Name: TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 학습하세요 tChIP-Seq 방법을 통해 마우스 뉴런 세포에서 세포 유형 특이적 히스톤 변형을 분석하는 기법을 익히세요. 이 프로토콜은 에피게네틱 연구와 뉴런 생물학 이해에 중요한 도구를 제공합니다.

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우리는 원고의 중요 한 독서의 이와사키 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 작품은 의해 부분적으로 지원 한 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (S.N. 고 S.I. 하 JP17H05679 #26113005); 젊은 과학자 들에 대 한 특정 (A) (JP17H04998 S.I. 하) 교육, 과학, 스포츠, 및 일본 (MEXT);의 문화에서 그리고는 개척 프로젝트 "세포 진화"와 모든 RIKEN 프로젝트 "질병 및 Epigenome" RIKEN에서 (S.N. S.I. 하)입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드를 RIKEN (H27-EP071)의 안전 부문에 의해 승인 하 고 관련 지침 및 규정 실시 되었습니다.
1. 조직 해 부
<ol><li>작은 조각으로 관심의 조직 부 (약 < 3 m m2) 좋은 봄이 위를 사용 하 여. 참고: 큰 조직 파편, 동결 하는 데 걸리는 그리고 작은 조각 버퍼, 결과 영향을 미칠 수 있습니다 둘 다의 더 큰 볼륨에 수행 한다.</li>
	<li>액체 질소로 채워진 깨끗 한 용기에 해 부 조직 파편을 추가 하 고 액체 질소로 채워진 2 mL 튜브 (관 당 1 조각)으로 그들을 수집 합니다. 참고:이 단계는 친수성 표면 튜브 권장 됩니다.</li>
	<li>> 5 분 남은 액체 질소를 증발 오픈 캡-80 ° C에서 튜브를 놓습니다. 참고: 뚜껑을 닫은 후 조직 조각은 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 사용 하기 전에 한 달 동안.</li>
</ol>2. 셀 고정
참고: 우리는이 단계에 대 한 편리한 저온 분쇄기를 사용. 다른 장치를 사용할 수 있습니다.
<ol><li>장소는 2 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 금속 얼음 선반에 조직 샘플을 포함 하는 액체 질소에 차게.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 액체 질소로 냉각 금속 총알을 놓습니다. 금속 얼음 선반에 놓습니다.</li>
	<li>2 mL 튜브를 열고 튜브에 prechilled 금속 총알을 배치 합니다. 뚜껑을 닫고, 편리한 저온 분쇄기의 튜브 홀더에 2 mL 튜브를 설정 하 고 즉시 1 분 액체 질소에 조립된 튜브 홀더를 찍어.</li>
	<li>고정된 튜브 홀더 편리한 저온 분쇄기의 외부 카세트에 넣고 30 60 시간을 적극적으로 악수 s.</li>
	<li>튜브 홀더를 분해, 금속 총알을 제거 하 고 장소 2 mL 튜브 샘플 쿨러에-20 ° c.에 prechilled</li>
	<li>다음 단계에서 정착 액의 동결을 방지 하기 위해 15 분 동안-20 ° C에 샘플 쿨러를 놓습니다.</li>
	<li>샘플 쿨러 벤치, 튜브의 뚜껑을 열고 가져오고 즉시 그것에 1% 포름알데히드의 900 µ L를 똑. 여러 번 pipetting 후 새로운 2 mL-튜브 1% 포름알데히드와 23 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에서 부드러운 회전으로 10 분에 대 한 수정 프로그램의 900 µ L를 포함으로 정지 전송 주의: 포름알데히드는 유독 하 고 유해한입니다.</li>
	<li>중지 하려면 고정 반응, 각 튜브와 4 ° c.에 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기를 100 µ L 2.5 M 글리신의 추가 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총에서 3 세척)를 반복 합니다. 참고: 고정된 샘플 플래시-액체 질소로 냉동 고-80 ° c.에 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 1 500 µ L 추가 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (pH 8.0), 10 %w / v 글리세롤, 0.5 %w / v NP-40, 0.25 %w / v Triton X-100, 그리고 0.1 x protease 억제제 칵테일) 펠 릿, 피펫으로 여러 번 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 회전 참고: 세포의 용 해 버퍼 1 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다.</li>
	<li>4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 2의 1 mL을 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.5 m m EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 0.1), 펠 릿을 소용돌이, 4 ° c.에서 10 분 동안 회전 하는 고 참고: 세포의 용 해 버퍼 2 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다.</li>
	<li>4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>펠 릿을 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.</li>
</ol>3입니다. chromatin 전단
<ol><li>Sonicator 튜브는 lysate 전송 하 고 튜브를 ultrasonicator에 놓습니다.</li>
	<li>다음 설정으로는 chromatin 전단: 온도: 4 ° C; 피크 사고 전력: 175 W; 의무 비율: 10%; 사이클/버스트: 200; 그리고 시간: 2400 s.</li>
	<li>1.5 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 및 4 ° c.에 20000 x g에 5 분 동안 원심 분리기 샘플을 전송</li>
	<li>새로운 단백질 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다. 참고: 샘플 수 있습니다 플래시-액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장</li>
</ol>4. 품질 검사 DNA (가교 역)
<ol><li>lysate의 믹스 20 µ L 및 칩 차입 버퍼의 180 µ L (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 그리고 1 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에서. 65 ° c 6 h 열 cycler 뚜껑 오픈에 대 한 열 cycler에서 샘플을 품 어. -변성을 피하기 위해 열 cycler 오픈의 뚜껑을 유지. 참고: 칩 차입 버퍼 필터링 및 사용 하기 전에 실내 온도에 저장 되어야 한다. 이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.</li>
	<li>추가 10 mg/mL RNase의 1 µ L, 소용돌이, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>추가 15 mg/mL의 6.5 µ L 성분을 K, 소용돌이, 그리고 60 분 55 ° C에서 품 어.</li>
	<li>전송 DNA 낮은 바인딩 튜브에 대 한 반응, 5 mg/mL glycogen, 그리고 소용돌이의 4 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 실 온에서 18000 x g에서 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1) 및 5 분 동안 원심 분리기의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>새로운 DNA 낮은 바인딩 튜브는 상쾌한 전송. 트리 스-EDTA-NaCl 버퍼의 200 µ L 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 및 200 mM NaCl) 나머지 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 솔루션을 실 온에서 18000 x g에 5 분 동안 원심 분리기. 상쾌한을 수집 하 고 첫 번째 상쾌한 혼합.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 에탄올의 900 µ L을 추가 하 고 1 시간-20 ° c.에 대 한 품 어 참고:이 화 4-6 h를 확장할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기</li>
	<li>폐기는 상쾌한. 펠 릿을 4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기 차가운 75% 에탄올의 1 mL을 추가 (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 철저 하 게 무시 하 고 실 온에서 1 분 동안 건조.</li>
	<li>트리 스-EDTA (테) 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 그것은 30 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 하룻밤 배양 하 여 DNA를 분해. Vortexing 또는 pipetting 하지 마십시오. "입력"으로이 DNA를 유지 하 고 필요한 경우 라이브러리 준비를 위해 그것을 사용.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 fluorometer DNA 농도 측정 ( 테이블의 자료를 참조) 미세 전기 기계와 크기 분포를 확인 하 고 ( 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조 2A). 사용 10 ng 또는이 분석 결과 대 한 더 적은 DNA. 참고: 100-500의 기본적인 쌍 (bp)의 파편 DNA의 50% 이상을 해야 합니다.</li>
</ol>5. 친 화력 정화 반대로 플래그 항 체에 의해
참고: 신경 tChIP-Seq, 8 쥐에서 뇌 조직은 일반적으로 사용 tChIP-Seq의 한 샘플에 대 한 2를 준비 하 협동 면역-정화에 의해 순화 된 DNA의 ng (단계 7.1 참조). 우리의 손에서 0.1 ng의 DNA 여전히 제공 높은 품질 DNA 라이브러리 칩 Seq (회, 미 출판). 따라서, 이론적으로, 단일 마우스 신경 tChIP-이 수행 하기에 충분 한 있을 수 있습니다. 필요한 금액은 관심의 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 되어야 합니다. Imumuno 정화 실험의 부정적인 컨트롤에 대 한 뇌 조직의 lysate H2B 플래그 식 없이 쥐에서 해야 될 준비 하 고 사용.
<ol><li>단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 면역 글로불린 G (IgG)를 활용 하는 자석 구슬의 200 µ L 플라스틱</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS 및 소용돌이의 1 mL을 추가. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1 mg/mL 반대로 플래그 항 체의 20 µ L을 추가 하 고 5 h 4 ° c.에 대 한 회전 참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.</li>
	<li>워시 다음 단계 5.2 구슬. 15 mL 튜브에 비즈를 놓습니다.</li>
	<li>RIPA 버퍼의 1110 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약 180 Denhardt의 솔루션 x 50 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 10 µ L, 3 단계에서에서 준비 lysate의 6.8 mL x 10의 900 µ L를 추가 합니다. 5 단백질 낮은 바인딩 튜브에이 혼합물을 분할. 6 h 4 ° c.에 대 한 회전 참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 5 회 (총에서 6 세척). 단일 단백질 낮은 바인딩 관으로 모든 구슬 풀.</li>
	<li>칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 4.11 ( 그림 2B와 C에서처럼 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.</li>
</ol>6. 친 화력 정화 안티-H3K4me3 항 체와 역방향 가교에 의해
참고: 있는 다음 구슬 준비 단계 (6.1-6.4) 단계 5.7 하기 전에 수행 되어야 한다.
<ol><li>2 mL-단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 IgG에 활용 된 자석 구슬의 40 µ L 플라스틱</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1 mg/mL 안티-H3K4me3 항 체의 4 µ L을 추가 하 고 6 h 4 ° c.에 대 한 회전</li>
	<li>워시 다음 단계 6.2 구슬. 2 mL 단백질 낮은 바인딩 관으로 구슬 놓습니다.</li>
	<li>RIPA 버퍼의 1558 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약, Denhardt의 솔루션 x 50의 40 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 2 µ L 및 준비 단계 5.7 eluate의 200 µ L x 10의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 회전 참고: 칩 차입 버퍼에 SDS이이 외피에 10 배 이상 희석 되었다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 4 회 (총에서 5 세척). 마지막 세척 후 DNA 낮은 바인딩 튜브에 비즈를 전송 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 새로운 DNA 낮은 bindingTube는 eluate 전송. 참고:는 eluate-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>DNA의 decrosslinking에 대 한 4 단계를 따릅니다. 20 µ L의 TE 버퍼에 순화 된 DNA를 resuspend.</li>
	<li>4.11 ( 2D 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. (선택 사항) 양이 많은 PCR에 의해 농축 분석 수행 이전2에 설명 된 대로. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.</li>
</ol>7. 도서관 건축
<ol><li>각 입력 및 칩 DNA 샘플에 대 한 미세 전기 기계에 대 한 소프트웨어의 얼룩 분석 기능을 사용 하 여 100-500-bp 지역에서 DNA의 비율을 계산 합니다. 추정 2를 얻을 하는 데 필요한 샘플 볼륨 100-500 bp DNA의 ng. 100-500-혈압 범위에 20 ng DNA를 사용 하 여 "입력된" 샘플으로.</li>
	<li>DNA 샘플 8 스트립 PCR 튜브에 플라스틱 고 다음 최종 수리 반응 및 크기 선택 H2O 10 µ L. (선택 사항) 총 볼륨을가지고 DNA의 볼륨 10 µ L, 비율을 초과 하는 경우를 추가 합니다.</li>
	<li>준비 끝-복구 마스터 믹스 ( 재료의 표참조). DNA에 최종 복구 마스터 믹스의 4 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>10 mM Tris-Cl, pH 8.5의 36 µ L을 추가 하 고 고체의 0.6 x 볼륨 (30 µ L) 가역 immobilization (SPRI) 자석 구슬 상 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>새로운 튜브에는 상쾌한 전송 SPRI 자석 구슬, 1.2 x 볼륨 (60 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분을 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>80%의 200 µ L로 두 번 구슬을 씻어 EtOH, 자석에 여전히 튜브를 들고.</li>
	<li>짧게 원심 튜브 하단에 잔여 EtOH를 수집 하 고 다시 제자리에 자석. 잔여 EtOH를 철저 하 게 제거 합니다.</li>
	<li>관 뚜껑을 증발 EtOH 수 있도록 1-2 분 동안 열어 둡니다.</li>
	<li>뚜껑 닫고 얼음에 튜브를 유지 합니다. 참고: 지금 당신을 가져올 구슬에 100-500 bp의 DNA 크기 선택. 더블 사이즈 선택에 대 한 자세한 내용은 제조업체의 웹 사이트 (www.beckman.com)에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>A-미행 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>A-미행 마스터 믹스의 10 µ L로 (단계 7.10)에서 구슬 resuspend와 30 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 1.8 x 볼륨 (18 µ L)를 추가 / NaCl 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>단계 7.7-7.11 DNA를 정화 합니다.</li>
	<li>결 찰 버퍼 믹스를 준비 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>플라스틱 (에서 단계 7.14) 구슬에 결 찰 버퍼 믹스의 8 µ L, 1 µ M 어댑터의 1 µ L을 추가 하 고 구슬 resuspend. 5 µ M 어댑터의 1 µ L를 사용 하 여 입력된 샘플에 대 한. 다중화 각 샘플에 대 한 다른 어댑터를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>DNA 리가의 1 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
	<li>못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (10 µ L)를 추가 하 고 resuspend 구슬, 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.</li>
	<li>25 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.</li>
	<li>못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (25 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.</li>
	<li>11 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>새로운 8 스트립 PCR 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 (자세한 자료 참조).</li>
	<li>384 잘 정량 PCR (정량) 접시에 실시간 PCR 마스터 믹스 8.5 µ L 플라스틱 하 고 어댑터의 1.5 µ L 출혈 (단계 7.26)에서 DNA를 추가 합니다.</li>
	<li>빈 우물에 각 형광 표준의 10 µ L 플라스틱</li>
	<li>다음 프로그램으로 실시간 PCR 수행: (45 98 ° C s) 1 주기, x (15 98 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s) 20 주기 x 그리고 (60 72 ° C s) 1 주기 x.</li>
	<li>PCR 주기 형광 표준 2의 형광 강도 도달 하는 데 필요한 수를 결정 합니다.</li>
	<li>PCR 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>(단계 7.26)에서 나머지 어댑터 출혈 DNA에 PCR 마스터 믹스의 11.5 µ L 플라스틱 고 같이 단계 7.30 PCR 주기 단계 7.31에서와 PCR을 수행 합니다.</li>
	<li>못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (20 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.</li>
	<li>20 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>새로운 1.5 mL-DNA 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>4.11 ( 그림 2E와 F에표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에 설명 된 대로 라이브러리의 품질을 확인 합니다. 라이브러리 DNA 샘플의 1 µ L을 사용 합니다. (선택 사항) 앞에서 설명한 2정량 여 농축 분석을 수행 합니다. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.</li>
</ol>8입니다. 시퀀싱
<ol><li>다음-세대 시퀀서에서 라이브러리 순서 (대표 데이터 그림3 참조). 참고: 시퀀스 깊이 데이터 분석에 대 한 충분 한 유기 체3의 게놈 크기에 따라 달라 집니다. 인간을 위한 마우스, 우리 적어도 20-40 백만 일자형 읽기를 얻는 것이 좋습니다. 읽기의 수익률에 따라 멀티플렉싱 비용 효과적인 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리의 프로토콜 플래그 태그 H2B 표현의 tamoxifen 주입에 의해 유도 된다 마우스 뇌의 뉴런에 대 한 최적화 되었다. 발기인 H2B 식, 시작 조직 자료의 양과 조직에 사용 되는 성공적인 tChIP-이 대 한 중추적인 매개 변수 따라서, 이러한 요소의 최적화 관심의 각 세포 유형에 대 한 고려 되어야 한다.
이 프로토콜에 사용 되는 절차 중 중요 한 단계는 100-500 bp5는 chromatin 길이를 전단 하는 DNA 이다. 일반적으로, ultrasonication 단계 표준화 이후 매우 다양 한 요인;에 따라 도전 고정 조건, 사용 하는 조직, 울트라-쥡니다, 사용 장비 및 장비 설정, 다른 사람의 사이에서. 따라서,이 DNA의 전단 단계의 재판 및 오류 최적화 개별 실험에 필요한 것입니다. 울트라-쥡니다, 대신 micrococcal nuclease 치료 순진한 칩 방법6사용 단일...

다양 한 세포 유형 동물의 조직에 의하여 이루어져 있다. 유전자 규칙 각 셀에 셀 형식을 정의합니다. Chromatin 수정 DNA 메 틸 화와 히스톤 수정-셀 형 특이성 유전자 발현의 기반이 됩니다. 따라서, 각 세포 유형에 있는 후 성적인 규정의 측정, 원하는 하지만 그것은 기술적인 도전 하고있다.
특정 셀 형식에 epigenetics 조사, 탠덤 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 최근 개발 된 (그림 1)1했다. TChIP에 피토 프 태그 코어 히스톤 단백질 H2B 셀 형식 관련 발기인에서 표현 된다. 소재는 다양 한 종류의 세포 혼합물에서 시작 하지만이 기능은 관심의 세포에서 chromatins의 절연이 있습니다. 다음 칩 Seq-히스톤 수정 마크와의 다음-세대 깊은 시퀀싱을 통해 chromatin 정화 절연 DNA-우리 게놈 넓은 방식 대상된 세포 유형의 후 성적인 상태를 모니터링할 수 있습니다.
이 기술을 사용 하 여, 우리 신경 관련 trimethylation 히스톤 H3 리 4 (H3K4me3)에서 단백질의 최근 조사 표. 그 연구에 우리 개발 노크에 마우스는 C-말기 플래그 태그 H2B에 단백질 Cre 중재 재결합 (Rosa26CAG floxed pA H2B-플래그)에 따라 표현 했다. CamK2a 발기인의 통제 Cre endoplasmic 그물 (응급실) 유전자를 보유 하는 마우스와 함께 횡단에 의해 얻은 마우스 선 tamoxifen 주입 (Camk2aH2B 플래그)1시 활성 뉴런에서 H2B 플래그를 유도 한다. 설립된 마우스 라인의 두뇌에서 시작, 우리는 안티-H3K4me3 항 체와 tChIP-Seq 수행. H3K4me3 마크는 종종 발기인 지구에 해당, 이후 우리 신경1에서 구체적으로 표현 하는 mRNAs의 수백을 발견 수 있습니다.
여기, 우리는 도서관 건설 (그림 1)를 조직 해 부에서 단계를 커버 하는 전형적인 tChIP-Seq 메서드를 설명 합니다. 이 프로토콜의 최종 목표는 tChIP-Seq의 성능 및 다른 세포 유형 및 히스톤 수정이이 방법의 미래 응용 프로그램에 대 한 우리의 모범 사례를 공유 하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>단백질 LoBind tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108132</td><td>세포 용해용</td></tr><tr><td>Protein LoBind tube, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108116</td><td>ChIP 및 라이브러리 준비용</td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108051</td><td>ChIP 및 라이브러리 준비용</td></tr><tr><td>8-strip PCR tube</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>ChIP 및 라이브러리 준비용</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>고정용 세포 분말을 만드는 편리한 극저온 분쇄</td></tr>기 <tr><td>금속 총알</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>SK Mill</td></tr><tr><td>2 mL 스테인리스 스틸 튜브</td>의 액세서리 <td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>셀 옵션 용해</td></tr><tr><td>2mL 스테인리스 스틸 튜브 홀더</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>세포 용해 옵션</td></tr><tr><td>16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>세포를 고정합니다. 사용하기 전에 1% 용액을 준비하십시오.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>2.5 M 재고</td></tr><tr><td>준비 D-PBS (-) (1x)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>세척 용해물 및 정제 DNA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>용해 버퍼 1. 1M, pH 7.5 스톡을 준비합니다.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, 분자 생물학 등급</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>용해 버퍼 1, 용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, 분자 생물학 등급</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>용해 완충액 1, 용해 완충액 2, ChIP 용출 완충액 및 Tris-EDTA-NaCl 완충액</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>용해 버퍼 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>용해 버퍼 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, 분자 생물학 등급</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>용해 버퍼 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>용해 버퍼 2, ChIP 용리 버퍼 및 Tris-EDTA-NaCl 버퍼. 1M, pH 8.0 스톡을 준비합니다.</td></tr><tr><td>0.1 M EGTA pH 중성</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>용해 버퍼 2</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>단백질</td></tr><tr><td>분해 차단 RIPA 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>세포 용해 및 세척 milliTUBE</td></tr><tr><td>1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>초음파 처리 튜브. 집속 초음파의 액세서리</td></tr><tr><td>집속 초음파기</td><td>Covaris</td><td>S220 또는 E220</td><td>DNA를 ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10 % SDS</td>에 적합한 크기로 소화하기 위해 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>ChIP 용리 완충액</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>용해물에서 DNA를 정제하기 위해</td></tr><tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td> 용해물 에탄올<td>에서 DNA를 정제하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>마우스</td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>에서 생성된 70% 용액 단클론 항 FLAG M2 항체</td> 만들기 <td>관심 세포에서 발현된 염색질을 정제하기 위해</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>이것은 anti-FLAG IP 및 anti-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>Anti-tri-methyl histone H3 (K4), 마우스 단클론 항체</td>에 사용할 수 있습니다<td>.</td><td>301-34811</td><td>ChIP 분석을 위해 작동하는 다른 항체는</td></tr><tr><td>10x 차단 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>친화성 정제 중 차단을 위해</td></tr><tr><td>Denhardt' s 용액</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>친화성 정제 중 차단용</td></tr><tr><td>글리코겐(5 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>용해물에서 DNA를 정제하기 위해</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>분리된 DNA의 정량화용</td></tr>, <tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>분리된 DNA의 정량화용</td></tr><tr><td>0.5 mL 튜브</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Qubit</td></tr><tr><td>페놀 / 클로로포름 / 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)</td>에 의한 정량화 용 <td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td> 용해물 AMPure XP 비드에서 <td>DNA를 정제하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>SPRI 마그네틱 비드 라이브러리 준비용</td></tr><tr><td>금속 얼음 선반</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>세포 용해물을 동결</td></tr> <tr><td>상태로 유지하기 위해Sample Cooler</td><td>New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>최소한의 손상으로 세포 고정을 돕습니다</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>분리된 DNA 단편의 품질을 확인합니다. 다른 프래그먼트 분석기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 Expert 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td> Bioanalyzer <td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td>과 함께 제공됩니다. 분리<td>된 DNA 단편의 품질을 확인하기 위해</td></tr><tr><td>KAPA LTP Library Preparation Kit</td><td>Roche</td><td>07961898001</td><td>10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase 및 PEG/NaCl 용액</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA 바코드</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>어댑터와 함께 제공라이브러리 준비용. DNA 바코드 어댑터 및 Primer Mix와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>KAPA 실시간 라이브러리 증폭 키트</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix 및 형광 표준과 함께 제공</td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>라이브러리 준비용. 또한 이 효소는 KAPA Real-Time Library Amplification Kit</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5 DNA</td></tr><tr><td>386-well qPCR 플레이트</td>의 용출을 위해 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Real-Time PCR을 위해</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td> DNA MicroAmp 광학 접착 필름<td>을 정량화하는</td></tr> 데 필요할 수 있습니다<tr><td>.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>For Real-Time</td></tr><tr><td>PCR MicroAmp 투명 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>플레이트 씰링용</td></tr><tr><td>End-repair 마스터 믹스</td><td></td><td></td><td>콤바인 1.4 &micro; 10x KAPA 엔드 리페어 버퍼의 L, 1 &micro; KAPA 끝 수선 효소 혼합물의 L, 및 1.6 &micro; L의 H2O</td></tr><tr><td>A-taling 마스터 믹스</td><td></td><td></td><td>결합 1 &micro; KAPA A-테일링 버퍼의 L, 0.6 &마이크로; KAPA A 테일링 효소의 L 및 8.4 &micro; H2O</td></tr><tr><td>결찰 완충액 혼합물</td><td></td><td></td>의 L <td>2 &micro 결합; KAPA 결찰 완충액의 L 및 6&micro; H2O</td></tr><tr><td>실시간 PCR 마스터 믹스</td><td></td><td></td>의 L <td>5 & 마이크로를 결합합니다. 2x KAPA HiFi HS 실시간 PCR 마스터 믹스의 L, 0.35 &마이크로; PCR 프라이머 믹스의 L (10 &마이크로; M의 정방향 프라이머 AATGATACGGCGACCACCGAG 및 리버스 프라이머 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), 및 3.15 &마이크로; H2O</td></tr><tr><td>PCR 마스터 믹스</td><td></td><td></td>의 L <td>10 &micro 결합; 2x KAPA HiFi Ready Mix의 L, 0.9 &micro; PCR 뇌관 혼합의 L, 및 0.6 &마이크로; L of H2O</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>염기서열분석 데이터를 시각화하기 위한 게놈 브라우저</td></tr><tr><td>DNA 올지오뉴클레오티드: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td>: GAPDH DNA 올지오뉴클레오티드<td>의 프로모터 영역을 증폭하는 프라이머</td></tr><tr><td>: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>: GAPDH</td></tr><tr>프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해<td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td>, <td>GADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해</td></tr><tr><td>, Thermal Cycler, Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td>, <td>GADPH 프로모터 영역에 해당하는 DNA를 정량화하기 위해</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: 셀 형식 관련 epigenome 프로 파일링

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

후 성적인 규정 유전자 발현에 있는 중앙 역할을 재생합니다. 히스톤 수정 1960 년대에서 발견 되었다, 이후 그 생리 및 병 적인 기능 광범위 하 게 공부 되었다. 실제로, 다음-세대 깊은 시퀀싱 및 특정 히스톤 수정 항 체를 통해 chromatin immunoprecipitation (칩)의 출현 게놈에 걸쳐 후 성적인 규칙의 우리의 보기를 혁명 하고있다. 반대로, 조직 일반적으로 다양 한 종류의 세포를 구성 하 고 그들의 복잡 한 혼합물 특정 세포 유형에 epigenome 조사 분석 도전 포즈. 게놈 넓은 방식 셀 유형 특정 chromatin 상태를 해결 하기 위해 우리는 최근 협동 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq), chromatin의 선택적 정화 셀에서 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 기반으로 개발 뒤에 칩이 관심의 종류 이 프로토콜의 목표는 tChIP이 모범 사례 소개 이 기술은 다양 한 히스톤 수정 및 모형 유기 체에서 조직 관련 epigenome 조사에 대 한 다양 한 도구를 제공합니다.

여기, 우리 조직 절 개, 고정, 세포 세포의 용 해, 탠덤 정화 chromatin, 및 DNA 도서관 준비 다음-세대 시퀀서에 대 한 설명. 절차, 중 하나는 여러 단계 (그림 2)에서 성공적인 시퀀싱 열쇠 DNA의 품질을 테스트할 수 있습니다. 때문에 단일 nucleosome 147 bp DNA 4로 일반적으로 둘러싸여, 전단된 DNA 크기 보다 짧은 수 없습니다. Ultrasonication, 직후 DNA는 고립 되었고 미세 전기 기계 (그림 2A)에서 실행. 크기 범위를 최적화 하기 위해 우리의 최선의 노력에도 불구 하 고 우리는 여전히 unsheared 유지 (약 2 kbp) DNA의 인구가 있었다. 이 단계에서 100-500 bp에서 배열 하는 DNA의 분수는 인구의 50% 이상 이어야 한다. 반대로 플래그 항 ...

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

이 방법은 게놈과 더불어 세포 모형 특정 방식으로 얼마나 많은 색채 수정이 통제되는지와 같은 후성 유전학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 표적 세포에서 크롬토닌을 분리한 다음 전형적인 집시 다운스트림을 따를 수 있다는 것입니다. 그래서이 방법은 뉴런 특정 트리밍실에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, lysinc 4, opisoncilly.그것은 또한 다른 히스톤 수정, 다른 세포 유형 및 기타 모델 유기체에 적용 될 수있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 마리 미토 (Mari Mito)가 될 것입니다. 시작하려면, 작은 조각으로 관심의 조직을 해부 미세 스프링 가위를 사용합니다.액체 질소로 채워진 깨끗한 용기에 조직 조각을 추가합니다. 그런 다음, 액체 질소로 채워진 2개의 밀리리터 관으로 조직 단편을 전송합니다. 액체 질소를 증발시키기 위해 캡을 열어 5 분 동안 영하 80도에서 튜브를 저장합니다.차가운 금속 얼음 랙에 조직 샘플을 포함하는 튜브를 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 금속 총알을 넣고 액체 질소로 식힙니다. 차가운 금속 총알을 샘플 튜브 중 하나에 놓습니다.캡을 닫고 튜브를 극저온 분쇄기의 튜브 홀더에 넣습니다. 즉시 조립된 튜브 홀더를 액체 질소에 1분간 담급드세요. 냉동 튜브 홀더를 극저온 분쇄기의 외부 카세트에 삽입합니다.그리고 30 초, 60 번 격렬하게 흔들어. 그 후 극저온 분쇄기를 분해하고 금속 탄환을 제거합니다. 그리고 튜브를 미리 차가운 샘플 쿨러에 넣습니다.쿨러를 음의 섭씨 20도에서 15분간 보관하십시오. 그런 다음 튜브와 파이펫에 1% 포름알데히드의 900 마이크로리터를 첨가하여 혼합합니다. 서스펜션을 1%포름알데히드의 900 마이크로리터가 있는 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기습니다.다음으로 서스펜션을 섭씨 23도에서 부드러운 회전으로 10분 간 수정합니다. 고정 반응을 중지하려면 튜브에 2.5 개의 어금니 글리신100 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 섭씨 4도에서 5 분 동안 3, 000 배 중력에서 원심 분리기.이 후, 슈퍼 상복부를 폐기. 튜브와 소용돌이에 PBS 1 밀리리터를 추가하여 혼합합니다. 섭씨 4도에서 5분간 3, 000배 의 중력원심분리기.이 워시 스텝을 두 번 더 반복하십시오. 다음으로, 혼합펠릿과 파이펫에 500 마이크로리터의 리시스 버퍼 하나를 추가합니다. 튜브를 섭씨 3, 000회에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다.혼합 펠릿과 소용돌이에 2 의 리시스 버퍼 2의 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오. 그 후, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 무선 면역 침전 분석 아세이 버퍼 800마이크로리터를 펠릿과 파이펫에 첨가하여 혼합한다.섭씨 4도에서 3, 000배의 중력에서 5분간 서스펜션을 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 다음으로, 프로테아제 억제제 칵테일을 곁들인 RIPA 버퍼 500마이크로리터를 펠릿에 넣습니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 3, 000 배 중력에서 5 분 동안 서스펜션을 원심 분리하고 상퍼를 폐기하십시오.프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 프로테아제 억제제 칵테일로 RIPA 버퍼를 추가한 직후, 용양을 초음파 튜브로 옮길 수 있습니다. 그리고 초음파 검사기에 튜브를 배치합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 설정을 사용하여 크로마틴을 전단합니다. 이어서, 샘플을 1.5 밀리리터 단백질 저결합 튜브로 이송한다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 20, 000 배 중력에서 5 분 동안 그것을 분리합니다.샘플에서 상체를 수집하고 새로운 단백질 낮은 결합 튜브로 전송합니다. 이 프로토콜에서, 탠덤 크로마틴 면역 침전 시퀀싱이 도입되고 입증되었다. 시술 도중, DNA의 질은 다중 단계에서 시험되었습니다.초음파 처리 직후, 전단 된 DNA는 미세 유체 전기 포세이스 기계로 분리되고 테스트되었습니다. 항플래그 항체 및 항H3K3me3 항체를 사용하여 친화 정화를 수행한 후 DNA 품질을 다시 확인하였다. H2B-FLAG에 DNA의 면역 정화의 특이성은 부정적인 대조군 샘플로 확인되었다.무시할 수 있는 양의 DNA가 검출된 곳. 프로토콜에 추가하여 시퀀싱 라이브러리의 품질이 확인되었습니다. 성공적인 ChIP 및 T-ChIP는 GAPDH 유전자의 프로모터 영역을 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 농축 분석을 통해 입증되었습니다.3개의 신경 유전자를 따라 대표적인 재분배가 얻어졌습니다. 그리고 전체 뇌T-ChIP 추구를 통해 추구하는 뉴런 T-ChIP에 의해 유전자의 다섯 가지 끝에서 읽기의 농축이 관찰되었다. 안정화 후, 이 기술은 후성 유전학 분야의 연구원들이 쥐의 뉴런에서 세포 유형 특정 히스톤 변형 일반을 탐구하는 길을 열어줍니다.포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 고무 의류와 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것은 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

tchip-seq-cell-type-specific-epigenome-profiling

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

생체 내 단백질-DNA 상호 작용 매핑 방법은 게놈 연구의 모든 측면에서 중요해지고 있지만 힘들고 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸립니다. 여기에서는 제한된 양의 세포와의 생체 내 단백질-DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 염색질 면역침전을 자동화하는 상업적으로 이용 가능한 로봇 액체 처리 시스템이 제시됩니다.

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 tChIP-Seq 방법을 통해 마우스 뉴런 세포에서 세포 유형 특이적 히스톤 변형을 분석하는 기법을 익히세요. 이 프로토콜은 에피게네틱 연구와 뉴런 생물학 이해에 중요한 도구를 제공합니다.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

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