Name: 쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 쥐 두개골에서 CCL5에 의해 유도된 골격 줄기 세포 이동을 실시간으로 추적하는 방법을. 이 기술은 조직 재생 연구에서 개별 세포의 행동을 관찰하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 텍사스 상뼈 질환 프로그램, 캐롤라인 비스 법률 기금 상, 그리고 수상 번호 R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946에 수여 번호로 국립 보건 원의 NIAMS에 의해 지원되었다.  BCM 광학 이미징 및 바이탈 현미경 코어와 BCM 첨단 기술 코어 의 M.E. 디킨슨과 T.J. Vadakkan에 NIH(AI036211, CA125123 및 DK056338)의 자금 지원을 제공합니다.
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모든 마우스는 병원체가 없는 조건에서 유지되었고, 모든 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 준비
<ol><li>크로스 Mx1-Cre17 및 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (톰)18 마우스 (잭슨 연구소에서 구입) αSMA-GFP 마우스 (박사에 의해 여기에 제공) 이보 칼라지치와 헨리 크로넨버그)는 Mx1-Cre+Rosa26-tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스(그림 2A)를 생성한다.</li>
	<li>Mx1-Cre 유도의 경우, 10 일 동안 격일로 25 mg / kg pIpC로 마우스를 주입하십시오.</li>
	<li>야생형 C57BL/6 마우스(WT-BMT)19에서 1 x 106개의 전체 골수 단핵 세포의 정맥 이식 전 9.5 Gy 1일 마우스를 조사한다.</li>
	<li>6-8주 간의 회복 후, 아래에 설명된 페리오스텔스 세포 이동 프로토콜의 생체 내 이미징에 대상 마우스를 입력하였다. 참고: Mx1-Cre 마우스의 조사 및 WT-BMT는 상해에 반응할 수 있는 내인성 Mx1 표지된 조혈 세포를 제거하기 위하여 필요합니다. 6~8주 후 조사 후, 호스트의 조혈 세포 수는 <5%에 이르므로 이미징19에 대한 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>2. 마우스 구속 및 이미징 마운트
<ol><li>50mL 원문 튜브로 마우스 구속을 만듭니다(그림 1A).<ol>
<li>뾰족한 가위를 사용하여 원물 바닥을 뚫고 구멍을 뚫습니다. 아래 구멍에서 원식 의 상단으로 잘라냅니다 (절단 면은 구속의 상단이 될 것입니다).</li>
		<li>이전 컷과 평행하게 약 4~5cm 길이의 컷을 만들고 구속의 상단에서 중간(~2cm)을 줄입니다. 원식의 이 섹션을 제거하고 가장자리가 필요했던 매끄러운.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조정 가능한 각도 플레이트, 0.5" 광학 포스트 및 0.5" 게시물에 대한 직각 클램프, 0.1875" 헥스(그림 1B 및 재료 표)를 사용하여 원적 튜브 이미징 마운트를 구성합니다.<ol>
<li>각도 플레이트를 35° 각도로 조정합니다. 각도 플레이트의 왼쪽에, 플레이트의 뒷면에서 두 번째 구멍에 광학 포스트를 나사.</li>
		<li>조정 가능한 플레이트의 오른쪽에스프링로드 0.1875" 육석 잠금 0.25" 엄지손가락나사를 플레이트의 앞면과 마지막 구멍에서 두 번째 구멍에 삽입합니다. 직각 클램프는 광학 포스트와 함께 사용되어 원물 마우스 구속을 제자리에 고정시합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 수술 전 수술
<ol><li>마우스 마취<ol>
<li>통증 관리를 위해 수술 전 30-60분 동안 지속적인 방출 부프레노르핀(1 mg/kg BW)으로 마우스를 피하한다.</li>
		<li>설치류 III CCM 조합(콤보 III)을 사용하여 마취생쥐를 마취하여 37.5 mg/mL 케타민, 1.9 mg/mL 자일라진, 및 0.37 mg/mL 아세프로마진을 함유하고 있다. 마우스에 대 한 적절 한 복용량은 0.75-1.50 체중의 1 kg 당 mL. 복용량 지속 됩니다 30-45 분.</li>
		<li>마우스가 마취되면 안과 연고를 멸균 면봉으로 눈에 바르면 눈탈수림을 방지하십시오.</li>
		<li>장기 이미징(>45분)의 경우 마취를 다시 투여하여 다음과 같이 적절한 마취 깊이를 유지하십시오.<ol>
<li>계획된 이미징 지속 시간(추가 체디션 의 30분 당 0.75 mL/kg BW)에 대한 마취를 유지하기에 충분한 양의 콤보 III로 1mL 주사기를 준비한다. 25 G 나비 바늘 주입 세트를 12인치 튜브로 주사기에 부착하고 튜브와 바늘을 통해 마취제를 밀어 넣습니다.</li>
			<li>나비 바늘을 인과간으로 삽입한 다음 바늘을 제자리에 테이프로 놓습니다. 참고: 이것은 추가 콤보 III가 동물을 움직이거나 보기의 평면을 방해할 필요가 없다는 것을 화상 진찰 도중 관리되는 방법입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시술 내내 37°C에 보관된 가열 패드로 열 지원을 제공합니다. 장기간 이미징(>1hr)의 경우 추가적인 유체 지원이 필요합니다.  보조 유체는 이미징 중 추가 콤보 III 또는 33 mL/kg 식염수(0.9 NaCl) 피하시 I.P.를 제공할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 구속 및 수술 부위의 준비<ol>
<li>클리퍼를 사용하여 머리 꼭대기에서 가능한 한 많은 머리카락을 제거합니다. 면도 부위에 탈모 크림을 바르면 수술 부위에 남은 모발을 제거하십시오.</li>
		<li>발가락 핀치에 대한 응답이 부족하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 15 분 후, 마우스가 완전히 마취되지 않은 경우, 콤보 III (<0.75 mL / kg BW)의 두 번째 작은 복용량을 투여한다.</li>
		<li>마우스를 구속 꼬리에 먼저 놓고, 코가 원물 의 가장자리에 약간 걸려 있도록 충분히 뒤로 슬라이딩합니다.</li>
		<li>의료 용 테이프를 사용하여 원적 튜브의 바닥에 앞발을 테이프로 테이프.</li>
		<li>35° 각도로 설정된 이미징 마운트에 마우스로 원식 튜브를 배치하고 직각 클램프(그림 1C)를 사용하여 고정합니다.</li>
		<li>마우스가 이미징 마운트에서 안전해지면 베타딘 스크럽과 70%의 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 3배 청소하십시오. 다시 말하지만, 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>마우스를 깨끗한 흡수 패드로 옮기고 커다란 멸균 장을 만들기 위해 마우스 위에 커튼을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 외과 적 절차
<ol><li>개구부 절개<ol>
<li>미세 한 팁 포셉을 사용하여, 피부를 즉시 오른쪽 귀에 내간을 선택합니다. 미세 절 가위를 사용하면 집게가 들고있는 피부를 잘라냅니다. 참고: 위에서 설명한 방법을 사용하여 절개를 시공하면 절차 후 봉합에 더 적합한 둥근 절개가 생성됩니다.</li>
		<li>왼쪽 귀(<1cm)를 향한 초기 절개에서 시작하여 횡방향 절개를 합니다.  초기 절개에서 시작하여 동물의 코로 다시 절개를 하십시오 (오른쪽 눈을 지나 ~ 2-3 mm).</li>
		<li>포셉과 가위를 사용하여 피부와 분리하여 피부와 갈바리아 골막수로부터 피부를 분리하는 결합 조직을 부드럽게 잘라냅니다.</li>
		<li>멸균 면봉을 사용하여 피부 플랩 상단에 안과 연고를 바르습니다.  부드럽게 피부 플랩을 집어 왼쪽 눈 위에 접습니다. 궁수와 관상 봉합사의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다(그림 1E). 참고: 안과 연고는 피부 플랩을 제자리에 유지하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>모든 혈액과 잔류 모발의 영역을 청소하기 위해 멸균 PBS로 열린 표면을 플러시하십시오. 참고 : 필요한 경우 미세 한 양면을 사용하여 홍조 후 남아있는 머리카락을 제거하지만 음막 이 손상되지 않도록주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 골절<ol>
<li>calvaria에 미세 골절을 생성하려면 29 G 인슐린 주사기의 플런저를 제거하고 주사기의 백 엔드를 300-400 uL 마크 주위로 자른다. 참고: 이 단계를 사용하면 부상을 생성할 때 해부 범위 하에서 기동하기가 더 쉬워집니다.</li>
		<li>관상 봉합사로부터 코쪽으로 베벨(1~2개의 바늘 폭)의 끝을 놓고, 1~2개의 바늘 폭을 궁합봉의 오른쪽에 놓는다(도 1E).</li>
		<li>주사기를 시계 방향으로 부드럽게 회전한 다음 시계 반대 방향으로 여러 번 회전합니다. 참고: 젊은 쥐에서는 원형 미세 골절을 만들기 위해 매우 적은 양의 하방 압력이 필요합니다. 이 출혈을 일으키는 원인이 되고 화상 진찰을 방해할 것이기 때문에, 바늘이 두뇌를 관통하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>27 G 바늘을 사용하여 미세 골절을 ~0.4 mm로 넓습니다. 뼈 조각이 미세 골절에 남아 있으면 PBS로 영역을 플러시하십시오. 뼈 조각이 여전히 미세 골절에 남아 있는 경우 29 G 바늘을 사용하여 부드럽게 스쿱하십시오.</li>
		<li>4.2.1-4.2.4단계를 반복하여 좌측에 부상을 입습니다. 참고: 이 시점에서, 두 가지 옵션이 있습니다: 1) 즉시 CCL5 치료로 진행 (섹션 4.3) 및 이미징 (섹션 5); 또는 2) 6절 수술 후 수술 후 수술 부위를 닫습니다. 24 시간 후에 마우스를 다시 마취하고 수술 시력을 다시 열고 CCL5 (섹션 4.3)로 부상을 치료하고 인포탈 이미징 (섹션 5) 및 수술 후 치료 (섹션 6)를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 치료<ol>
<li>RANTES (100 ng /mL)의 주식에서 지하 멤브레인 매트릭스 (재료의 표)를 사용하여 10 ng / mL의 용액을 만듭니다. 이 용액을 얼음위에 두어 매트릭스를 액체 형태로 유지합니다.</li>
		<li>2-20 μL 파이펫을 사용하여 CCL5(10 ng/μL)의 2μL(10 ng/μL)으로 각 부상을 치료합니다(이 파이펫 팁은 점성 액체를 사용할 때 더 효과적입니다). 행렬을 굳게 할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>매트릭스가 고화되면, 부드럽게 조직이 탈수되지 않도록 피부 플랩으로 calvaria를 커버. 이미징 전에 1시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인트라바이탈 이미징
<ol><li>현미경 설정<ol>
<li>멀티 광자 레이저 (펨토초 티타늄 사파이어 레이저)를 켭니다. 파장을 880nm로 설정하고 뼈의 제2 고조파 생성(SHG) 이미징(440nm)의 힘을 조절한다.</li>
		<li>GFP-및 tdTomato 표현 세포의 흥분을 위해 488 nm 및 561 nm 고체 상태 레이저를 각각 켭니다.</li>
		<li>두 번째 고조파 생성(405-455 nm 검출) 및 GFP(505-550 nm 검출) 신호를 위해 PMT(광증튜브) 검출기를 켭니다. 토마토 (590-620 nm 검출) 신호에 대한 HyD 3 검출기를 켭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장착<ol>
<li>마우스를 스코프로 이동하기 전에 마우스 머리 뒤쪽을 부드럽게 눌러 칼바리아의 시각적 평면을 확인합니다. 평면이 평평하지 않은 경우 마우스 구속을 왼쪽 또는 오른쪽으로 부드럽게 회전하여 위치를 조정합니다. 참고: 충분한 이미지 품질을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.</li>
		<li>멸균 2% 메틸셀룰로오스를 물(w/v)에 바르면 칼바리아와 피부 플랩 전체를 덮고 조직의 건조를 방지합니다.</li>
		<li>XYZ 축 전동 현미경 단계(그림 1G)에 마우스를 놓습니다. 상피광을 이용하여, 마우스를 정렬하여 1) 현미경에 직면하고 2) 관상 및 처탈 봉합사의 교차점이 단계의 중심 기준점이다.</li>
		<li>이미징 영역에 유리 커버를 놓고 정렬을 다시 확인합니다(그림 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>시간 경과 이미징<ol>
<li>낮은 배율 렌즈(NA = 0.95로 25배 물 침수 목표)를 사용하여 calvaria를 스캔합니다. 궁수 및 관상 봉합사 교차의 참조 이미지를 획득합니다.</li>
		<li>세포에서 SHG 및 형광 신호를 사용하여 각 부상 시력을 찾아 XYZ 좌표뿐만 아니라 처상 및 관상 봉합사로부터의 거리(도 2B)를 기록합니다.</li>
		<li>장기간 이미징을 위해 관상 또는 좌활봉에 위치를 선택합니다. 이미징 중에 참조에서 이 영역의 자세한 Z 스택 이미지를 촬영합니다. 참고: 봉합사는 알려진 P-SSC 틈새 시장을 나타내기 때문에 칼바리아 손상에 대한 응답으로 세포가 마이그레이션되는 곳입니다.</li>
		<li>시간 경과 소프트웨어 설정을 사용하여 최소 1시간 동안 1분마다 이미지를 기록합니다. 스냅숏 사이의 시간에 현재 시야 필드를 초기 시야 필드와 비교합니다. 서로 다른 경우 Z 스택 이미지를 사용하여 뷰 필드를 조정해야 하는 방향을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수술 후 동물 관리
<ol><li>이미징 후, 노출된 칼바리아를 멸균 PBS로 헹구어 메틸셀룰로오스를 제거합니다.</li>
	<li>절개를 닫기 위해 피부 플랩을 칼바리아 위에 부드럽게 놓습니다. 멸균 면봉을 사용하여 잔류 안연고를 제거하고 절개 부위를 건조시다.</li>
	<li>모노필라멘트 나일론 5-0 사이즈 비흡수성 봉합사를 C-1 역절단 바늘로 사용하여 수술 부위를 닫습니다. 멸균 면봉을 사용하여 밀폐 절개에 트리플 항생제 연고를 적용하십시오. 참고 : 흉터는 고품질의 봉합 기술과 최소 출혈로 감소됩니다.</li>
	<li>따뜻한 표면에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓고 흉골 재정이 달성 될 때까지 매 15 분마다 확인하십시오.</li>
	<li>지속적인 방출 buprenorphine의 두 번째 복용량을 관리 72 수술 후 h.</li>
	<li>봉합사(~1주)가 제거될 때까지 매일 허들 동작, 주름이 있는 모피 및/또는 어약이 부족한 경우 모니터링합니다.</li>
</ol>

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</ol>

L.C.O. 및 D.P.는 "뼈 수리에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포"라는 제목의 출원 중인 특허를 공개합니다(BAYM. P0264US. P1). 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

뼈 치유 하는 동안, periosteal 세포는 새로 분화 된 연골 세포와 부상 callus3 내에서 골세포의 주요 소스입니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다. 내인성 P-SSC 기능적 특성을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 일입니다. 종종 SSC의 철새 역학은 시험관 내에서 평가되므로 생체 시스템의 해당 해석이 어려워지는 경우가 많습니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스 (Mx1/토마토/αSMA-GFP)의 생성에 최근 발전으로 인해 개별 세포의 생체 내 추적이 가능해졌습니다. 따라서, 이 방법은 실시간으로 CCL5 유도 된 P-SSC 마이그레이션의 생체 내 기록을 허용한다.
이미징 일관성에 영향을 미칠 수 있는 ...

골절 수리는 배아 골격 발달 및 리모델링과 구별되는 동적 다세포 과정입니다. 이 과정에서 손상된 조직으로부터의 부상 신호 유도는 골격 줄기/전구 세포의 신속한 모집, 증식 및 후속 분화로 이어지며, 이는 골절의 전반적인 안정성 과 고정에 모두 중요합니다1. 특히, 골절 치유의 초기 단계는 주로 periosteal 상주 세포2에 기인하는 부드러운 callus 형성을 필요로한다2. 뼈가 다치면, periosteal 세포의 부분 집합은 급속하게 반응하고 periosteum 내의 명백한 골격 줄기/선조 세포 집단의 존재를 연루하는 callus3 내의 새로 분화한 연골 중간체 및 골에 기여합니다. 따라서, periosteum-거주자 골격 줄기 세포(SSC)의 식별 및 기능적 특성화는 퇴행성 뼈 질환 및 뼈 결함에 대한 유망한 치료 접근법을 구성한다4.
SSC는 골수를 포함하여 다중 조직 위치에 상주하는 것으로 생각됩니다. 골수와 유사하게, 골성/연골성 SSC도 골수4,5,6에서 확인되었다.  이러한 periosteal SSC (P-SSC)는 태아 뼈 발달 동안 초기 중간 엽 계보 마커 (즉, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 및 Axin2-CreER8)로 표시 될 수 있습니다4,7,8,9,10. 이러한 단일 유전 계보 추적 모델의 중요한 한계는 표지된 세포 집단 내의 상당한 이질성이 있다는 것입니다. 또한 라벨이 부착된 SSC를 생체 내에서자손과 구별할 수 없습니다. 이러한 제한을 해결하기 위해 최근 이중 리포터 마우스(Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+)를 개발하여 골수 SSC(BM-SSC)11에서 P-SSC를 뚜렷하게 시각화했습니다. 이 모델을 사용하면 P-SSC가 Mx1+αSMA+ 듀얼 라벨링으로 표시되는 반면, 보다 분화된 Mx1+ 세포는 골수, 내피 스텔스 및 페리오스핑 표면, 피질 및 궤적 골격11,12에 상주하는 반면, 더 분화된 Mx1+ 세포로 표시됩니다.
여러 사이토카인과 성장 인자는 뼈 리모델링 및 수리를 조절하는 것으로 알려져 있으며 중요한 세그먼트 결함1,13에서 골격 수리의 향상을 위해 테스트되었습니다. 그러나, 뼈 구획의 물리적 장벽의 중단을 통해 생성 된 부상 모델의 세포 복잡성으로 인해, 내인성 P-SSC 마이그레이션 및 치유 중 활성화에 이러한 분자의 직접적인 영향은 불분명하다. SSC의 기능적 특성 및 철새 역학은 종종 다른 세포 집단에서 이주를 유도하는 것으로 알려진 사이토카인 또는 성장 인자와 함께 트랜스웰 또는 스크래치 분석을 수행함으로써 시험관 내에서 평가됩니다. 따라서, 생체 내 시스템에서 해당 되는 생체 내 시스템에서 적용을 위한 이러한 체외 실험의 결과 해석은 도전적이다. 현재, 골격 줄기/전구 세포 이동의 생체 내 평가는 전형적으로 실시간으로 관찰되지 않는다; 오히려, 그것은 골절 후 고정 된 시점에서 측정5,7,14,15,16.
이 방법의 제한은 마이그레이션이 단일 셀 수준에서 평가되지 않는다는 것입니다. 오히려 세포 집단의 변화를 통해 측정됩니다. 살아있는 동물 내 현미경 검사법과 추가 리포터 마우스의 생성에 있는 최근 발전 때문에, 개별 적인 세포의 생체 내 추적은 지금 가능합니다. 살아있는 동물 내 생명 현미경 을 사용하여, 우리는 Mx1/토마토/αSMA-GFP 마우스에 있는 24-48 시간 상해 내의 뼈 상해에 calvaria 봉합 틈새 틈새에서 P-SSCs의 명백한 이동을 관찰했습니다.
CCL5/CCR5는 최근 조기 부상 대응 중 채용 및 활성화 P-SSC에 영향을 미치는 규제 메커니즘으로 확인되었습니다. 흥미롭게도, 실시간으로 부상에 대한 응답으로 상당한 P-SSC 마이그레이션의 검출이 없었다. 그러나 CCL5로 부상을 치료하면 실시간으로 캡처할 수 있는 P-SSC의 강력하고 방향별 별다른 마이그레이션이 생성됩니다. 따라서, 이 프로토콜의 목적은 CCL5로 처리한 후에 실시간으로 P-SSC의 생체 내 이동을 기록하는 상세한 방법론을 제공하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>&frac12; &rdquo; 광학 포스트</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>이미징 마운트용</td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G 바늘</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G 인슐린 주사기</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니콜 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>마우스 구속용</td></tr><tr><td>조정 가능한 각도 플레이트</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>이미징 마운트</td></tr><tr><td>알코올 물티슈</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine 외과 스크럽</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL 서방형</td></tr><tr><td>콤보 III</td><td>직원 수의사로부터 획득</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL 케타민; 1.9 mg/mL 자일라진; 0.37 mg/mL 아세프로나진</td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>피셔</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 프리미엄 슈퍼슬립</td></tr><tr><td>파인 팁 셉트</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>라이카 TCS SP8MP with</td><td>DM6000CFS Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R & D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>의료용 테이프</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지</td><td>Anaheim 자동화</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>비흡수성 봉합</td>사 <td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>모노필라멘트 나일론 5-0 부착형 비흡수성 봉합사 C-1 역절단 바늘</td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>럭비</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &micro; g/50 &마이크로; </td></tr><tr><td>L &frac12용 직각 클램프; &rdquo; 포스트, 3/16" Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>이미징 마운트용</td></tr><tr><td>스프링 장착 3/16" 육각 잠금 &frac14; &rdquo; 나비 나사</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>이미징 마운트용</td></tr><tr><td>멸균 면봉</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>멸균 DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>멸균 드레이프</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>삼중 항생제 연고</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. </td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 혈액 수집 세트</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G 버터플라이 바늘 주입 세트(12인치 튜브</td></tr></tbody></table> 포함)

쥐에 있는 periosteal 골격 줄기 세포의 ccl5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal 골격 줄기 세포 (P-SSC)는 평생 뼈 유지 보수 및 수리에 필수적이며 골절 치유를 향상시키기 위한 치료법 개발에 이상적인 초점입니다.  Periosteal 세포는 골절 치유를 위한 새로운 연골 세포 및 골세포를 공급하기 위하여 상해로 급속하게 이동합니다. 전통적으로, 세포 이동을 유도 하는 사이토카인의 효능은 트랜스웰 또는 스크래치 분석 능력을 수행 하 여 체외에서 만 실시 되었습니다. 다광원 여기를 이용한 인트라바이탈 현미경법의 발전과 함께, 최근 1) P-SSC가 CCL5로 알려진 CCR5 리간드를 이용한 철새 유전자 CCR5 및 2) 치료를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, CCL5에 대응하여 골절 치유및 P-SSC의 이동을 향상시킨다. 이러한 결과는 실시간으로 캡처되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 CCL5로 치료 후 부상으로 칼변이 봉합사 골격 줄기 세포(SSC) 틈새 에서 P-SSC 마이그레이션을 시각화하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 마우스 구속 및 이미징 마운트의 구성, 마우스 칼바리아의 수술 준비, 칼바리아 결함 유도 및 시간 경과 이미징의 수집에 대해 자세히 설명합니다.

골격 선조는 철새 또는 순환 잠재력을 가지고 제안되었습니다20. 최근, Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+(Mx1/토마토/αSMA-GFP) 기자 마우스가 생성되었으며, P-SSC는 Mx1+α SMA+ 듀얼 라벨링(그림 2A,B)으로 표시되어 있습니다. Mx1+α SMA+ P-SSC의 실질적인 마이그레이션은 상해 후 24-48h 11 내에서 봉합사 메센치메에서 발생했습니다.  또한 칼바리아 결함 후 실시간으로 24시간 동안 생체 내 P-SSC 마이그레이션을 검출할...

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

표준화된 프로토콜은 내인성 세포 이동을 평가하는 데 사용할 수 있으며 골격 표현형뿐만 아니라 여러 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 손상 및/또는 사이토카인 치료에 대한 반응으로 세포 집단이 아닌 개별 세포에 대한 생체 내 세포 이동을 추적할 수 있다는 것입니다. 절차를 시작하기 전에 마취된 마우스에서 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하고 동물의 눈에 연고를 바르십시오.그런 다음 오른쪽 귀 바로 내측에서 왼쪽 귀를 향해 1cm 미만의 가로 절개를 하고 첫 번째 절개에서 오른쪽 눈을 지나 코 쪽으로 약 2-3mm 절개하여 두 번째 절개를 합니다. 집게를 사용하여 골막에서 피부를 분리하고 가위를 사용하여 결합 조직을 부드럽게 잘라 골막 골막에서 피부를 분리합니다. 멸균 면봉을 사용하여 피부 피판 위쪽에 안과 연고를 바르고 왼쪽 눈 위에 플랩을 부드럽게 접습니다.시상봉합사와 관상봉합사의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다. 열린 표면을 멸균 PBS로 씻어내어 혈액과 잔여 모발 부위를 청소하고 베벨 끝을 관상 봉합사에서 코쪽으로 1-2바늘 너비, 시상 봉합사 오른쪽에 1-2개의 바늘 너비로 놓습니다. 아주 적은 양의 하향 압력을 사용하여 주사기를 시계 방향으로 한 번, 시계 반대 방향으로 여러 번 조심스럽게 돌립니다.그런 다음 27게이지 바늘을 사용하여 미세 파괴를 약 40마이크로미터로 넓힙니다. 뼈 조각이 남아 있으면 PBS로 미세 골절 부위를 씻어냅니다. 뼈 조각이 여전히 남아 있으면 29게이지 바늘을 사용하여 조각을 부드럽게 퍼냅니다.CCL5 처리의 경우 밀리리터당 100나노그램 스톡 CCL5 용액 및 기저막 매트릭스를 사용하여 밀리리터당 10나노그램 작동 화학유인 용액을 얻습니다. 부상을 치료하려면 220마이크로리터 피펫에 5마이크로리터의 용액을 로드하고 2마이크로리터의 케모카인을 봉합사에 도포합니다. 그런 다음 매트릭스가 응고되도록 하고 피부 피판으로 칼바리아를 부드럽게 덮어 1시간 케모카인 치료 중에 조직이 탈수되지 않도록 합니다.골막 줄기 세포 이동을 실시간으로 촬영하려면 마우스를 현미경으로 이동하기 전에 마우스의 머리 뒤쪽에 부드러운 압력을 가하여 칼바리아의 시야를 확인합니다. 비행기가 수평이 아니면 마우스 고정 장치를 왼쪽이나 오른쪽으로 부드럽게 돌려 위치를 조정하십시오. 다음으로, 피부 플랩의 전체 칼바리아를 멸균된 2% 메틸셀룰로오스로 물에 덮고 마우스를 XYZ 축 전동 현미경 스테이지에 놓습니다.에피형광등을 사용하여 마우스가 현미경을 향하고 관상동상과 시상 봉합사의 교차점이 스테이지의 중심 기준점이 되도록 마우스를 정렬합니다. 그런 다음 이미징 영역에 유리 덮개를 놓고 정렬을 다시 확인합니다. 봉합사 안팎으로 이동하는 타임랩스 이미징을 위해 저배율 수침 렌즈를 선택하여 칼바리아를 스캔하십시오.시상과 관상 봉합사 교차점의 참조 이미지를 획득하고 세포의 SHG 및 형광 신호를 사용하여 각 손상 부위를 찾고 XYZ 좌표와 시상 봉합사 및 관상 봉합사로부터의 거리를 기록합니다. 장기 이미징을 위해 관상 봉합사 또는 시상 봉합사의 위치를 선택하고 이미징 중에 참조에서 이 영역의 자세한 ZStack 이미지를 얻습니다. 타임랩스 소프트웨어 설정을 사용하여 최소 1시간 동안 1분마다 이미지를 녹화하고 스냅샷 사이의 시간 동안 현재 시야와 초기 시야를 비교합니다.시야가 다른 경우 ZStack 이미지를 사용하여 시야를 조정해야 하는 방향을 결정합니다. 최근에는 골막골격 줄기세포가 Mx1 양성 알파-SMA 양성 이중 표지로 표시된 Mx1 토마토 알파-SMA GFP 리포터 마우스가 생성되었습니다. 봉합사 배치 후 24시간 후 1시간 동안 영상 기간 동안 Mx1 양성 알파-SMA 양성 골막 골격 줄기세포 이동이 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다.부상 후 24시간 이내에 칼바리아 결손의 CCL5 케모카인 치료는 관상 봉합사에서 부상 부위로 방향적으로 뚜렷한 이동을 유도합니다. 이 대표적인 분석에서, 이미징 후 1시간 이내에 Mx1 양성 알파-SMA 양성 골막 골격 줄기세포 중 하나가 손상 쪽으로 약 50마이크로미터를 이동했습니다. 이 프로토콜에서 기억해야 할 가장 중요한 측면은 세포 특이적 이동을 자극하기 위해 CCL5 치료를 손상 부위로 제한하는 것입니다.이 절차가 완료되면 일주일 동안 국소 치료를 계속할 수 있습니다. 마이크로 CT는 칼바리아 부상 치유 및 미네랄 침착을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

이 프로토콜에는 빨강 형광 라벨 내부 관절 (IA) 주입을 통해 쥐 무릎 관절염 (KOA) 모델에 의해 셀 속성과 biodistribution 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 (haMSCs)의 모니터링 하는 효율적인 방법을 설명 합니다.

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본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

배우세요 쥐 두개골에서 CCL5에 의해 유도된 골격 줄기 세포 이동을 실시간으로 추적하는 방법을. 이 기술은 조직 재생 연구에서 개별 세포의 행동을 관찰하는 데 활용됩니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

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