쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

표준화된 프로토콜은 내인성 세포 이동을 평가하는 데 사용할 수 있으며 골격 표현형뿐만 아니라 여러 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 손상 및/또는 사이토카인 치료에 대한 반응으로 세포 집단이 아닌 개별 세포에 대한 생체 내 세포 이동을 추적할 수 있다는 것입니다. 절차를 시작하기 전에 마취된 마우스에서 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하고 동물의 눈에 연고를 바르십시오.

그런 다음 오른쪽 귀 바로 내측에서 왼쪽 귀를 향해 1cm 미만의 가로 절개를 하고 첫 번째 절개에서 오른쪽 눈을 지나 코 쪽으로 약 2-3mm 절개하여 두 번째 절개를 합니다. 집게를 사용하여 골막에서 피부를 분리하고 가위를 사용하여 결합 조직을 부드럽게 잘라 골막 골막에서 피부를 분리합니다. 멸균 면봉을 사용하여 피부 피판 위쪽에 안과 연고를 바르고 왼쪽 눈 위에 플랩을 부드럽게 접습니다.

시상봉합사와 관상봉합사의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다. 열린 표면을 멸균 PBS로 씻어내어 혈액과 잔여 모발 부위를 청소하고 베벨 끝을 관상 봉합사에서 코쪽으로 1-2바늘 너비, 시상 봉합사 오른쪽에 1-2개의 바늘 너비로 놓습니다. 아주 적은 양의 하향 압력을 사용하여 주사기를 시계 방향으로 한 번, 시계 반대 방향으로 여러 번 조심스럽게 돌립니다.

그런 다음 27게이지 바늘을 사용하여 미세 파괴를 약 40마이크로미터로 넓힙니다. 뼈 조각이 남아 있으면 PBS로 미세 골절 부위를 씻어냅니다. 뼈 조각이 여전히 남아 있으면 29게이지 바늘을 사용하여 조각을 부드럽게 퍼냅니다.

CCL5 처리의 경우 밀리리터당 100나노그램 스톡 CCL5 용액 및 기저막 매트릭스를 사용하여 밀리리터당 10나노그램 작동 화학유인 용액을 얻습니다. 부상을 치료하려면 220마이크로리터 피펫에 5마이크로리터의 용액을 로드하고 2마이크로리터의 케모카인을 봉합사에 도포합니다. 그런 다음 매트릭스가 응고되도록 하고 피부 피판으로 칼바리아를 부드럽게 덮어 1시간 케모카인 치료 중에 조직이 탈수되지 않도록 합니다.

골막 줄기 세포 이동을 실시간으로 촬영하려면 마우스를 현미경으로 이동하기 전에 마우스의 머리 뒤쪽에 부드러운 압력을 가하여 칼바리아의 시야를 확인합니다. 비행기가 수평이 아니면 마우스 고정 장치를 왼쪽이나 오른쪽으로 부드럽게 돌려 위치를 조정하십시오. 다음으로, 피부 플랩의 전체 칼바리아를 멸균된 2% 메틸셀룰로오스로 물에 덮고 마우스를 XYZ 축 전동 현미경 스테이지에 놓습니다.

에피형광등을 사용하여 마우스가 현미경을 향하고 관상동상과 시상 봉합사의 교차점이 스테이지의 중심 기준점이 되도록 마우스를 정렬합니다. 그런 다음 이미징 영역에 유리 덮개를 놓고 정렬을 다시 확인합니다. 봉합사 안팎으로 이동하는 타임랩스 이미징을 위해 저배율 수침 렌즈를 선택하여 칼바리아를 스캔하십시오.

시상과 관상 봉합사 교차점의 참조 이미지를 획득하고 세포의 SHG 및 형광 신호를 사용하여 각 손상 부위를 찾고 XYZ 좌표와 시상 봉합사 및 관상 봉합사로부터의 거리를 기록합니다. 장기 이미징을 위해 관상 봉합사 또는 시상 봉합사의 위치를 선택하고 이미징 중에 참조에서 이 영역의 자세한 ZStack 이미지를 얻습니다. 타임랩스 소프트웨어 설정을 사용하여 최소 1시간 동안 1분마다 이미지를 녹화하고 스냅샷 사이의 시간 동안 현재 시야와 초기 시야를 비교합니다.

시야가 다른 경우 ZStack 이미지를 사용하여 시야를 조정해야 하는 방향을 결정합니다. 최근에는 골막골격 줄기세포가 Mx1 양성 알파-SMA 양성 이중 표지로 표시된 Mx1 토마토 알파-SMA GFP 리포터 마우스가 생성되었습니다. 봉합사 배치 후 24시간 후 1시간 동안 영상 기간 동안 Mx1 양성 알파-SMA 양성 골막 골격 줄기세포 이동이 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다.

부상 후 24시간 이내에 칼바리아 결손의 CCL5 케모카인 치료는 관상 봉합사에서 부상 부위로 방향적으로 뚜렷한 이동을 유도합니다. 이 대표적인 분석에서, 이미징 후 1시간 이내에 Mx1 양성 알파-SMA 양성 골막 골격 줄기세포 중 하나가 손상 쪽으로 약 50마이크로미터를 이동했습니다. 이 프로토콜에서 기억해야 할 가장 중요한 측면은 세포 특이적 이동을 자극하기 위해 CCL5 치료를 손상 부위로 제한하는 것입니다.

이 절차가 완료되면 일주일 동안 국소 치료를 계속할 수 있습니다. 마이크로 CT는 칼바리아 부상 치유 및 미네랄 침착을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.