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>UCSC 게놈 브라우저 (웹 사이트)</td><td>NA</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>GENCODE (웹 사이트)</td><td>NA</td><td></td><td>NA http://gencodegenes.org</td></tr><tr><td>Ensembl (웹 사이트)</td><td>NA</td><td></td><td>NA http://ensembl.org</td></tr><tr><td>bedToBigBed (소프트웨어)</td><td>NA</td><td></td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr><tr><td>fetchChromSizes.sh (소프트웨어)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr></tbody></table>

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

유전자, 성적 증명서, 그리고 단백질 사이 잡담 하는 열쇠 세포질 응답; 따라서, 고유한 엔터티로 분자 레벨의 분석 세포 내에서 분자 역학의 이해를 통합 연구를 천천히 확장 되 고 됩니다. 시각화 및 다른 omics 데이터 집합과 proteomics의 통합에 대 한 현재 도구 대규모 연구에 적합 하지 않습니다. 또한, 그들은 기본적인 시퀀스 캡처할 식별, 포스트 번역 상 수정 및 정량 삭제. 이러한 문제를 해결 하려면 우리는 게놈 주석 참조를 정량화와 관련된 포스트 번역 상 수정 펩 티 드를 지도 하는 포고를 개발 했다. 또한, 도구 사용자 지정된 시퀀스 데이터베이스 통합 단일 아미노산 변종에서에서 식별 하는 펩 티 드의 매핑을 사용할 수 있도록 개발 되었다. PoGo는 명령줄 도구입니다, 하는 동안 그래픽 인터페이스 PoGoGUI 쉽게 펩 티 드 25 종 합 게놈 주석에서 지 원하는 지도를 비 생물 정보학 연구원을 수 있습니다. 생성 된 출력 파일 형식 유전체학 분야에서 빌려 고, 따라서, 시각화는 대부분 게놈 브라우저에서 지원 됩니다. 대규모 연구, 포고를 만드는 유전자를 또한 proteogenomics 데이터의 쉬운 공유에 매핑된 데이터의 웹에서 액세스할 수 있는 저장소 TrackHubGenerator에 의해 지원 됩니다. 약간의 노력으로이 도구는 단 몇 분 내 유전자를 참조 하 여 다른 사용 가능한 시퀀스 id 기반 도구를 능가 하는 펩 티 드의 수백만 매핑할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 proteogenomics 매핑 포고를 통해 공개적으로 사용 가능한 데이터 집합의 양적 그리고 phosphoproteomics, 뿐만 아니라 대규모 연구는 최고의 방법을 보여 줍니다.

일반 proteomic 워크플로 포고18 의 단계 적용, 시각화의 다운스트림 옵션을 강조 표시 한 그래픽 묘사 그림 5에 표시 됩니다. (즉, 뒤에 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석으로 결합 하는 단백질의 분해 소화) 샷건 proteomics proteogenomic 매핑의 한 전조 단계입니다. 결과 탠덤 질량 스펙트럼 일반적으로 단백질 시퀀스 데이터베이스에서 파생 된 이론적인 스펙트럼 비교 됩니다. Proteogenomics 연구 잠재력과 동의어 아닌 단일 뉴클레오티드 변종 (SNVs) 참조 게놈8이 다시 쉽게 관련 된 하드 만들기 데이터베이스에 코딩 소설 성적표의 번역 순서를 소개 합니다. 포고 (PoGoGUI)의 그래픽 사용자 인터페이스 질량 분석 실험에서 펩 티 드 식별 표준화 된 보고에 대 한 파일 포맷을 지원 하 고 단순화 된 4 열 포고 형식으로 변환 합니다. PoGoGUI는 명령줄 도구 포고를 래핑합니다 고 따라서 펩 티 드의 단백질 코딩 유전자는 GTF FASTA 형태로 번역된 사본 시퀀스에 일반적으로 제공 된 참조 주석 활용 게놈 좌표에의 매핑. 다른 출력 형식은 포고 포스트 번역 상 수정 및 펩 티 드 수준 정량화를 포함 하 여 질량 분석을 통해 확인 된 펩 티 드의 다양 한 측면의 시각화를 사용 하 여 생성 됩니다. 침대에서 출력 파일 추가 변환 하 고 트랙 허브 라는 온라인 액세스 디렉터리에 결합 된 수 있습니다. 트랙 허브로 서 단일 출력 파일, 다음 수 수 시각 UCSC 게놈 브라우저25, 합 게놈 브라우저20,24, IGV 및 Biodalliance28 (하단 그림 5 참조)와 같은 브라우저에서.
우리는 라이트 외 에 설명 된 대로 높은 의미에서 필터링 인간 프로테옴 지도 초안의 해도 적용할 포고 7 두 다른 도구 proteogenomic 매핑, 즉 iPiG14 PGx10에 그것을 비교 하 고. Dataset는 총 3 백만 이상의 시퀀스의 결과 59 성인 그리고 태아 조직에 걸쳐 233,055 독특한 펩 티 드 구성. 포고 실적이 이러한 도구 모두 런타임에서 (6.9 x 및 96.4 배 빠른, 각각)와 메모리 사용 (20%, 60% 더 적은 메모리, 각각) 그림 618에서 같이. 성공적으로 매핑된 펩 티 드의 예는 그림 7에 표시 됩니다.
포고 크게 속도 메모리에서 다른 도구 보다, 하는 동안 그것은 또한 매핑 포스트 번역 상 수정 및 게놈에 펩 티 드와 관련 된 양적 정보입니다. 그림 8A 는 개요로 한 엑손을 걸쳐 매핑 펩 티 드 결합 접속점에 대 한 게놈 브라우저에서 침대 포맷의 시각화를 묘사 한다. 포고 게놈 내에서 펩 티 드 매핑의 특수성에 대해 쉽게 시각 보조 제공을 색칠 옵션을 사용 합니다. 빨간색으로 매핑 특이 단일 유전자를 검은 하이라이트 동안 단일 사본으로 나타냅니다. 그러나, 펩 티 드 다른 사본 간에 공유 됩니다. 회색 매핑을 여러 유전자 사이 공유 하는 펩 티 드를 표시 합니다. 이들은, 예를 들어, 덜 유전자의 정량화에 대 한 신뢰할 수 있거나 신뢰할 수 없는 전화는 유전자의 표현입니다. 포고의 PTM 침대 옵션 그림 8B에서와 같이 다양 한 유형의 포스트 번역 상 수정에 맞게 색상 코드를 재정의 합니다. 또한, PTMs ( 그림 8B참조) 두꺼운 블록으로 표시 됩니다. 형식의 단일 PTM 동안 동일한 유형의 여러 PTMs 첫 번째 수정 된 아미노산에서 두꺼운 블록에서 마지막 스팬은 두꺼운 블록에서 수정 된 아미노산 잔류물의 위치에 의해 강조 표시 됩니다.
우리 50 대 장 암 세포 라인 전체 프로테옴 등 phosphoproteome29의 데이터 집합에 포고와 그 후 TrackHubGenerator을 적용. UCSC 게놈 브라우저에 로드 트랙 허브 게놈에 매핑된 펩 티 드를 보여준다는 매핑 및 ( 그림 9참조) 인 산화 사이트의 독자 성을 강조 하는 동안 추가 데이터는 추가 폴더에 제공 됩니다. GCT 파일 다음 게놈 맥락에서 펩 티 드 및 phosphopeptide 정량의 시각화를 사용합니다. 그러나, GCT 파일의 펩 티 드 결합 접속점 (상단 그림 10 참조)에 걸쳐 쉽게 시각화를 제공 하지 않습니다. 펩 티 드 결합 접속점에 걸쳐는 exons를 그들의 각각 부분으로 분할 됩니다. 스플라이스 펩 티 드 exon 매핑 같은 정량적 인 값을 통해 확인할 수 있지만 로드 시퀀스 기반 매핑 파일 등 침대 GTF 선 지원에 걸친 얇은 intron에는 exons를 연결 하는 해석 ( 그림 10 참조 하단)입니다.
변형 사용 매핑 유틸리티를 강조 하기 위해 우리가 인간의 고환 프로테옴 neXtProt 다중 효소 전략22를 사용 하 여 누락 된 단백질에 대 한 사냥에 대 한 검색의 데이터 집합에 두 가지 구성으로 포고 적용. neXtProt 참조 단백질 시퀀스 외 5 백만 이상의 단일 아미노산 변종30구성 되어 있습니다. 단일 아미노산 변종 발견 펩 티 드를 매핑 다른 매핑 도구에서 지원 되지 않습니다. 177,012 독특한 펩 티 드의 총 확인 되었다. 이들의 99.8% (176,694) 펩 티 드 성공적으로 불일치를 허용 하지 않고 매핑 먼저 했다. 0.2% (318) 펩 티 드 이후 매핑된 있도록 하나의 아미노산 대체 했다 결과 확인 된 펩 티 드 목록에서 그들을 제거. 이 결과 다른 사용 가능한 도구와 참조 게놈에 매핑되지 않은 것이 162 펩 티 드의 3,446 매핑. 매핑 불일치를 포함 하 여 평균 수 높은 반면, 62 펩 티 드 했다만 단일 장소, 진정한 변형 시퀀스를 나타내는 매핑됩니다. 하나의 아미노산 대체와 매핑된 펩 티 드의 예는 그림 11에 번역 된 게놈 시퀀스와 시퀀스는 강조 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig1.jpg"> 그림 1입니다. 다른 펩 티 드-게놈 매핑 도구의 시각적인 비교. 비교는 다양 한 측면에 관하여 표시 됩니다. 이러한 측면에는 매핑 참조, 프레임 워크에 통합의 수준 및 온라인 / 오프 라인 브라우저의 지원 포함 됩니다. 또한, proteogenomics 및 그들의 기능 지원의 소설 측면은 별도로 강조 표시. 포고만 직접 다른 도구에 비해 게놈 시퀀스에 매핑하는 기능을 결여 된다. 그러나, 그것은 대부분의 다른 도구를 지원 하지 않는 모든 새로운 기능을 지원 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig2.jpg"> 그림 2입니다. 매핑 펩 티 드에 대 한 예제 입력된 파일. 포고 4 열 탭으로 구분 된 형식으로 데이터 입력된을 허용합니다. 열 머리글 첫 번째 줄에는 '실험', '펩타이드', 'Psm', 그리고 '양의', 실험 또는 샘플 식별자, 펩 티 드 순서, 펩 티 드-스펙트럼 일치의 수 및 펩 티 드에 대 한 정량적 값 다음에 나타내는 각각. 파일 이름 확장명 지원 *.txt, *.tsv, 및 *.pogo 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig3.jpg"> 그림 3입니다. 파일 선택 및 매개 변수 옵션에 대 한 강조 표시 된 단계를 PoGoGUI 인터페이스. 그림을 선택 하 고 업로드 하는 필요한 모든 파일 및 매핑 펩 티 드 인간 참조 게놈에 포스트 번역 상 수정에 대 한 옵션을 선택 하는 단계입니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig4.jpg"> 그림 4입니다. 통합 게놈 뷰어 (IGV) 데이터의 스크린샷 업로드 절차. 그림 포고 IGV 브라우저에서 출력 파일을 업로드 하기 위한 단계를 강조 표시 합니다. 또한, 매핑 및 시퀀스를 강조 하기 위해 매핑된 펩 티 드의 트랙을 확대의 옵션이 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig5.jpg"> 그림 5입니다. LC-MS/MS에서 게놈 브라우저에서 시각화 단계의 워크플로 간소화. 포고 매핑 탠덤 질량 스펙트럼에서 펩 티 드의 id를 다음과 같습니다. 달성 하기 위하여 게놈을 매핑, 포고 참조 주석 게놈 주석 (GTF) 및 대 본 번역 시퀀스 (FASTA)로 제공 활용 합니다. 별도로 게놈 브라우저에서 로드할 수 있는 다른 출력 형식이 생성 됩니다. 또한, 침대 형식의 파일은 대규모 데이터 집합의 시각화를 지 원하는 트랙 허브에 결합할 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig6.jpg"> 그림 6입니다. PGx iPiG에 대 한 포고를 벤치마킹. 포고 능가 하는 성능 벤치마킹에서 다른 도구. 3 백만 이상 시퀀스에서 결과 59 성인 그리고 태아 조직에 걸쳐 233,055 독특한 펩 티 드를 매핑, 포고 되었고 6.9 x 96.4 x PGx iPiG, 보다 빠른 각각. 또한, 포고 20%와 60% 더 적은 메모리와 비교 하 여 PGx iPiG, 각각 필요 합니다. 포고와 PGx 성공적으로 완료 되 면, 하는 동안 iPiG 16 g b 메모리 오류 결과. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2.jpg"> 그림 7입니다. 매핑된 펩 티 드의 UCSC 게놈 브라우저 예제 보기. 그림 펩 티 드 유전자 mTOR 매핑됩니다. 결합 된 트랙 펩 티 드 결합 접속점에 걸쳐 고 관련 시퀀스 한 exon에만 보여, 조직 관련 트랙만 압축 형식에서 매핑을 강조 표시 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig8.jpg"> 그림 8입니다. 매핑 시각화 및 컬러 코딩의 도식. (A) 표준 침대 출력 파일에는 exon에 펩 티 드 (왼쪽), 펩 티 드 exon 블록 (오른쪽)으로 부품을 다루는 여러 개의 exons 하이라이트에서 매핑 하면서 하나의 블록으로 표시 됩니다. Introns는 얇은 라인을 연결 하 여 표시 됩니다. 포고 색상 매핑 또는 펩 티 드 유전자, 그리고 3-계층 시스템을 사용 하 여 녹취 록에의. (B) 침대 형식의 블록 구조 뿐만 아니라 PTM 침대 출력 두꺼운 블록으로의 포스트 번역 상 수정 위치 하이라이트. 형식의 단일 PTM의 존재 같은 PTM의 여러 사이트는 처음부터 마지막 수정 사이트에 걸친 긴 블록으로 결합 하는 동안 두꺼운 블록 수정된 아미노산 잔류물을 강조 표시 합니다. 펩 티 드 매핑 추가 PTM 유형 및 색상 코덱에서 수정에 따라 나누어집니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2.jpg"> 그림 9입니다. 대 장 암 프로테옴 및 phosphoproteome 데이터 UCSC 게놈 브라우저에서 허브 보기 추적. 트랙 허브 전체 프로테옴 데이터 뿐만 아니라 phosphoproteome로 구성 되어 있습니다. 프로테옴 및 phosphoproteome 트랙에서 붉은 색의 SFN의 단일 사본으로 매핑 나타냅니다, _ptm으로 끝나는 트랙 펩 티 드 내에서 인 산화 위치 표시. 여기, 붉은 색의 인 산화로 수정 형식을 나타냅니다. 두 개의 펩 티 드 각 보여주는 단일 인 산화 (두꺼운 블록)으로 확인 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig10.jpg"> 그림 10입니다. 대 장 암 phosphopeptides와 IGV 관련된 정량. 그림 50 암 세포 라인의 하위 집합입니다. 그것은 또한 보여준다 4 개의 열 블록의 빛의 다른 그늘에 빨간색. 색 (빨간색)를 낮은 (흰색)에서 관계 되는 풍부를 나타냅니다. 4 열 처음 4 펩 티 드 믿고으로 이어질 수도 있습니다, 그러나 그것은 관련 시퀀스 기반 GTF 출력 파일 이들은 실제로 2 개의 펩 티 드 결합 접속점에 걸친 각 분명해 진다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig11.jpg"> 그림 11입니다. 아미노산 변종 IGV에 펩 티 드의 보기. 그림 펩 티 드 유전자 GPSM1의 번역 시작 참조 게놈에 매핑된 단일 아미노산 변종입니다. Variant는 아미노산 잔류물 8 및 valine (A→V)에 알라닌의 대체에서 결과에 배치 됩니다. (파란색) 주석된 성적표의 번역 시퀀스 펩 티 드 순서에 비해 variant를 강조 표시합니다. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에 우리가 현재 proteogenomic 도구 포고와 빠른, 양적, 포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 프로토콜 사용 참조 게놈에 질량 분석을 통해 식별 하는 펩 티 드의 매핑. 이 도구는 사용 하 여 통합 및 proteogenomic 및 개인 proteomic 연구와 직교 게놈 데이터 시각화의.

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

이 소프트웨어 프로토콜의 전반적인 목표는 PoGo를 사용하여 질량 분석 실험의 관련 번역 후 변형 및 정량적 정보와 펩타이드를 매핑하여 게놈을 참조하고 직교 유전체학 데이터와의 통합 및 시각화를 가능하게 하는 것을 입증하는 것입니다. 이 도구는 질량 분석 단백질체학 검색에 의해 생성된 펩타이드 목록에 게놈 정보를 추가하여 RNA 염기서열분석 데이터와의 통합을 촉진할 수 있도록 도와줍니다. 이 도구의 가장 큰 장점은 사용이 간편하고 빠르며 번역 후 수정, 정량 분석 및 아미노산 분산과 같은 추가 정보를 지원한다는 것입니다.시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 비디오에 표시된 소프트웨어를 다운로드하여 설치하십시오. 설치가 완료되면 PoGo GUI 실행 파일 폴더로 이동하고 PoGo GUI 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 시작합니다. PoGo 실행 파일 옆에 있는 선택 버튼을 사용합니다.그런 다음 실행 파일 폴더에서 관련 운영 체제 하위 폴더로 이동하고 실행 가능한 PoGo 파일을 선택합니다. 열기 버튼을 클릭하여 선택을 확인합니다. 다음으로, 선택을 클릭하여 단백질 염기서열에 대한 참조 입력 파일을 선택합니다.데이터 폴더로 이동하여 번역 금식일 파일을 선택합니다. 열기를 클릭하여 선택을 확인합니다. 선택 버튼을 사용하여 대본 주석 파일을 선택합니다.그런 다음 데이터 폴더로 이동하여 주석 GTF 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 펩타이드 파일 옆에 있는 추가 버튼을 사용하여 펩타이드 식별 파일을 추가합니다. 여기에서 지원되는 MZ 탭, MZ Ident ML 또는 MZ ID 형식 또는 탭으로 구분된 4열 형식의 파일을 선택합니다.또한 출력 형식 선택에서 BED NGTF 옆에 있는 확인란을 선택 취소합니다. PTM BED 및 GCT만 선택된 상태로 두십시오. 그런 다음 드롭다운 선택 항목에서 데이터에 적합한 종을 선택하고 시작을 클릭하여 매핑을 시작합니다.먼저 _ptm. bed로 끝나는 PoGo 출력 파일을 통합 유전체학 뷰어에 로드합니다. 이 과정을 반복하여 _noptm.bed로 끝나는 파일도 불러옵니다.이 파일에는 수정 없이 발견된 모든 펩타이드가 포함되어 있습니다. 트랙을 목록의 원하는 위치로 끌어다 놓아 순서를 변경합니다. 각 파일은 트랙을 식별하는 파일 이름과 함께 별도의 트랙으로 표시됩니다.각 트랙은 처음에 축소된 방식으로 표시됩니다. 이를 확장하려면 트랙 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 sequences를 포함한 펩타이드의 전체 보기를 보려면 extended를 선택합니다. 이제 gct로 끝나는 파일을로드하십시오.이 파일에는 펩타이드 정량 분석 정보가 포함되어 있습니다. 이전에 로드된 파일과 달리 주석이 달린 각 샘플은 별도의 트랙으로 로드됩니다. 드래그 앤 드롭 작업을 사용하여 원하는 대로 샘플을 재구성합니다.드롭다운 메뉴에서 염색체를 선택하거나, 확대할 염색체 섹션을 길게 클릭하거나, 게놈 좌표를 입력하여 게놈 내부를 탐색합니다. PoGo 매핑은 그래픽 사용자 인터페이스 또는 명령줄 인터페이스를 사용하여 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 이 부분에서는 명령줄 인터페이스를 사용하여 호환성을 강조 표시합니다.텍스트 프로토콜의 이전 단계를 통해 얻은 변이 펩타이드를 참조 게놈에 매핑하려면 명령 프롬프트를 열고 PoGo의 실행 파일 폴더로 이동합니다. 그런 다음 여기에 표시된 명령을 입력합니다. Enter 키를 눌러 실행을 확인하고 실행이 완료될 때까지 기다렸다가 더 이상 진행하지 않습니다.integrative genomics viewer에서 mismatch 없이 그리고 mismatch로 매핑된 펩타이드를 시각화합니다. PoGo 그래픽 사용자 인터페이스 소프트웨어에서 펩타이드 파일 옆에 있는 추가 버튼을 사용하여 펩타이드 식별 파일을 추가하고 단일 또는 여러 파일을 선택한 다음 펩타이드 파일 아래의 빈 필드로 끌어다 놓습니다. 그런 다음 출력 형식 섹션에서 PTM BED, GTF 및 GCT 옆의 확인란을 선택 취소하고 BED만 선택된 상태로 둡니다.또한 여러 입력 파일을 단일 출력으로 병합 옵션을 선택합니다. 이렇게 하면 입력 파일의 모든 펩타이드를 결합하는 단일 출력 파일이 생성됩니다. 이 옵션을 선택하지 않은 상태로 두면 각 입력 파일에 대해 개별적으로 프로그램이 순차적으로 실행됩니다.다음으로, 드롭다운에서 금식일 NGTF 파일과 일치하는 데이터에 적합한 종을 선택합니다. 선택되면 시작 버튼을 클릭하여 매핑을 시작합니다. 매핑된 펩타이드에서 추적 허브를 생성하려면 터미널 창을 열고 명령 프롬프트에 다음 명령을 입력합니다.Enter 키를 눌러 실행을 확인합니다. 실행을 완료하는 데 짧은 시간만 걸립니다. 완료되면 생성된 트랙 허브를 모든 콘텐츠와 함께 웹에서 액세스할 수 있는 FTP 서버 또는 GitHub로 전송합니다.웹 브라우저에서 UCSC 게놈 브라우저로 이동하여 My Data Track Hubs를 선택합니다. 그런 다음 내 허브 탭을 클릭합니다. 트랙 허브에 대한 URL을 텍스트 필드에 복사한 다음 허브 추가를 클릭하여 트랙 허브를 로드합니다.마지막으로 게놈 브라우저를 선택하여 브라우저 보기로 들어갑니다. 사용자 지정 트랙 허브가 목록 맨 위에 표시됩니다. 여러 BED 파일이 트랙 허브의 기반을 구축한 경우 각 파일은 허브 내에서 별도의 트랙으로 표시됩니다.PoGo와 다른 두 가지 단백질유전체학 매핑 도구는 여기에서 전체 메모리 사용 및 분석 런타임에 대해 비교됩니다. PoGo는 속도와 메모리 모두에서 다른 도구보다 성능이 훨씬 뛰어나며 펩타이드와 관련된 번역 후 수정 및 정량적 정보를 게놈에 매핑할 수 있습니다. PoGo는 게놈 내 펩타이드 매핑의 고유성과 관련하여 쉬운 시각적 보조 도구를 제공하기 위해 착색 옵션을 활용합니다.빨간색 매핑은 단일 전사체에 대한 고유성을 나타내고 블록 강조 표시는 단일 유전자에 대한 매핑을 나타냅니다. 회색 매핑은 여러 유전자 간에 공유되는 펩타이드를 보여줍니다. PoGo의 PTM BED 옵션은 변형된 아미노산 잔류물에서 두꺼운 블록으로 변형의 위치를 나타내는 다양한 유형의 번역 후 변형을 수용하기 위해 색상 코드를 재정의합니다.여기에 표시된 대장암의 단백질체 데이터에서, 단 두 개의 펩타이드만이 확인되었으며 각 펩타이드는 단일 인산화를 보여주었습니다. 출력 GCT 파일의 정보는 펩타이드가 적용되는 게놈 영역에 대한 정량적 값을 제공합니다. 스플라이스 접합을 가로지르는 펩타이드는 연결되지 않고 부분으로 나뉩니다.접합에 대한 보다 포괄적인 정보를 보려면 출력 GTF 파일이 추가로 필요합니다. 참조 단백질 염기서열 및 주석이 다운로드되고 설정되면 염기서열 불일치가 허용되지 않을 때 5분 이내에 수천 개의 펩타이드를 게놈 좌표에 매핑할 수 있습니다. PoGo를 사용하여 참조 게놈에 펩타이드를 매핑하려고 시도하는 동안 단백질 코딩 전사체의 번역된 염기서열 및 관련 전사체 주석을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 PoGo 및 PoGo GUI를 사용하여 단백질체학 질량 분석 실험의 펩타이드를 관련 정보와 함께 참조된 게놈에 매핑하고 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

이 동영상은 STAGE Tip 절차를 통한 펩타이드 정제를 보여줍니다. 긴 탄화수소 사슬에 결합된 수지 비드를 포함하는 소형 컬럼은 소수성 상호 작용 기반 정제를 용이하게 합니다. 미리 분해된 펩타이드 샘플을 컬럼에 로드하면 펩타이드 단편이 수지 비드에 결합하여 불순물이 통과할 수 있습니다. 소수성 상호작용을 방해하는 용리 완충액이 적용되어 펩타이드 단편을 용리시킵니다.

펩타이드의 탈염 및 정제를 위한 STAGE 팁 절차

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

학습하세요 PoGo를 활용한 질량분석 펩타이드의 게놈 매핑 및 정량적 시각화 방법을. 이 도구는 단백질체학 데이터와 게놈 정보를 효율적으로 통합하여 연구자들이 RNA 시퀀싱 데이터와 결합 분석을 수행할 수 있게 합니다.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

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