Name: Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 배우세요 세포 시트 기술을 이용한 누드 래트 간세포 암종 모델 개발 방법입니다. 중간엽 줄기세포가 종양 성장에 미치는 영향을 관찰하고 항암 치료제 효능 평가를 위한 신뢰할 수 있는 생체 내 암 모델을 구축할 수 있습니다.

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저자는 그들의 협력 및 지원-특히 후세인 Almukhayzim, Hisham Aloudah에 대 한 실험적인 수술과 킹 사우드 대학, 의학 대학에서 동물 실험실의 직원을 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 시각을 준비 하기 위한 킹 사우드 빈 압둘 아지즈 대학에서 미디어 팀을 인정 하 고 싶습니다 자료 특히 Muath 빈 Ghannam 및 Abdulwahab Alsulami.

프로토콜의 킹 사우드 대학 윤리 위원회 동물 보호 지침을 따릅니다. 수술 절차, 마 취약, 그리고 동물에 이용 된 다른 약물 킹 사우드 대학 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 실험 작업은 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 됩니다.
1. 셀 시트 건설
<ol><li>Undiluted 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 요리 (3.5 cm 온도 응답 문화 요리) 코트와 접시의 모든 표면을 커버를. 참고:이 단계는 단층에는 세포의 성장을 지원 하 고 셀 집계를 방지 이후 셀 시트의 분리에 대 한 중요 하다.</li>
	<li>포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 위한 요리를 품 어.</li>
	<li>코팅된 요리에서 초과 FBS를 제거 하 고 요리 1 시간 이상 실 온 (RT)에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>3 셀 정지 준비: 1 x 106 HepG2 세포, BMMSCs, 1 x 106 HepG2 세포 및 (BMMSCs와 UCMSCs에 4: 1의 비율)에서 UCMSCs 가진 1 x 106 HepG2 세포.</li>
	<li>씨 각 레이블이 접시에 적절 한 세포 현 탁 액.</li>
	<li>DMEM 배양 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>셀을 포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>2. 셀 시트 분리
<ol><li>100% 셀 합류에서 37 ° C 배양 기에서 요리를 가져가 라.</li>
	<li>HepG2/BMMSC 및 HepG2/UCMSC 셀 시트 요리 포함 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 20 ° C에서 30-40 분 동안 잠복기 동안에 RT, 1 시간에 대 한 HepG2 세포 시트 접시를 품 어. 참고:만 HepG2에서 만든 셀 시트는 깨지기 쉬운; 20 ° C에 온도 감소 하면 시트의 구조에 손상을.</li>
</ol>3입니다. 수술의 성능
참고: 셀 시트 분리에 대 한 보육 시간 동안 동물 절차 시작.
<ol><li>
수술의 준비에 대 한 지침
	<ol>
<li>후드, 층 류 캐비닛, 등 무 균 수술 실, 실험실 내에서 살 균 별도 영역에서 모든 수술 절차를 수행 합니다. 수술의 모든 표면 비 다공성, 봉인, 내구성, 그리고 sanitizable 인지 확인 합니다.</li>
		<li>스크럽, 장갑, 검, 및 머리 및 구두 덮개를 포함 하 여 적절 한 보호 장구를 착용 하십시오.</li>
		<li>수술에 사용 하는 도구는 깨끗 하 고 소독 (압력가 마로 소독을통해 , 높은 압력에서 포화 줄기) 시작 부분에서의 수술.</li>
		<li>장갑을 쥐 사이 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술에 대 한 동물의 준비
	<ol>
<li>8 월에 12 주 된 누드 쥐를 사용 합니다.</li>
		<li>쥐에 대 한 주사 마 취를 만듭니다.<ol>
<li>마 취 솔루션을 준비, 케 타 민-xylazine, 2 mL의 마 취 제 (20 mg/mL의 농도)에 xylazine의 1 mL, 멸 균 생리 식 염 수 (예를 들어, 0.9% 염화 나트륨) 살 균 10 mL 혈 청 컬렉션 유리병에서의 1 mL를 혼합 하 고 전에 잘 흔들어 사용 하 여.</li>
			<li>마 취를 적용 하려면 intraperitoneally 쥐의 몸 무게의 100 g 당 케 타 민 xylazine 솔루션의 0.2 mL를 주사. 참고: 솔루션의 총 복용량은 100 mg/kg의 마 취 제 및 xylazine의 10 mg/kg 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수술 사이트에서 보이는 먼지/이물질을 제거 합니다.</li>
		<li>페달 철수 반사 (두 뒷 발에 발 패드 핀치)을 테스트 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다. 참고: 발 패드 핀치에 응답 하면 복용량의 0.05 mL/100 g (약 매 30 분), 반복 다음 마 취 깊이 다시 확인 합니다.</li>
		<li>Povidone-요오드/소 프로 파 놀에 의해 2 단계 스크럽으로 수술 영역을 치료.</li>
		<li>절 개의 오염을 피하기 위하여 무 균 드 레이프와 쥐를 커버.</li>
		<li>Buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 쥐를 피하 주사8 절 개를 하기 전에.</li>
		<li>살 균 메스를 사용 하는 7-하-10cm 스킨과 간 노출 기본 근육 사이 컷 확인 합니다.<ol>
<li>메스의 편평한 뒤 가장자리 피부에서 복 부 근육을 구분 합니다.</li>
			<li>조심 스럽게 찔 러는 교육 알바 메스를 사용 하 고 날카로운가 위 컷을 확장.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 시트 이식
참고: 셀 시트 이식 간에 수행 됩니다.
<ol><li>문화 요리에서 셀 시트를 수집 합니다.<ol>
<li>부드럽게 벤치 시트는 표면에서 분리를 통해 문화 접시를 누릅니다.</li>
		<li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 30 원에 시트의 가장자리를 된다고 하 여 접시의 표면에서 셀 시트를 구분 합니다.</li>
		<li>부드럽게 문화 접시에서 전체 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>어떤 손상도 없이 그대로 시트 확인 그렇지 않으면, 그것은 수 없습니다 (그림 1)을 사용. 참고: 결과 시트를 직접 눈으로 감지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 시트 접시에서 수확 살 균 막 (종이 필터)를 준비 합니다.<ol>
<li>첫째, 일반적인 염 분으로 막 담가. 그런 다음, 메 마른 목화 패드와 함께 과잉 염 분을 제거 합니다.</li>
		<li>주름과 기포 막과 셀 시트 사이 피하 면 서 젖은 막 셀 시트 장소.</li>
		<li>막 그리고 그들을 쉽게 수집 하 셀 시트 정상적인 염 분의 몇 방울을 추가 합니다. 참고: 셀 시트를 위반을 피하기 위해, 하 하지 차가운 식 염 수를 사용 하 고 집게와 막 셀 시트를 올려.</li>
		<li>셀 시트는 막에 제대로 장착 되었는지 확인 하려면 몇 초 동안 막 두고 그것을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간 세포 시트 이식에 대 한 준비.<ol>
<li>간 표면 살 균 목화 패드와 함께 부드럽게 그것을 활용 하 여 건조 하다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 셀 시트와 막 쥐의 간 단일 엽 놓습니다.</li>
		<li>살 균 염 분의 몇 방울을 추가 하 고 그것에서 셀 시트 분리 막에 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>신중 하 게 막 제거 하기 전에 5 분 기다립니다. 참고:이 셀 시트 제대로 간 연결 위해 수행 됩니다.</li>
		<li>마지막으로, 기본 근육 닫고 5-0 나일론 봉합 절 개 피부.</li>
		<li>Povidone-요오드와 수술 영역을 치료. 참고: 그림 2 누드 쥐의 간장에 셀 시트 이식 절차의 다이어그램을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 수술 후 관리
<ol><li>즉시 수술 후, 식인 풍습 또는 질 식, 방지 하려면 개별적으로 쥐를 집 고 그것은 정기적으로 (매 15 분) 모니터링 의식과 완전히 ambulant 때까지.</li>
	<li>그런 다음, post-operatively, 합병증을 매일 5-14 d, 5 d 이상에 대 한 쥐를 평가 합니다. 매일 평가 하는 동안 다음의 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>상처가 닫히고는 봉합 지나치게 꽉 되지 않고 그대로 있습니다.</li>
		<li>과도 한 열, 등 절 개 사이트에서 감염의 흔적은, 붓기 또는 purulent 방전.</li>
		<li>통증, 음식 및 물 소비를 감소, 체중 감소, 탈수, 피부 tenting, 또는 빠르고 오픈 입 호흡 등와 관련 된 흔적을 확인 하 고 있습니다. 제어 심한 수술 후 통증에 적당 한 경우, 주사 쥐 피하 buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 최소 48-72 h에 대 한 모든 6-8 h9 postoperatively.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 이식된 지역 분석
<ol><li>Scarifice 쥐 이식 후 한 달에 대 한 이식된 지역 수집 조직학 및 immunohistochemical 분석.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

연구의 광범위 한 금액은 적절 한 비보에 전 임상 동물 모델 인간의 암과 유사한 개발에 전념 하 고 있습니다. 현재, 암 동물 모델을 만드는 데 사용 하는 주요 접근 유전 공학 및 세포 이식11를 포함 한다. 유전자 변형된 동물 모델 식별 및 기본 약물 유발 독성 분자 메커니즘을 이해 뿐만 아니라 대상 유전자의 유효성 검사에 대 한 좋은 도구입니다. 그러나,이 모델은 관련 된 몇 가지 제한 사항이; 예를 들어, 주어진된 유전자의 수정 예상된 형12항상 발생 하지 않습니다. 세포 이식 접근은 더 일반적으로 동물, 암 유발 하는 데 사용 됩니다 그리고 그것은 암 세포 현 탁 액의 주입을 포함 한다. 그러나,이 간단 하 고 편리한 접근에는 그것의 자신의 단점이 있습니다. 세포 현 탁 액을 생성 하는 효소 소화 단계는 암 세포를 수확 하 사용 됩니다. 이 줄어 듭니다 engraftment 효율 이식된 세포의 접착 단백질의 일부의 손실에...

HCC는 간 크게 빈약한 예 지와 관련 된 기본 암입니다. 매년, 거의 절반 백만 새로운 환자 진단 HCC, 간 암 환자 세계1의 85%를 대표 하는. Hepatocarcinogenesis는 단일 형태의 질병; 오히려, 그것은 이외에 다른 histopathological 기능 및 유전자와 게놈 다양성, 질병의 모음 다양 한 전조 결과1. 따라서, HCC에 대 한 효과적인 치료 전략의 개발의 주요 과제는 HCC 생물학의 제한 된 지식과이 복잡 한 질병을 이해 하는 것을 도울 수 있는 적합 한 실험 동물 모델의 부족. Vivo에서 동물성 모형 인간 암 모방 하는 후보 유전자를 선택 하 고 연루 조사 암 응답에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 뿐만 아니라 암 유도, 전조/예측 마커 식별에 필요한 치료 요원입니다.
시험관에 암 연구는 여전히 주요 한계에 연관 된다. 이 사실은 암 세포 기능의 그들의 비보에 문화에서 유지 될 때 많은 손실입니다. 세포 생체 외에서 결과 비보 전 설정에서 전체 조직 생리학의 부재에서 발생 하는 변경 합니다. 암 세포 세포 상호 작용 (실질, 면역, 맥 관 구조, 상피, 등) 종양 microenvironment 내 암 세포 특성2에 크게 반영합니다. 종양 microenvironment 암 세포 유전자/단백질 표정 및 angiogenetic 및 전이성 잠재력 phenotypic 특성을 변경할 수 있습니다. 2 차원 (2 차원) 생체 외에서 문화 시스템은 또한 종양의 진행을 조절 하는 데 필요한 적합 한 조직 매트릭스를 결여 된다. 따라서, 이러한 제한으로 인해 모델 vivo에서 항상 체 외에 모델의 예비 결과 지원 하기 위해 활용 되어야 합니다. 이 연구에서 우리는 vivo에서 동물 모델을 기본 HCC 완전 한 생물학 과정을 보통 개발 하 셀 시트 기술을 사용 합니다.
이상 10 년 전, 오 카노의 실험실 설립 셀 시트 기술3에 따라 조직 공학의 새로운 방법. 이 기술은 표면 hydrophobicity를 제어 하 여 가역 세포 접착/분리 수 있도록 온도 응답 문화 플라스틱을 이용 한다. 이 메서드는 잘된 세포 외 기질 (ECM) 및 셀 상호 그대로 3 차원 (3 차원) 형식 (i.e.,cell 시트), 배양된 세포의 부드러운 수확을 수 있습니다. 셀 시트 기술은 상업적으로 사용할 수 및 사용할 준비가 문화 요리 (PIPA) 오전, 온도 반응 중합체 poly(N-isopropylacrylamide) precoating을 해야 합니다. 온도 20 ° c에서 PIPA 오전 고분자 화 되 고 반면, 더 높은 온도 (37 ° C)에서 중합체 탈수 되 고 혼 탁 한 침전 변환 수성 솔루션에 용 해. 고분자는 친수성 아 미드 체인 및 소수 성 측 쇄 (이소프로필 그룹)를 포함합니다. 높은 온도에서 물 분자의 브라운 운동 강화입니다, 반면에, 낮은 온도에서 수산화 구조 분석의 이소프로필 그룹 및 소수 성 이소프로필 그룹을 둘러싼 물의 분자 집계 때문에 소수 성 상호 작용. 따라서, 고분자의 전체 체인 집계 하 고 침전 물이4.
제시 연구에서이 기술은 세 가지 다른 셀 시트를 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발 채택 된다. 첫 번째 시트 고용 이루어져 HCC 셀 라인만, 반면 다른 두 시트 HCC 셀 라인 셀과 두 개의 서로 다른 소스에서 MSCs의 조합으로 구성: 골 MSCs (BMMSCs) 및 탯 MSCs (UCMSCs). MSCs는 비 조 혈 stromal 세포 adipocytes, 등 osteocytes, chondrocytes, myocytes5엽 혈통의 intocell 파생 상품을 차별화 할 수 있다. 암 셀 시트를 만들 때 이러한 세포를 사용 하는 우리가 하는 이유는 암에 MSCs의 효과에 일치 하지 않는 보고. MSCs가 두 가지 고기를 가질 수 있습니다 제안 되었습니다: "MSC1", proinflammatory 표현 형 및 "MSC2", 면역 표현 형6. MSCs는 수용 체 통행세 같이 (TLRs)를 표현 한다. MSCs의 TLR4 못쓰게 TLR3 못쓰게 면역 요인6의 그들의 분 비를 증가 하는 반면 proinflammatory 요인의 그들의 분 비를 증가 시킵니다. 이러한 두 고기의 생체 외에서 연구 보고 MSC2 공동 문화 반대 효과7를 했다 하는 동안 암 세포 라인 MSC1의 공동 문화 암 세포 성장를 감쇠. 이 연루 MSCs 프로 암 또는 항 암 제, 그들의 표현 형에 따라 될 수 있습니다. 따라서, 셀 시트 기술을 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발, 뿐만 아니라 우리 종양 개발에 MSC 이식의 효과 탐험 하고자 이러한 세포를 사용 하 여 것입니다 향상 여부 등이 모델의 개발을 줄이기 위해.

<table><tbody><tr><td><강력한>시약&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고혈당&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>멸균 생리적 식염수</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>인간 HepG2 세포주</td><td>ATCC, USA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>인간 골수 MSC 세포주</td><td>PromoCell, USA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>인간 탯줄 조직 MSC</td><td>PromoCell, USA&nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>케타민 50%</td><td>Rompun, 바이엘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자일라진 2%</td> <td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>알파딘&reg; &nbsp; 용액.</td><td>리야드 제약</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>일회용품:&nbsp; </강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 고선명도 PP 원심분리기 튜브</td><td>팔콘&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 여과지(멤브레인)가 있는 3.5cm 멸균 UpCell 배양 접시Sigma</td><td></td> <td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; 엘 &nbsp; 피펫 팁&nbsp;</td><td>시그마</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>기본 절차 드레이프</td><td>써모피셔</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 피펫, 가변 용량</td><td>Eppendorf&reg; &nbsp; 연구&reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터 20°°C; C, 5% CO2</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr>의 <tr><td>멸균 수술 도구 및 누드 쥐:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 나일론 봉합사&nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>모노필라멘트, 란셋</td></tr><tr><td>1 ml 투베르큘린 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>누드 쥐&nbsp;</td><td>찰스 강</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

vivo 동물 모델을 모방한 인간의 암 중요 한 임상 정보를 제공 하는 다양 한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. Vivo에서 암 모델의 개발에 대 한 현재 사용 된 기술에는 상당한 제한이. 따라서, 본이 연구에서는 우리 셀 시트 기술을 vivo에서 암 모델 개발을 구현 하고자 합니다. 간세포 암 (HCC) 누드 쥐 HCC 셀 선 세포에서 만들어진 셀 시트를 사용 하 여 성공적으로 개발 됩니다. 암 셀 시트는 세포내 접착 및 세포 외 매트릭스 제어 층 상된 구조 형성을 통해 생성 됩니다. HCC 시트 이식 간 고 한 달 내 종양-베어링 동물 모델의 생성에 대 한 수 있습니다. 또한,이 암 모델 개발에서 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 역할은 조사. HCC 셀 라인 시트 외에 다른 두 셀 시트 만들어집니다: HCC 세포와 골 MSCs (BMMSCs)와 HCC 전지와 탯 MSCs (UCMSCs)의 시트의 시트. HCC 세포와 MSCs의 시트는 종양 방위 동물을 생산 할 수 있습니다. 그러나, MSCs의 추가 구성 된 종양의 크기 줄이고 종양 개발에 불리 한 영향이 사용된 MSCs의 소스에 따라 달라 집니다. 이 특정 MSC의 만든 셀 시트 종양 관리 및 제어에 활용 될 수 나타냅니다.

쥐에 이식된 셀 시트 tumorigenicity:
이식 후 1 개월 쥐의 간은에서 모든 이식된 셀 시트 종양 (그림 3)를 개발 했습니다. HepG2, HepG2/BMMSC, HepG2/UCMSC 셀 시트에서 개발 된 종양의 평균 크기 4.5 cm, 4 cm, 및 2.5 cm, 각각10했다.
간 조직의 조직학 분석:
되며 고 오신 (H &amp; E) 비 이식 쥐 hepatocytes와 간은 서...

여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

안녕하세요, 저는 줄기세포 및 재생의학과의 킹 압둘라 국제 의학 연구 센터의 알라 알샤레다 박사입니다. 오늘 우리는 cell sheet 기술을 사용하여 중간엽 줄기세포가 쥐 모델에서 간세포 암종의 발달에 미치는 영향을 시연할 것입니다. 안녕하세요, 저는 압둘라 알무바라크입니다.저는 King Saud University의 실험 외과 및 동물 실험실에서 일하고 있습니다. 우리는 세포 시트를 이식 한 후 거부 반응을 피하기 위해 누드 쥐를 사용합니다. 이 다이어그램은 나체의 쥐에 대한 세포장 이식 절차를 보여줍니다.이 연구에는 8주에서 12주 된 나체의 쥐가 사용될 것입니다. 먼저, 쥐를 잘라내고 메스를 사용하여 피부와 근육 사이를 7-10cm 간격으로 잘라 간을 노출시킨다. 세포 시트를 옮기려면 멸균 멤브레인을 사용하십시오.세포판 위에 멤브레인을 놓아 수집합니다. 그런 다음 세포막이 있는 세포판을 간의 한쪽 엽 위에 놓습니다. 셀 시트 구조.세포를 파종하기 전에 3.5cm 온도 반응형 UpCell 배양 접시에 희석되지 않은 FBS를 코팅합니다. FBS로 접시를 코팅하면 막층에서 세포의 성장을 지원하고 세포의 분해를 방지할 수 있습니다. 접시의 모든 표면을 덮으십시오.이산화탄소 5%와 공기 95%를 포함하는 가습한 대기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 접시를 배양합니다. 다음 날에는 여분의 FBS를 제거하고 접시를 실온에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 최소 100만 개의 HepG2 암세포를 단독으로 또는 중간엽 줄기세포와 공동 배양하여 DMEM 배양 배지에 시딩합니다.배지에는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충되었습니다. 이 연구에서 사용된 암세포와 중간엽 줄기세포의 비율은 4:1입니다. 세포를 추가한 후 접시를 부드럽게 흔듭니다.5%의 이산화탄소와 95%의 공기를 포함하는 가습된 분위기에서 섭씨 37도의 세포를 배양합니다. 셀 시트의 분리. 100% 세포 합류점에서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다.이제 HepG2 암세포 시트를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 중간엽 줄기세포와 공동 배양된 HepG2를 95%의 공기에서 5%의 이산화탄소를 포함하는 가습 분위기에서 섭씨 20도에서 30-40분 동안 배양합니다. 배양 시간 동안 세포 시트 박리를 위한 동물 절차를 시작합니다. 동물에 대한 모든 연구는 King Saud University 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.수술 절차를 수행합니다. 페달 철수 반사를 테스트하여 마취 깊이를 확인하십시오. 수술 부위를 요오드로 소독합니다.이제 요오드가 함유된 두 번째 스크럽을 바른다. 절개 부위가 오염되지 않도록 멸균 된 드레이프로 동물을 덮으십시오. 살균된 메스를 사용하여 피부와 근육 사이를 7-10cm 크기로 절개하여 간을 노출시킵니다.메스의 평평한 뒤쪽 가장자리로 복부 근육을 피부에서 분리합니다. 리네아 알바를 메스를 사용해 정중하게 찌르고 날카로운 가위로 상처를 늘린다. 쥐의 간에 세포판 이식.배양 접시를 벤치 위로 부드럽게 두드려 표면에서 시트를 분리합니다. 시트 가장자리를 반원으로 긁어 접시 표면에서 셀 시트를 분리합니다. 이제 접시에서 모든 배양 배지를 부드럽게 제거합니다.시트가 손상되지 않았는지 확인하고 그렇지 않으면 사용할 수 없습니다. 세포 시트를 수확하고 옮길 무균 멤브레인을 준비합니다. 따라서 먼저 멤브레인에 일반 식염수를 적신 다음 멸균 면봉으로 과도한 식염수를 제거합니다.젖은 멤브레인을 세포 시트 위에 놓고 멤브레인과 세포 시트 사이에 기포가 생기지 않도록 합니다. 물질을 수집하기 위해 멤브레인과 세포 시트 위에 생리식염수 몇 방울을 떨어뜨립니다. 세포 시트가 멤브레인에 제대로 부착되었는지 확인하기 위해 멤브레인을 몇 초 동안 그대로 두었다가 수집합니다.이제 이식을 위해 간을 준비합니다. 간 표면이 건조한지 확인하십시오. 세포판이 있는 막을 쥐 간의 한쪽 엽 위에 놓습니다.멸균된 식염수 몇 방울을 떨어뜨려 세포막에서 세포판을 분리합니다. 멤브레인을 조심스럽게 제거하기 전에 5분 동안 기다립니다. 이 비디오에서 세포 시트가 간에 부착되어 있는 것을 볼 수 있습니다.마지막으로 5개의 나일론 봉합사로 밑아래 근육과 피부 절개 부위를 봉합합니다. 절개 부위를 봉합한 후 베타딘으로 수술 부위를 소독합니다. 마취제를 벗고 머리를 들 때까지의 시간은 가변적이지만 일반적으로 5분에서 20분 사이입니다.이 그림은 HepG2 세포장 이식 1개월 후 쥐의 간에 발생한 종양을 보여줍니다. 여기서, 종양은 HepG2 암세포와 골수 중간엽 줄기세포를 이식한 세포판을 이식한 후 개발되었습니다. 이 그림은 HepG2 암세포와 탯줄 중간엽 줄기세포로 만든 세포장 이식 후 쥐의 간에 발생한 가장 작은 종양인 반면, 이 그림은 세포장 이식 1개월 후 쥐의 간이 H와 E로 염색된 것을 보여줍니다.여기서 A는 정상적인 쥐의 간세포를 나타내고, B는 암에 걸린 쥐의 간세포를 나타낸다. 결론. 따라서 이 비디오를 시청한 후에는 Cell Sheet 기술을 사용하여 누드 쥐에서 간세포 암종 모델을 개발할 수 있을 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

병아리 융모대질막(CAM)은 면역결핍이며 혈관화가 심하여 종양 성장 및 혈관 신생의 자연스러운 생체 내 모델입니다. 이 프로토콜에서는 CAM 분석을 사용하여 3차원, 혈관화된 간세포 암종(HCC) 종양을 성장시키는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

준비와 쥐 모델에서 부족 하 게 봉합 대 장 anastomoses에 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC) 시트의 이식 제공 됩니다. 이 새로운 응용 프로그램은 ASC 시트 대 장 문 합 누출을 줄일 수 있습니다 보여줍니다.

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

이 문서에는 유리한 줄기 세포 재산으로 다층된 줄기 세포 시트를 건설 하기 위한 효율적이 고 실현 가능한 방법을 제공 합니다.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

간 질환은 섬유증이나 간경변증을 촉진하는 많은 원인에 의해 유도됩니다. 이식은 건강을 회복하기위한 유일한 옵션입니다. 그러나 이식 가능한 장기의 희소성을 감안할 때 대안을 모색해야합니다. 우리의 연구는 동물 모델에서 간 조직에 콜라겐 비계의 이식을 제안한다.

간 재생 전략으로 3차원 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 이식

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

배우세요 세포 시트 기술을 이용한 누드 래트 간세포 암종 모델 개발 방법입니다. 중간엽 줄기세포가 종양 성장에 미치는 영향을 관찰하고 항암 치료제 효능 평가를 위한 신뢰할 수 있는 생체 내 암 모델을 구축할 수 있습니다.

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