Name: Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 생쥐 기관지폐포세척액에서 세포외소포를 초여과 원심분리법으로 분리하는 방법입니다. 이 기법은 전통적인 초고속원심분리법보다 높은 순도와 확장성을 제공하여 소량 샘플 연구에 효율적입니다.

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작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.

동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다.
1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비
<ol><li>BALF 컬렉션<ol>
<li>케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사</li>
		<li>기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 1 mL (mL)을 포함 하는 인슐린 주사기를 연결 하 고는 angiocatheter 통해 양쪽 폐로 DBPS의 1 mL를 주입.</li>
		<li>천천히 BALF 검색 하 여 50 mL 원뿔 튜브로는 BALF 분배 주사기 플런저를 철회 한다. 얼음에 BALF 유지.</li>
		<li>1.1.2, 1.1.3 단계를 반복 3 배 (4 배 총 각 마우스에). 참고: 약 0.8 mL 주입의 밀리 리터 당 일반적으로 검색 됩니다. 또한, 개별 마우스 (즉, 3 mL의 BALF), 다음 단계를 수행할 수 있습니다 하지만 여러 BALF 샘플 풀링 다운스트림 실험에 일관성에 대 한 EVs의 큰 배치의 절연을 허용할 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BALF 준비<ol>
<li>25 마우스에서 BALF 수영장 하 고 동등한 두 (약 수 당 ~ 35 mL)으로 나눕니다.</li>
		<li>세포와 다른 세포 파편을 제거 하는 상쾌한 수집에서 5 분, 4 ° C에 400 x g BALF 원심.</li>
		<li>세포 파편을 제거 하려면 10 분, 4 ° C에서 1500 x g에서 상쾌한 원심. 상쾌한을 수집 하 고 EV 격리 단계를 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 외 소포 Murine Bronchoalveolar 게 액체에서의 격리
참고:이 연구에서 두 개의 EV 격리 기술, 즉 UFC와 부 력과 ultracentrifugation 사용 BALF에서 EVs를 분리. 각 방법의 상세한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다.
<ol><li>
한 원심 (UFC) 농축 방법 참고:이 메서드는 앞에서 설명한 프로토콜10에서 수정 되었습니다.<ol>
<li>1.2.3 단계별로 0.2 μ m 무 균 주사기 필터에서 상쾌한 필터링 하 고 얼음에 필터링된 BALF 유지. 참고: 이것은 이다 크기 제외 단계 그것에 의하여만 200 보다 작은 소포 nm 수집 됩니다.</li>
		<li>폐기는 DPBS 10 분 4 ° C에서 10 분 원심 1500 x g에서 원심 단위에 대 한 살 균 DPBS와 100 kDa MWCO 원심 필터 단위를 equilibrate. 주의: 필터 장치에 막 DPBS와 equilibrated는, 일단 막 유지 해야 젖은 장치가 사용 될 때까지 모든 시간에.</li>
		<li>2.1.1 단계에서 BALF 샘플의 15 mL로 필터 단위를 작성 하 신 4 ° c.에 30 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 흐름을 통해 BALF는 삭제 또는 별도 정식 관으로 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>나머지 0.2 µ m 필터링 BALF에 대해 2.1.3 단계를 반복 합니다. 참고: 그것은 충분히 35 mL의 원래 시작 볼륨에서 BALF EVs를 집중 하는 centrifugations의 3 개의 반복 했다. 이 retentate의 1-1.5 mL 귀착되는.</li>
		<li>살 균 DPBS의 14 mL와 retentate는 부드럽게 pipetting 반복적으로 세척. 원심에서 30 분, 4 ° C에서 3000 x g 필터 단위는 DPBS 제거 하 고 EV retentate 집중.</li>
		<li>필터 장치 하단에는 pipettor를 삽입 하 고 철수 총 복구 되도록 사이드-투-사이드 연소 모션을 사용 하 여 샘플 필터 장치에서 집중된 BALF 파생 EVs를 수집 합니다.</li>
		<li>약 BALF 파생 EVs 수-80 ° C 더 입자 정량화 및 특성화 (3 단계 참조)에서 그들을 저장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
부 력 밀도 그라데이션 원심 (DGC)와 Ultracentrifugation (UC) 참고: 다음 프로토콜은 앞에서 설명한 프로토콜24에서 수정 되었습니다.<ol>
<li>37 mL ultracentrifuge 튜브에는 상쾌한 2.1.1 단계에서 전송 하 고 ultracentrifuge를 사용 하 여 4 ° C에서 30 분 동안 10000 x g에서 샘플 원심. 상쾌한 고 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. EV 펠 릿 centrifuged는 하는 동안 단계 2.2.3 부 력 밀도 그라데이션 버퍼 (표 1)의 다른 농도 준비 합니다.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 DPBS의 200 μ에 EV 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>50 %iodixanol 작업 솔루션 (표 1)의 300 μ와 EV 현 탁 액을 혼합 하 고 15 mL ultracentrifuge 관에 그것을 전송. 50% iodixanol EV 혼합물 정지 위에 순차적으로 가기 하단에서 순서로 다음 버퍼 솔루션 레이어: 30 %iodixanol (4.5 mL), iodixanol (3 mL), 15 %iodixanol (2.5 mL), 및 5 %iodixanol (6 mL)의 25%. 230 분 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기. 참고: 부 력 밀도 그라데이션 iodixanol 하단 상단에 최저 농도 (5%)에 가장 높은 농도 (50%)와 확장의 비율에 근거한 다. Iodixanol의 다양 한 농도 생성 하려면 균질 매체 (표 1) 다양 한 양의 작업 솔루션 (50 %iodixanol)와 혼합 했다.</li>
		<li>15%와 25% 분수를 수집 하 고 볼륨을 15 mL를 무 균 DPBS에 그들을 희석. 새로운 작은 ultracentrifuge 튜브와 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기에 그들을 전송.</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 추가 특성에 대 한 살 균 DPBS의 50 μ에 EV 펠 릿 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 세포 외 기 정량화
참고: BALF 파생 EVs 복구 수익률 두 통계 quantitated입니다.
<ol><li>나노 측정 분석 (NTA)를 추적<ol>
<li>1: 200에서 EV 샘플 희석-DPBS 및 부하는 인슐린 주사기에 샘플의 1 mL에 1: 500. 주사기 펌프 샘플 주사기를 연결 하 고 ( 재료의 표참조) 입자 숫자와 크기를 측정 하기 시작.</li>
		<li>모든 샘플 측정 1 카메라 수준 14와 검출 임계값에 설정 합니다. 1500 프레임 30에 5 반복 측정의 20의 지연 각 샘플에 대 한 기록 된 읽기 사이 s. 결합 하 고 최종 농도 및 크기 보고서에 대 한 데이터를 평균. 참고: 모든 입자의 정확한 캡처에 대 한 모든 입자를 시각화 하 고 비슷한 설정을 사용 하 여 각 실험에서 모든 샘플 측정에 적합 한 카메라 수준을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 정량화 참고: bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 BALF 파생 EVs의 단백질 농도 측정 하기 위해 사용 되었다.<ol>
<li>1 x 세포의 용 해 버퍼에서 EV 샘플 solubilize</li>
		<li>BCA 표준 프로토콜 색도계 탐지 560에서 흡 광도 측정 하 여 당 BALF 파생 EVs에 있는 단백질의 양을 계량 접시 리더에 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포 외 소포 BALF 파생의 탐지
참고: 일반적으로 알려진된 exosome 표면 마커 단백질 (TSG101, CD63, CD81, 및 CD9) EV 복구 확인 하 SDS 페이지 및 immunoblotting 흐름 cytometry 분석에 의해 사용 되었다.
<ol><li>SDS 페이지 및 immunoblotting<ol>
<li>버퍼 (리튬 라우릴 황산 염) 및 1.6 mL 튜브에서 50 m m dithiothreitol (DTT) 로드 blotting으로 각 샘플의 EV 단백질의 동일한 금액을 디졸브. 10 분 동안 70 ° C에서 샘플을 열.</li>
		<li>4-12% 두번째-트리 스 플러스 아크릴 아 미드 젤으로 4.1.1 단계에서 샘플을 로드 하 고 실행할 전기 이동 법 (150 볼트, 35 mA) 35 분.</li>
		<li>건조 전송 방법을 사용 하 여 니트로 막 단백질을 전송 합니다.</li>
		<li>60 분, 실 온 (RT)에서 락 5% 무 지방 우유와 함께 막을 차단 합니다.</li>
		<li>5 %BSA Tris 버퍼 염 분 트윈 20 (TBST) 하룻밤 락 4 ° c에서 1: 500 희석에는 EV 표면 단백질 마커, 종양 민감성 유전자 101 (TSG101)에 항 체를 막 품 어.</li>
		<li>다음 날, 씻고 막 3 x, 10 분 각 TBST 버퍼에서 세척 하 고 안티-토끼 IgG, HRP 연결 된 항 체, 실시간에서 60 분에 대 한 1:5,000 희석에와 그것을 품 어</li>
		<li>3 막 씻고 x, 각 세척, TBST 버퍼에서 10 분. Chemiluminescent HRP 항 체 탐지 시 약 및 이미지 (이미징 시스템에 대 한 재료의 표 참조)와 막 개발.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytometry<ol>
<li>PEB 버퍼 (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %BSA, 0.1 μ m 주사기 필터 멤브레인 통해 필터링) 얼룩의 49 μ BALF 파생 EVs를 희석.</li>
		<li>각 개별 샘플으로 다음 항 체의 각 추가: 1) 쥐 반대로 마우스 PE CD63 항 체 (100 반응 당 ng); 2) 쥐 반대로 마우스 PE CD81 (500 ng); 3) 쥐 반대로 마우스 FITC CD9 (200 ng). 어둠 속에서 60 분 락 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>멤브레인 필터 PEB 버퍼 얼룩의 450 μ와 샘플을 희석 하 고 교류 cytometry 분석 하는 샘플 제목 ( 재료의 표참조)25.</li>
		<li>다음과 같이 교류 cytometer 설정을 조정: 1) 하이퍼 로그 (hlog);에 모든 채널 설정 2) 4;에 SSC에 트리거 설정 3) 보조 트리거 해제 합니다. 낮은 속도 설정에서 샘플을 실행 하 고 각 샘플에 적어도 10000 이벤트를 확보.</li>
		<li>분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플에 낮은 cytometry 데이터 분석 수행 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30. 미래 개발 및 발전이 분야에서 깊이 의존 신뢰할 수 있는 그리고 효율적인 방법 뿐만 아니라 식별 하 고 별도 EV 인구의 하위 집합을 수정 하지만 또한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들의 생...

Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 , 12, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근11,12,13,,1415에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.
Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐23에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.
현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 Ultracel-100K</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International, Prospect, IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore, St. Louis, MO</td><td>MKCD9753</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>케타민</td><td>VetOne, Boise, ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1mL</td><td>BD 주사기, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter 20 G</td><td>BD 주사기, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 50 mL</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonic acid (BCA) protein assay</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse TSG101 항체</td><td>AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>쥐 anti-mouse PE-CD63 항체</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG, HRP 결합 항체</td><td>세포 신호 기술, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 환원제(볼트)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 용해 버퍼(볼트)</td><td>세포 신호 기술, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 아크릴아미드 겔</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 니트로셀룰로오스 미니 스택</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 HRP 항체 검출 시약 HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 17 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 38.5 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>코닝 SFCA 주사기 필터 0.2 &마이크로; m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg,</td><td></td> Germany-Ultracentrifuge <td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter, Pasadena,</td> <td>CA-Nanosight</td><td></td></tr> <tr><td>(NS300)</td><td>Malvern, Worcestershire, UK-</td><td></td><td>입자 크기 분포를 측정하고 입자 농도</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 유세포 분석기</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,</td> <td>Germany-iBlot</td><td></td></tr> <tr><td>Transfer Apparatus</td><td></td> <td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad</td><td></td></tr> <tr><td>ChemiDoc MP 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.

마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속.
정상적인 쥐 UFC 메서드에서 고립에서 EVs BALF 파생 표시 작은 크기와 UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM, 그림 1B)에 비해 더 균일 한 크기 분포 (148.8 ± 1.1 nM, 그림 1A). UFC 기술 심오한 했다 65-...

여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

이 방법은 초여유 원심분리 접근법을 사용하여 세포외 소포 유래 기관지포 용암체의 효율성, 회수 수율 및 순도와 관련된 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 직접 초원심분리 및 밀도 그라데이션 정화 기술에이 기술을 비교했다. 이 기술의 주요 장점은 머린 기관지 알포라 라베액과 같은 소량 샘플에 간단하고 효율적이며 적합하다는 것입니다.더 중요한 것은 초원심분리 방법에 비해 높은 순도와 확장성을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 동료 인 노먼 개렛 III (Norman Garrett III)가 될 것입니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 기관에 22 게이지 협경화를 삽입하십시오.인슐린 주사기를 얼음 냉멸 균 DPBS 1 밀리리터로 부착하고 두 폐에 1 밀리리터를 주입합니다. 기관지알포라 라베액 또는 BAL 유체를 회수하기 위해 주사기 플런저를 천천히 철회합니다. 그리고 BAL 유체를 얼음의 원물 튜브에 분배합니다.그 후, 25마리의 마우스에서 BAL 액을 끌어내어 두 개의 동일한 세트로 나눕니다. 발 유체를 섭씨 4도에서 5분간 400배 G로 원심분리합니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 15, 000 배 G에서 상체및 원심 분리기를 수집합니다.그런 다음 상체를 수집하고 즉시 EV 격리 단계로 진행합니다. 먼저 0.2 마이크로미터 멸균 주사기 필터를 통해 슈퍼 나탄을 필터링합니다. 그 후, 10 분 동안 멸균 DPBS와 원심 필터 장치를 평형.그런 다음 원심 유닛을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 000배 G에서 원심 장치를 원심분리합니다. 15 밀리리터의 BAL 유체로 필터를 채웁니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 3, 000 G의 3, 000 G에서 분리됩니다.그 후, 반복적으로 부드럽게 파이펫을 하여 멸균 DPBS의 14 밀리리터로 보용을 씻으십시오. 3, 000 G의 필터 유닛을 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리하여 DPBS를 제거하고 보기를 농축합니다. 농축 BAL 유체 유래 EV를 수집하려면, 필터 장치의 바닥에 피프터를 삽입하고, 측면 스위핑 모션을 사용하여 샘플을 철회한다.그런 다음 BAL 유체파생 EV를 알리쿼트와 섭씨 영하 80도에 저장합니다. 또는, 초원심분리기 튜브에 이전 이전하여 시작합니다. 그리고 원심 분리는 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000 G의.그런 다음 상체와 원심 분리기를 수집합니다. 상체를 폐기하고 DPBS의 200 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 그 후 EV 서스펜션을 50%의 iodixanol 작동 솔루션300 마이크로리터와 혼합합니다.그리고 15 밀리리터 초원심분리기 튜브로 옮김합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼 솔루션을 추가하여 부력 밀도 그라데이션을 만들고 원심분리기를 100, 000 G에서 3시간 50분 동안 만듭니다. 15%와 25%의 iodixanol 분획을 수집하고 DPBS에서 희석하여 최대 15밀리리터의 부피를 가져옵니다.분획을 새로운 초원심분리기 튜브와 원심분리기100, 000 G의 섭씨 4도에서 60분간 전송합니다. 상체를 버리고 멸균 DPBS의 50 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단하십시오. 나노 입자 추적 분석을 시작하려면 EV 샘플을 DPBS의 1 밀리리터로 희석하십시오.그리고 인슐린 주사기에 샘플을로드합니다. 그 후 주사기 펌프에 주사기를 부착하고 파티클 수와 크기를 측정합니다. 카메라 레벨을 14로 설정하고 감지 임계값을 하나로 설정합니다.다음으로, 플레이트 판독기를 사용하여 색탐지를 통해 EV 샘플의 단백질 양을 정량화한다. 블로팅 로딩 버퍼 및 DTT를 사용하여 각 샘플에서 동일한 양의 EV 단백질을 용해합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 가열합니다.샘플을 비스 트리스 플러스 아크릴아미드 젤에 적재하고 전기 전도를 35분 동안 실행합니다. 그런 다음 건조 전달 방법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다. 그 후, 부드러운 흔들림으로 60 분 동안 5 % 탈지 우유로 멤브레인을 차단하십시오.밤새 부드러운 흔들림과 함께 섭씨 4도에서 EV 표면 단백질 마커에 항체로 멤브레인을 배양하십시오. 실온에서 60분 동안 HRP 링크 항체로 멤브레인을 배양하여 멤브레인을 개발한다. TBST 버퍼로 멤브레인을 3번 세척합니다.마지막으로, 화상 진찰을 진행하기 전에 화학 발광 HRP 항체 검출 시약으로 막을 개발하십시오. 유동 세포측정을 시작하려면 BAL 유체 파생 EV를 PEB 염색 버퍼 49마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음 각 샘플에 3개의 항체를 추가하고, 어둠 속에서 60분 동안 흔들면서 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다.마지막으로, 40 마이크로리터의 멤브레인 여과 PEB 염색 버퍼로 샘플을 희석시키고 유동 세포 측정 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서 EV는 UFC 및 UC-DGC 방법을 사용하여 마우스 BAL 유체로부터 분리되었습니다. BAL 유체 파생 EV는 UFC 방법에 의해 분리된 일반 마우스로부터 UC-DGC-EV보다 더 작은 크기와 균일한 크기 분포를 나타냈다.UFC 기술은 또한 UC-DGC 기술에 비해 훨씬 더 높은 총 입자 수를 가지고 있었다. UFC-EV의 밀리그램으로 측정된 총 단백질 회수도 UC-DGC-EV의 단백질 회복보다 높았으며, 이는 UFC 기술이 더 많은 시간과 노력 효율적이라는 것을 나타냅니다. 마지막으로, BAL 유체 유래 EV는 또한 유동 세포측정을 통해 더욱 특징지어졌다.UFC-EV와 UC-DGC-EV는 모두 CD63, CD9, CD81을 표현했다. 이 절차를 시도하는 동안 DPBS로 초여과 장치 멤브레인을 수화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 멤브레인이 수화되면 장치가 사용될 때까지 항상 젖어 있어야 합니다.필터 장치에서 세포 외 소포 를 회수하는 것은 어려울 수 있습니다. 파이펫 팁이 필터 장치에서 EV의 대부분을 복구하기 위해 좌우로 스윕되어 있는지 확인합니다. 개발 후, 이 기술은 작은 동물의 정상 또는 병리학 적 조건에서 세포외 소포 유래 기관지 정맥포 라베이지의 생물학적 기능을 탐구하기 위해 세포 외 소포 격리 분야의 연구자들에게 길을 열었습니다.

isolation-extracellular-vesicles-from-murine-bronchoalveolar-lavage

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

이것은 간에서 조직 세포 외 소포 (EV)를 격리하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 콜라게나아제 관류와 관련된 2단계 과정을 설명하고 간 조직 EV를 분리하기 위한 차동 초원심분리를 설명합니다.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.

인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법

이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

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이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

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이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 생쥐 기관지폐포세척액에서 세포외소포를 초여과 원심분리법으로 분리하는 방법입니다. 이 기법은 전통적인 초고속원심분리법보다 높은 순도와 확장성을 제공하여 소량 샘플 연구에 효율적입니다.

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

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