TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링
January 23rd, 2019
탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.
이 방법은 게놈과 더불어 세포 모형 특정 방식으로 얼마나 많은 색채 수정이 통제되는지와 같은 후성 유전학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 표적 세포에서 크롬토닌을 분리한 다음 전형적인 집시 다운스트림을 따를 수 있다는 것입니다. 그래서이 방법은 뉴런 특정 트리밍실에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, lysinc 4, opisoncilly.
그것은 또한 다른 히스톤 수정, 다른 세포 유형 및 기타 모델 유기체에 적용 될 수있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 마리 미토 (Mari Mito)가 될 것입니다. 시작하려면, 작은 조각으로 관심의 조직을 해부 미세 스프링 가위를 사용합니다.
액체 질소로 채워진 깨끗한 용기에 조직 조각을 추가합니다. 그런 다음, 액체 질소로 채워진 2개의 밀리리터 관으로 조직 단편을 전송합니다. 액체 질소를 증발시키기 위해 캡을 열어 5 분 동안 영하 80도에서 튜브를 저장합니다.
차가운 금속 얼음 랙에 조직 샘플을 포함하는 튜브를 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 금속 총알을 넣고 액체 질소로 식힙니다. 차가운 금속 총알을 샘플 튜브 중 하나에 놓습니다.
캡을 닫고 튜브를 극저온 분쇄기의 튜브 홀더에 넣습니다. 즉시 조립된 튜브 홀더를 액체 질소에 1분간 담급드세요. 냉동 튜브 홀더를 극저온 분쇄기의 외부 카세트에 삽입합니다.
그리고 30 초, 60 번 격렬하게 흔들어. 그 후 극저온 분쇄기를 분해하고 금속 탄환을 제거합니다. 그리고 튜브를 미리 차가운 샘플 쿨러에 넣습니다.
쿨러를 음의 섭씨 20도에서 15분간 보관하십시오. 그런 다음 튜브와 파이펫에 1% 포름알데히드의 900 마이크로리터를 첨가하여 혼합합니다. 서스펜션을 1%포름알데히드의 900 마이크로리터가 있는 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기습니다.
다음으로 서스펜션을 섭씨 23도에서 부드러운 회전으로 10분 간 수정합니다. 고정 반응을 중지하려면 튜브에 2.5 개의 어금니 글리신100 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 섭씨 4도에서 5 분 동안 3, 000 배 중력에서 원심 분리기.
이 후, 슈퍼 상복부를 폐기. 튜브와 소용돌이에 PBS 1 밀리리터를 추가하여 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분간 3, 000배 의 중력원심분리기.
이 워시 스텝을 두 번 더 반복하십시오. 다음으로, 혼합펠릿과 파이펫에 500 마이크로리터의 리시스 버퍼 하나를 추가합니다. 튜브를 섭씨 3, 000회에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다.
혼합 펠릿과 소용돌이에 2 의 리시스 버퍼 2의 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오. 그 후, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 무선 면역 침전 분석 아세이 버퍼 800마이크로리터를 펠릿과 파이펫에 첨가하여 혼합한다.
섭씨 4도에서 3, 000배의 중력에서 5분간 서스펜션을 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 다음으로, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 RIPA 버퍼 500마이크로리터를 펠릿에 넣습니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오.
프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼를 추가한 직후, 용양을 초음파 튜브로 옮길 수 있습니다. 그리고 초음파 검사기에 튜브를 배치합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 크로마틴을 전단합니다. 이어서, 샘플을 1.5 밀리리터 단백질 저결합 튜브로 이송한다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 20, 000 배 중력에서 5 분 동안 그것을 분리합니다.
샘플에서 상체를 수집하고 새로운 단백질 낮은 결합 튜브로 전송합니다. 이 프로토콜에서, 탠덤 크로마틴 면역 침전 시퀀싱이 도입되고 입증되었다. 시술 도중, DNA의 질은 다중 단계에서 시험되었습니다.
초음파 처리 직후, 전단 된 DNA는 미세 유체 전기 포세이스 기계로 분리되고 테스트되었습니다. 항플래그 항체 및 항H3K3me3 항체를 사용하여 친화 정화를 수행한 후 DNA 품질을 다시 확인하였다. H2B-FLAG에 DNA의 면역 정화의 특이성은 부정적인 대조군 샘플로 확인되었다.
무시할 수 있는 양의 DNA가 검출된 곳. 프로토콜에 추가하여 시퀀싱 라이브러리의 품질이 확인되었습니다. 성공적인 ChIP 및 T-ChIP는 GAPDH 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 농축 분석을 통해 입증되었습니다.
3개의 신경 유전자를 따라 대표적인 재분배가 얻어졌습니다. 그리고 전체 뇌T-ChIP 추구를 통해 추구하는 뉴런 T-ChIP에 의해 유전자의 다섯 가지 끝에서 읽기의 농축이 관찰되었다. 안정화 후, 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구원들이 쥐의 뉴런에서 세포 유형 특정 히스톤 변형 일반을 탐구하는 길을 열어줍니다.
포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 고무 의류와 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것은 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 문서는 탠덤 염색질 면역침전 시퀀싱(tChIP-Seq)에 대한 상세한 프로토콜을 제시하며, 게놈 내 세포 유형별 히스톤 수식을 분석하는 데 있어서의 적용 가능성을 강조합니다. 대상 세포에서 염색질을 분리하여, 이 방법은 연구자들이 후성유전 조절을 탐구하고 뉴런 특이적 히스톤 수식에 대한 통찰력을 풍부하게 하는 것을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 후성유전학
- 히스톤 수식 분석
- 세포 유형 특이성
배경
- 세포 기능에서 염색질 수식의 중요성
- 뉴런 발달 및 기능을 이해하기 위한 잠재력
- 히스톤 수식을 연구하기 위한 정밀한 방법의 필요성
사용된 방법
- 탠덤 염색질 면역침전 시퀀싱(tChIP-Seq)
- 생물학적 모델로서의 마우스 뉴런 세포
- DNA 품질 검증을 위한 친화성 정제 및 전기영동
주요 결과
- 뉴런 세포 특이적 히스톤 수식의 농축 확인
- 부정적 대조군을 사용한 면역 정제의 특이성 입증
- 뉴런 유전자에 걸친 히스톤 수식의 상세 관찰
결론
- 이 연구는 세포 유형별 방식으로 히스톤 수식을 탐구하기 위한 귀중한 프로토콜을 제공합니다.
- 특히 뉴런 생물학의 이해에 있어서 후성유전학 연구 발전에 있어서 tChIP-Seq의 중요성을 강조합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
