Name: 페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 체외에서 유리화된 인간 배아를 해동하고 배양하여 착상기 트로포블라스트 세포를 단일 세포로 분리 수집하는 방법을. 이 기술은 초기 임신 손실과 착상 실패의 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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우리는 콜로라도 생식 의학 센터 (CCRM)의 많은 환자들이 연구를 위해 자신의 배아를 정중하게 기증한 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 카렌 마루니아크와 hCG 샘플 처리에 그들의 도움에 대한 CCRM의 임상 실험실뿐만 아니라, 고소 맥코믹과 그녀의 임상 IVF 배아 팀이 배아 수집, 저장, 추적 및 기부에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 자금 조달은 CCRM에 의해 내부적으로 제공되었습니다.

모든 인간 배아는 연구에 사용하기 위한 동의하에 기증되었습니다. 확장된 인간 배아 문화에 대한 프로토콜은 서부 기관 검토 위원회 (연구 번호 1179872)에 의해 승인되었으며 국제 지침을 따릅니다. 인간 배아의 사용은 이 프로토콜을 사용하여 연구 기관과 관련된 적절한 윤리 및 관리 기관에 의해 검토되어야 합니다.
1. 준비
<ol><li>멸균 라미나르 플로우 후드에서 배아 온난화 하루 전에 미디어 및 복구 플레이트를 준비합니다.<ol>
<li>10% v/v 혈청 단백질 대용(SPS)으로 2mL의 배반성 배양 배지(BM)를 준비한다. 참고: Blastocyst 배양 배지는 추가 단백질을 함유할 수도 있거나 포함하지 않을 수 있습니다. 여기서, 우리는 표시된 알부민 단백질의 10%로 보충되어야 하는 매체를 사용했습니다. 이 보충의 변화에 대 한 제조 업체 지침을 확인. 모든 미디어는 멸균 주사기에 부착된 멸균 0.22 μM 필터를 사용하여 계피하기 전에 필터링해야 합니다.</li>
		<li>배아 배양 등급 오일 500 μL로 덮인 10% v/v SPS로 BM 500 μL로 두 개의 센터 웰 장기 배양 세척 접시를 채웁니다.</li>
		<li>60mm 조직 배양 접시에서 배아 배양 오일의 8mL을 층으로 한 다음 배양 판의 바닥에 10 % v / v SPS로 BM의 20 μL 방울을 고정시하십시오. 따뜻하게 한 각 배아에 대해 1 방울을 만드십시오. 참고: 필요에 따라 더 많은 미디어, 드롭 및 세척 요리가 만들어질 수 있습니다. 방울은 또한 기름을 겹쳐지기 전에 접시에 첨가될 수 있습니다. 오일 아래에 낙하를 고정하면 증발과 향후 진동 의 변화를 줄이는 데 도움이됩니다.</li>
		<li>BM은 37°C에서 인큐베이터에서 10% v/v SPS 세척접시 및 회수판을, 6% CO2, 5% O2를 4시간 이상 이다.</li>
		<li>4°C 또는 벤치 탑에서 확장 배양 매체(IVC1)의 첫 번째 단계의 한 유리병을 해동한다.</li>
		<li>오일 오버레이 없이 IVC1 500 μL의 워시 접시 1개를 준비합니다. 알리쿼트 약 4 mL IVC1 5 mL 스냅 캡 튜브에.</li>
		<li>IVC1 워시 디쉬 및 IVC1의 작은 스냅 캡 튜브를 37°C, 6% CO2, 대기 O2를 4시간 이상 상화한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 라미나르 플로우 후드에서 배아 온난화 하루 전에 확장 배양 판을 준비한다.<ol>
<li>인산완충식염(PBS)에서 인간 혈청에서 30 μg/mL로 섬유네틴을 희석시켰다. 배아당 30 μg/mL 섬유네틴의 250 μL이 챔버를 코팅하는 데 필요합니다.</li>
		<li>우물을 만지지 않도록 주의하면서 후드 아래에 8 개의 잘 챔버 커버 슬립 패키지를 엽니 다. 30 μg/mL 섬유네틴의 250 μL을 각 우물에 부드럽게 파이펫합니다.</li>
		<li>뚜껑을 챔버 커버슬립으로 되돌리고 20-24h의 경우 4°C로 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 온난화의 아침에 확장 된 배양 판을 준비합니다.<ol>
<li>섬유네틴으로 챔버 커버슬립을 검색하고 라미나르 플로우 후드에 놓습니다. 1mL 파이펫으로 섬유네틴 혼합물을 제거하고 폐기물 용기에 버려십시오.</li>
		<li>작은 5mL 스냅 캡 튜브에서 따뜻하게, 평형 IVC1 미디어를 검색합니다.</li>
		<li>각 우물에 평형 IVC1의 파이펫 300 μL. 이 오염의 위험을 증가시킬 것이다 어떤 유체가 뚜껑을 만지지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>IVC1을 사용하여 챔버 커버슬립을 반환하여 37°C, 6% CO2 및 대기 O2를 4단계에서 조나 펠루치다를 제거할 때까지 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 온난화 유리 D5 인간 배아
참고: 다른 제조업체는 자체 진동 기술에 따라 약간 다른 프로토콜을 가질 수 있습니다. 해당 되는 경우 제조업체의 사용 지침을 참조하십시오.
<ol><li>35mm 접시에서 37°C까지 3.0mL의 해동 용액(TS)을 따뜻하게 합니다. 300μL의 희석 용액(DS)과 300μL의 2개의 웰을 실온에 6웰 플레이트에 넣습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여, 유리화 된 태아가 항상 액체 질소 아래에 남아 있는지 확인하면서 조심스럽게 냉동 장치 슬리브를 제거합니다.</li>
	<li>액체 질소에서 냉동장치를 빠르게 이동하고 37°C에서 TS에서 냉동장치의 끝을 급락시다. 타이머를 1분 동안 설정하고 배아가 TS로 분리될 때까지 냉동 장치를 잠수하도록 하십시오. 참고: 다운스트림 분석에서 환자 인구 통계 학적 정보와 관련될 수 있기 때문에 배아 정체성을 추적하기 위해 한 번에 하나씩 따뜻한 배아.</li>
	<li>TS에서 1 분 잠복 하는 동안, 조심스럽게 냉동 장치를 제거 하 고 부드럽게 배아를 선택 하 고 TS 접시의 반대쪽으로 이동. 참고: 여러 배아를 배양하는 경우 적절한 정체성이 유지되도록 배아를 분리하도록 부지런히 하십시오.</li>
	<li>1 분 후, 소량의 TS, 약 2 μL로 배아를 부드럽게 집어 들십시오. 파이펫에서 TS의 얇은 층에서 배아를 덮으면서 300 μL DS의 바닥으로 배아를 잘 이동합니다. 타이머를 3분 동안 설정하고 6웰 플레이트를 실온에서 벤치 탑에 놓습니다.</li>
	<li>3 분 후, 소량의 DS, 약 2 μL로 배아를 선택하고 배아를 다음 우물의 300 μL을 포함하는 다음 우물의 바닥으로 이동합니다. 다시, 부드럽게 배아 위에 파이펫에서 DS의 소량을 층. 타이머를 5분 동안 설정하고 벤치 탑으로 돌아갑니다.</li>
	<li>5 분 후, WS의 최소 부피와 배아를 선택하고 300 μL WS의 최종 우물의 상단으로 이동합니다. 배아는 천천히 떨어지고 WS를 통해 바닥으로 씻습니다. 피펫에서 유지된 WS를 빈 우물로 추방합니다.</li>
	<li>최소한의 부피로 배아를 선택하고 WS의 동일한 300 μL 웰의 상단으로 돌아갑니다. 배아는 다시 한번 우물의 바닥으로 떨어질 것입니다. 타이머를 1분 동안 설정하고 6웰 플레이트를 벤치 탑으로 되돌려 놓습니다.</li>
</ol>3. 따뜻한 배아의 회복
<ol><li>한 번에 하나씩, 평형 배아 배양 등급 오일의 500 μL 에서 10% v/v SPS로 500 μL의 평형 BM을 포함하는 중앙 우물 기관 조직 접시로 따뜻하게 된 배아를 이동합니다.</li>
	<li>각 배아를 집어 들고 접시의 여러 영역으로 이동하여 배아를 씻어 내고 이동 사이에 오래된 미디어를 불어 넣습니다. 배아를 집어 들고 기름 아래 10% v/v SPS로 평형 BM의 개별 20 μL 배양 방울로 이동합니다.</li>
	<li>온난한 배아는 37°C, 6% CO 2, 5% O2에서 인큐베이터에서 2시간 동안 회복하게한다.
</li>
</ol>4. 조나 제거
<ol><li>2 시간 복구 후, 재확장을 위해 배아를 평가하고 각 배아의 사진을 찍습니다.</li>
	<li>산성 티로드의 용액으로 치료하기 전에 5%(v/v) 태아 종아리 혈청(FCS)을 사용하여 3-(N-morpholino)-프로판설포닉산(MOPS)-완충 처리 매체의 500 μL에서 개별적으로 배아를 이동시합니다.</li>
	<li>현미경을 통해 적극적으로 관찰하면서 따뜻한 산성 티로드의 용액의 300 μL을 통해 신속하게 하나의 배아를 이동합니다. 조나 펠루시다는 시각적으로 용해되기 시작합니다. 이 약 5 s걸릴 것입니다.</li>
	<li>즉시 용해 구역으로 배아를 300 μL로 이동하여 온수 MOPS 완충 배지를 사용하여 산 성 티로드의 용액을 담금질합니다.</li>
	<li>최소한의 양의 MOPS 완충 배지로 배아를 평형 BM 500 μL을 포함하는 중앙 우물 기관 조직 접시로 이동하여 500 μL 미만의 양형 배양 등급 오일을 세척합니다.</li>
	<li>3.2 단계에서 배아를 20 μL 회복 하강으로 되돌려 놓습니다. 참고: 조나 제거 후 육안 검사를 받으면, 유지된 조나 펠루시다를 가진 모든 배아는 필요한 경우 4.2-4.6단계를 반복하여 산성 티로드의 용액으로 더 치료될 수 있다. Tyrode의 솔루션에 대한 노출을 최소화하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 배반세포 확장 문화
<ol><li>1.1.6 단계에서 EVC1 미디어를 사용하여 배아를 세척 접시에 개별적으로 이동합니다. 1개의 배아를 평형 IVC1로 챔버 커버슬립의 한 우물로 조심스럽게 옮기고 배아 식별을 유지합니다. 참고: 중간 증발을 최소화하기 위해 이 단계를 가능한 한 빨리 완료해야 합니다.</li>
	<li>2일 동안 37°C, 6% CO2, 대기 O2로 설정된 인큐베이터로 챔버 커버슬립을 반환한다. 참고: 37°C, 6% CO2, 대기 O2에서 미디어를 4시간 전에 해동및 평형화해야 합니다.</li>
	<li>D2(D7 포스트 수정)에서 현미경하에서 배아의 부착을 주의 깊게 검토하고 미디어 교환을 수행합니다.<ol>
<li>미디어를 교환하기 전에 접시에 부착된 배아에 유의하십시오. 부드럽게 접시를 누르고 배아가 현미경 의 밑에 접시에 단단히 붙어 있는지 검사합니다.</li>
		<li>뚜껑을 제거하고 IVC1의 150 μL을 조심스럽게 제거하고 부착 된 배아를 방해하지 않고 폐기하십시오. 배아가 아직 접시에 부착되지 않은 경우 IVC1의 혈청이 배아 부착에 도움이 되기 때문에 미디어를 교환하지 마십시오.</li>
		<li>피펫 150 μL의 확장 배양 매체 IVC2는 천천히 각 우물로 천천히 들어가 뚜껑을 챔버 커버슬립으로 되돌려 보입니다. 참고: 중간 증발을 방지하기 위해 챔버 커버슬립에서 뚜껑을 제거하는 것이 최소화되었는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뚜껑에 있는 미디어를 튀지 않고 챔버 커버슬립을 인큐베이터로 조심스럽게 되돌려 보입니다. 배아가 고정 또는 단세포 소화를 위한 준비가 될 때까지 확장된 배양의 매일 미디어 교환 및 부착 검사를 반복합니다.</li>
</ol>6. 소비된 미디어의 선택적 컬렉션
<ol><li>선택적으로, D7 이후 또는 그 후 하루 동안 문화 매체를 교환하는 동안 소비 된 미디어를 수집합니다. 단계 동안 5.3.2, 오히려 중간 스냅 동결 을 폐기하는 대신 제거 된 IVC1의 150 μL멸균으로, 향후 분석을 위한 낮은 바인드 0.5 mL 튜브.</li>
</ol>7. 면역 형광을위한 선택적 고정
<ol><li>200 μL 파이펫을 사용하여 PBS의 1/2 미디어 교환을 3배 동안 배아를 세척한 후 세포외 이물질을 제거합니다. 과도한 이물질과 단백질을 씻어내면 선명도를 최적화하고 면역형으로 얻은 이미지의 배경을 줄이는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>모든 미디어를 제거하고 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 200 μL을 천천히 첨가합니다. 배아는 유체의 표면에 충실할 것입니다. 모든 유체를 제거하기 전에 4 % PFA로 여러 150 μL 세체가 배아의 손상을 최소화하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>고정을 위해 20 분 동안 4 % PFA에서 배아를 배양하십시오.</li>
	<li>신선한 PBS에서 0.1% v/v 폴리소르바테 20의 200 μL로 세척당 10분 동안 배아3배구를 세척합니다.</li>
	<li>면역 형광 프로토콜을 진행하기 전에 4 °C에서 PBS에서 0.1 % v / v 폴리소르 바테 20에 고정 된 배아를 저장합니다.</li>
</ol>8. 트립신과 단일 세포 소화
참고: 신선한 (고정되지 않은) 배아는 단세포 소화를 위해 사용됩니다.
<ol><li>PBS200 μL로 배아를 한 번 씻고 각 웰에 200 μL의 트립신 용액을 추가하십시오. 챔버 커버슬립을 인큐베이터에 5분 동안 반환합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 챔버 커버슬립을 제거하고 입체 현미경 하에서 배아를 검사합니다. 배아 주변의 세포는 후퇴하기 시작하고 MTB는 여전히 배아에서 원격으로 위치한 플레이트에 부착되어야합니다.</li>
	<li>작은 파이펫이나 잘게 당겨진 입 파이펫을 사용하여 전체 배아를 분해하기 전에 개별 MTB를 선택하십시오. MTB를 저장하고 9.3 단계 후 8.4 단계로 돌아 9.1 단계로 앞으로 건너 뜁니다.</li>
	<li>핸드헬드 마이크로 조작 파이펫 또는 입 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 분해합니다.</li>
	<li>세포는 전체 태아에게서 해리하기 시작합니다. 배아가 트립신에서 총 10분 동안 배양될 때까지 더 작은 직경의 파이펫 팁이나 입 파이펫을 사용하여 배아를 부드럽게 반복적으로 흡인하게 합니다.</li>
</ol>9. 단일 셀 선택 및 샘플 수집
<ol><li>최소한의 트립신으로, 균사 배양 오일 하에서 20 μL PBS + 0.1 % 폴리 비닐 피롤리돈 (PVP)의 세 가지 세척 방울을 통해 해리 된 세포를 이동하여 세포를 잃지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>셀을 세척한 후 잘게 당겨진 유리 파이펫을 사용하여 셀 하나를 선택합니다. PBS+0.1% PVP의 최소 부피로 단일 셀을 멸균 0.2 mL 저결합 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.</li>
	<li>액체 질소 (LN2)에서단일 세포를 고정하고 향후 사용을 위해 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이식을 통해 인간 배아를 배양하는 프로토콜의 개발은 과학자들이 개발8,,9에서이전에 미지의 시간을 탐구할 수 있게 해 주었다. 여기서, 우리는 인간 배아를 배양하고 villous 태반의 형성 전에 초기 trophoblast 분화를 연구하기 위하여 확장된 배양 시스템을 이용합니다. 여기에 설명된 방법은 다운스트림 단세포 분석에 사용하기 위해 다른 TB 하위계를 수집할 수 있게 해주다. 이 연구는 과학 공동체가 인간 발달에서 이 중요하고 수수께끼적인 기간을 이해할 수 있는 기회를 허용하고, 유산 또는 자간전증과 같은 그밖 태반 병리를 위한 치료 처리를 위한 새로운 기회를 열 수 있을 뿐만 아니라, 초기 인간 발달에 관하여 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확장 된 배양 전에 배아 스트레스를 최소화하기 위해 배아 온난화, 조나 제거 및 도금 중에 배아를 신속하게 ...

인간의 이식과 초기 태반의 출현은 역사적으로 어렵고 임신이 임상적으로 감지 할 수없는 경우 이 단계에서 인간의 조직에 접근 할 수 없기 때문에 크게 알려지지 않았습니다. 인간 태반은 다른 유테리안 포유류에 비해 고유 한 특징을 가지고 있기 때문에 동물 모델은 부적절합니다. 예를 들어, 인간의 태반은 다른 세포가 자궁 나선형 동맥을 리모델링하는 동안 자궁 근막의 적어도 내부 3 분의 1에 도달하는 일부 영양 세포와 데시두아 깊숙이 침입한다. 심지어 우리의 가장 가까운 진화 조상, 비 인간 영장류, 모계 decidual조직1,,2,,3과태반 형태와 열대 성술 상호 작용의 차이를 보여줍니다 . 체외에서 이식 전 인간 배아를 얻는 것은 1980년대까지 는 임상 인간이 체외 수정(IVF)이불임치료를 위한 일상적인 관행으로 시작될 때까지 가능하지 않았다. 지금, 인간 blastocysts는 전송을 위한 더 실행 가능한 태아의 선택을 허용하기 위하여 시험관에서 성장될 수 있고, 뿐만 아니라 안전한 유전 시험을 가능하게 합니다. 배아 배양 기술의 개선뿐만 아니라 IVF의 사용이 증가함에 따라 환자의 치료 주기가 완료된 후에도 남아있는 많은 잉여 배반증을 산출했습니다. 환자의 동의, IRB 승인 및 특정 제한으로 이러한 배반구는 연구 연구에 사용될 수 있습니다. 그(것)들은 인간 배아 줄기 세포의 유도를 위해 이용된 귀중한 자원이 되었다5,배아 줄기 세포로 내부 세포 질량의 전이를이해6,,7,그리고 더 최근에, 성공적으로 인간이식8,,9를리모델링하기 위하여 일 (D) 13까지 배양되었다. 최근에 개발된 단일 세포 오믹스 접근법을 활용함으로써, 이러한 이식 단계 인간 배아 조직에 대한 접근은 이전에는 10,11,12,,13을탐구하는 것이 불가능했던 이 고동적인 세포 분화 과정을 조절하는 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 독특한 기회를 제공했다.,,
여기서, 우리는 인간이식(12)동안 트로포블라스트 분화의 역학을 특징으로 하는 최근 간행물에 사용된 방법을 설명한다. 본 프로토콜은 유리화된 blastocysts의 온난화, D12 포스트 IVF까지 확장된 배아 배양, 단일 세포로의 배아의 효소 소화, 하류 분석에 대한 세포 수집을포함한다(도 1). 이러한 확장배양 시스템은 모계 입력 없이 peri-이식 단계 인간 배아 발달을 지원하고 수년 전 조직학적 표본으로부터 이루어진 관찰과 일치하는 트로포블라스트 분화를 재구성하여14년 전,,15,,16,,17을지원합니다. 이식 하는 동안, trophoblast 인구는 적어도 두 개의 세포 유형으로 구성: 단핵 된 선조 같은 cytotrophoblast (CTB) 그리고 말단 분화, 다핵 싱크itiotrophoblast (STB). 트립신 소화시 CTB는 다른 세포 계보와 형태학적으로 구별할 수 없는 작고 둥근 세포입니다(도2A,왼쪽 패널). 에피블라스트 및 원시 적 엔데담과 같은 다른 세포 계보로부터 CTB의 분리는 단세포 RNA 염기서열에 의해 드러난 뚜렷한 전사 프로파일에 의해 달성될 수 있다. Syncytiotrophoblast 세포는 쉽게 다른 세포 유형보다 상당히 큰 불규칙한 모양의 구조로 쉽게 식별 될 수 있으며 주로 배아의 주변에 위치(도 2A,중간 패널; 그림 2B,왼쪽 패널). 철새 트로포블라스트 세포(MTB)는 배아 확장 배양 중에 발견되는 또 다른 트로포블라스트 서브라인이며 배아의 본체에서 멀어지는 것처럼 인식될 수있다(도 2A,오른쪽 패널, 도 2B,오른쪽 패널). 철새 트로포블라스트는 여분의 빌루스 트로포블라스트 (EVT)와 같은 마커의 많은 표현하지만, 태반의 villous 구조는 개발의 이 초기 단계에서 등장하지 않았기 때문에 EVT로 언급되어서는 안됩니다.
실험적으로, 우리는 배아가 D8, D10 및 D12(그림2A, B)에서단일 세포로 소화된 후에 쉽게 구별할 수 있는 작은 CTB 및 큰 STB를 수집할 수 있었습니다. 철새 열대성 세포는 확장된 배아 배양의 후기 단계에서 발생하며 전체 배아의 효소 소화 전에 D12에서 수집될 수있다(그림 2A, B). 단일 세포 분석 전에 이러한 3개의 트로포블라스트 하위계를 전형적으로 분리함으로써, 우리는 특정 전사 마커를 식별하고 각 세포 유형의 생물학적 역할을 정의할 수 있다. 세포로포스트는 매우 증식되어 있으며 STB 및 MTB 분화 혈통10,11,,,12,,13을공급하는 선조 세포역할을 한다. Syncytiotrophoblast는 임신을 유지하기 위하여 태반 호르몬을 생산에 관여하고 또한 자궁 내측으로 잠복하는 태아에 책임 있을 지도 모릅니다10,,11,,12,,13. 철새 트로포블라스트는 침략적이고 철새 현상형의 더 강한 특징을 가지고 있으며 자궁 내막관10,11,12,13의더 깊고 광범위한 식민지화를담당할가능성이 높습니다.,, 각 세포 유형의 전사 적 서명을 정의 한 후, 클러스터링 분석은 또한 CTB와 형태학적으로 구별할 수 없는 세포의 2개의 추가 하위 집합을 밝혔으며 각각12개의STB 및 MTB의 특징을 가진 전사를 가졌다. 이 중간 단계 세포는 CTB에서 MTB 또는 STB 하위라인으로 분화하는 과정에서 가능성이 높으며 배아가 맹목적으로 소화되고 세포가 전사에 의해단독으로 분리되었다면 간과되었을 것입니다.
여기서 설명된 프로토콜은 2차원(2D) 배양 시스템을 활용하고 새로 개발된 3D 배양시스템(13)을설명하는 최근 간행물에 의해 제안된 바와 같이 3차원(3D) 구조 개발을 지원하는 데 최적이 아닐 수 있다. ,그럼에도 불구하고, 이 2D 시스템에서 초기 트로포블라스트의 분화는 생체 내표본(14,15,16,17)에서이루어진관찰과일치하는 것으로 보인다., 또한 이러한 프로토콜은 최소한의 변경으로 최근에 설명된 3D 배양시스템(13)에서의 사용에 맞게 용이하게 적용될 수 있다. 모든 단계는 고무 튜브, 필터 및 마우스피스에 부착 된 미세하게 당겨진 유리 파이펫에서 시판 되는 일회용 팁 또는 입 파이펫이있는 휴대용 마이크로 조작 파이펫으로 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>NORM JECT Luer Lock 멸균 주사기</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>100</td></tr>, <tr><td>3130 또는 3110 Forma Series II 수복 CO2 인큐베이터</td> 팩<td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>35mm Corning Primaria 조직 배양 접시</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>500 5mL</td></tr><tr><td>스냅 캡 튜브</td> 케이스 <td>VWR</td><td>60819-295</td><td>25</td></tr><tr><td>60mm Corning Primaria 조직 팩 문화 접시</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>200</td></tr><tr><td>6웰 접시</td><td>Agtech Inc.</td> 케이스<td>D18</td><td>팩 1, 10 또는 50</td></tr><tr><td>산성 Tyrode 솔루션</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>960</td></tr><tr><td>Blast, 배반포 배양 매체</td><td>Origio</td><td>83060010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>희석 용액</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5.75 in. (146mm); 720/CS</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>배아 배양 파라핀 오일 OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR 튜브 0.2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>1,000</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR 튜브 0.5 mL</td><td>팩 VWR</td><td>89130-980</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈장에서 추출한 500 Fibronectin 사례. 액체 .1% 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>길슨 20 &마이크로; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 &마이크로; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 &micro; L</td></tr><tr><td>G-MOPS 취급 매체</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>취급 매체</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 웰 챔버 커버 슬립</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>상자 당 15 슬라이드</td></tr><tr><td>IVC1 / IVC2</td><td>세포 유도 시스템</td><td>M11-25 / M12-25</td><td>5-5mL 분취</td></tr><tr><td>K 시스템 T47 온난화 플레이트</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex 멸균 주사기 필터 Durapore PVFD 멤브레인</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>50</td></tr>개 <tr><td>입 조각</td><td>팩 IVF Store</td><td>MP-001-Y</td><td>100개</td></tr><tr><td>Oosafe 센터 웰 디쉬</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>500개 케이스</td></tr><tr><td>SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>입 조각용 고무 라텍스 튜빙</td><td>IVF 스토어</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5</td></tr>피트<tr><td>스테레오현미경</td><td>니콘</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>스트리퍼 팁</td><td>쿠퍼 서지컬</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &마이크로; m</td></tr><tr><td>해동 솔루션</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>The Stripper Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL 병</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>960 팩</td></tr><tr><td>VWR 1-200 &micro; L 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>960 세척</td></tr><tr><td>용액</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table> 팩

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

인간의 이식, 자궁 표면 상피에 대한 정착 및 접착및 모계 데시두아에 배반증이 잇따라 침입한 것은 기술적, 윤리적 한계로 인해 역사적으로 연구하기가 어려웠던 중요하면서도 수수께끼같은 생물학적 사건이다. 이식은 초기 트로포 블라스트에 트로페토데름의 개발과 뚜렷한 열대 성세포 하위로 후속 분화에 의해 시작된다. 비정상적인 초기 트로포블라스트 분화는 이식 실패, 태반 병리, 태아 이상 및 유산으로 이어질 수 있습니다. 최근에는 인간 배아가 인체의 이식 기간을 포괄하는 시동 조직부재에서 체외에서 13일째까지 자라도록 하는 방법이 개발되었다. 이것은 연구원에게 인간 이식을 조사하고 모성의 영향을 혼동하고 생체 내초기 배아 분화 사건을 연구하기 위하여 내재된 장애물을 피하지 않고 이 중요한 기간 도중 trophoblast 분화의 역학을 재정의할 기회를 주었습니다. 이식 중 상이한 트로프토블라스트 서브라인지를 특성화하기 위해 기존의 2차원(2D) 확장 배양 방법을 채택하고 하류 분해를 위해 다양한 유형의 트로피컬블라스트 세포를 효소적으로 소화하고 분리하는 절차를 개발했습니다. 2D 조건에서 배양된 배아는 비교적 평평한 형태를 가지며 생체 내 3차원(3D) 배아 아키텍처에서 모델링에 최적이 아닐 수 있다. 그러나, trophoblast 분화는 확장된 문화의 과정을 통해 예상된 형태학 및 유전자 발현 변경에 의해 입증된 바와 같이 보다 적게 영향을 받는 것처럼 보입니다. 사이토트로토블라스트, 싱크티오트로포블라스트 및 철새 트로포블라스트를 포함한 다른 열대성 아열대는 크기, 위치 및 측두적인 출현으로 구분될 수 있으며, 추가 특성화 또는 실험에 사용될 수 있다. 이 초기 trophoblast 세포의 조사는 일반적인 태반 병리를 취급하고, 임신 손실의 부각을 완화하는 인간 이식을 이해하는 중요한 역할을 할 수 있습니다.

건강한 배아는 확장된 배양(도2B)의과정을 통해 지속적인 증식을 나타냈다. 비정상적인 배아는 외부 가장자리에서 후퇴하기 시작했고붕괴(그림 2C). 우리의 경험에서, 배아의 대략 75%는 48 h에서 fibronectin 코팅 된 접시의 바닥에 부착하고 배양에서 약 90 %로 증가. 배아 부착의 성공은 크게 배반구의 초기 품질에 의해 영향을받을 수있다. 72h에 의해 부착되지 않은 배아는 살아남을 가능성이 높습니다.
D8 포스트 수정(D3)에서 배아내 대부분의 세포는 영양세포 마커 GATA3(도3A)에대해 양성인 CTB였다. 세포성 축하 세포는 이미 배아의 주변에 다중 핵STB로 분화하기 시작했다(도 2B,왼쪽 패널, 점선). 이러한 STB시트와 같은 외관을 가지고 인간...

여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

많은 임신은 7 개 또는 8 후 수정 의 주위에 인간 적인 태아 발달에서 일찌기 실패합니다. 이 프로토콜은 이 신비한 이식 기간 동안 시험관에서 인간 개념가를 성장시킬 수 있는 기회를 연구원에게 제공합니다. 이것은 우리가 인간 이식및 초기 태반 대형의 성공을 뒷받침하는 기계장치를 이해할 수 있게 합니다.생체 외에서 peri 이식 단계를 성장하기 위해 확장 된 배양 시스템을 사용하는 것은 아마도 이식 및 초기 트로피후블라스트 분화를 연구하기 위해 본격적인 재료를 얻을 수있는 유일한 방법입니다. 이 간단한 기술은 인간의 초기 개발에 대한 많은 근본적인 질문에 대답 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜의 사용으로 수행 된 연구는 주로 초기 임신 손실, 재발 이식 실패 및 태반 병리의 이해에 기여할 것입니다.절차를 시연하는 것은 실험실에서 박사 과정 학생인 Deirdre Logsdon이 될 것입니다. 배아 온난화 하루 전에 멸균 라미나르 플로우 후드로 미디어 및 복구 플레이트를 준비합니다. BM 500 마이크로리터로 2개의 센터 잘 장기 배양 세척 접시를 10%SPS로 채운 다음 BM을 배아 배양 등급 오일 500마이크로리터로 커버합니다.16mm 조직 배양 접시에서, 배아 배양 오일의 8 밀리리터를 층과 바닥에 10%SPS와 BM의 20 마이크로 리터 방울을 앵커. 37섭씨, 이산화탄소 6%, 산소 5%를 4시간 이상 인큐베이터에 보관합니다. Aliquot 는 IVC 1의 약 4 밀리리터를 5 밀리리터 스냅 캡 튜브에 넣고 오일 오버레이 없이 IVC 1의 500 마이크로리터로 한 개의 세척 접시를 준비합니다.인큐베이터의 접시와 튜브를 적어도 4시간 동안 평형화합니다. PBS의 인간 혈청에서 밀리리터당 30 마이크로그램으로 섬유넥틴을 희석시킵니다. 우물을 만지지 않도록 주의하는 8 개의 잘 챔버 커버 슬립 패키지를 열고 각 우물에 섬유 네틴의 250 마이크로 리터를 부드럽게 피펫하십시오.커버슬립의 뚜껑을 교체하고 섭씨 4도에서 20~24시간 동안 배양합니다. 배아 온난화의 아침에 확장 된 배양 판을 준비합니다. 챔버 커버 슬립을 fibronectin으로 검색하고 라미나르 플로우 후드에 놓습니다.그런 다음 1 밀리리터 파이펫으로 섬유네틴 혼합물을 제거하고 폐기하십시오. 피펫 300 마이크로리터의 EVC 1을 각 우물에 넣고 표지 슬립을 인큐베이터에 넣고 조나 펠루치다를 제거할 때까지 인큐베이터에 넣습니다. D5 인간 배아의 온난화와 회복 후, 재확장을 위해 평가하고 각 배아의 사진을 찍습니다.각 배아를 5%FCS로 MOPS 버퍼처리 매체의 500마이크로리터로 이동합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 산성 Tyrode의 용액으로 처리합니다. 용해 구역으로 배아를 300 마이크로리터로 즉시 이동하여 티로데의 용액을 담금질합니다.그런 다음 배아 배양 등급 오일하에서 10%SPS로 평형 BM을 함유하는 중앙 웰 장기 조직 접시로 배아를 이동한다. 그런 다음 배아를 20 마이크로리터 회복 드롭으로 되돌려 놓습니다. 개별적으로 계형IVC 1 매체를 사용하여 배아를 세척 접시로 옮은 다음 각 배아를 챔버 커버슬립의 우물로 조심스럽게 이동하여 배아 식별을 추적합니다.챔버 커버슬립을 섭씨 37도, 이산화탄소 6%, 대기산소로 설정된 인큐베이터로 2일 간 반납한다. 2일째되는 날, 현미경으로 배아의 부착을 주의 깊게 살펴보고 미디어를 교환한다. 접시를 부드럽게 눌러 접시에 부착되는 배아를 알 수 있습니다.미디어를 변경하려면 뚜껑을 제거하고 IVC 1의 150 마이크로리터를 조심스럽게 흡인하여 부착된 배아를 방해하지 않도록 주의하십시오. 배아가 아직 접시에 부착되지 않은 경우 IVC 1의 혈청이 부착에 도움이 되기 때문에 미디어를 교환하지 마십시오. 평형 확장 배양 매체의 150 마이크로리터를 천천히 피펫, IVC 2는 각 우물에 넣고 커버슬립의 뚜껑을 교체합니다.조심스럽게 챔버 커버 슬립을 인큐베이터로 돌려보냈다. 배아가 고정 또는 단세포 소화를 위한 준비가 될 때까지 매일 미디어 교환 및 첨부 검사를 반복합니다. 추가 분석을 위해 소비된 미디어의 수집이 필요한 경우, 스냅제거된 IVC 1의 150마이크로리터를 멸균 저구속 0.5 밀리리터 튜브로 동결한다.PBS의 200 마이크로 리터로 각 배아를 한 번 씻은 다음 각 우물에 트립신 용액 200 마이크로 리터를 추가하십시오. 챔버 커버슬립을 인큐베이터에 5분간 반납합니다. 작은 파이펫이나 잘게 당겨진 입 파이펫을 사용하여 개별 MTB를 수령한 다음 더 큰 파이펫을 사용하여 배아를 위아래로 부드럽게 해리시합니다.배아가 트립신에서 총 10분 동안 배양될 때까지 더 작은 직경의 파이펫 팁을 사용하여 배아를 부드럽게 그리고 반복적으로 흡입합니다. 단일 세포 선택을 수행하기 위해, 접합 된 세포를 통해 320 마이크로 리터 세척 방울및 배아 배양 오일에서 0.1 %의 PVP를 이동하여 세포를 잃지 않도록주의하십시오. 세포를 세척한 후 잘게 당겨진 유리 파이펫을 사용하여 하나의 셀을 선택합니다.PBS및 PVP의 최소 부피와 멸균 0.2 밀리리터 낮은 바인드 튜브에 단일 셀을 조심스럽게 피펫. 액체 질소에 무료 단일 세포를 스냅 하 고 추가 사용을 위해 부정적인 80 섭씨에 저장. 건강한 배아는 확장된 문화의 과정을 통해 지속적인 증식을 보였고, 비정상적인 배아는 바깥쪽 가장자리에서 후퇴하고 분해되기 시작했습니다.8일째 에 수정, 배아에 있는 대부분의 세포는 사이토트로포블라스트 또는 CTBs, 그 trophoblast 마커 GATA-3에 대 한 긍정적인. 배아의 주변에서 CTB는 이미 외모와 같은 시트를 가지고 인간 CGB에 대한 양성 얼룩이있는 다중 핵 싱크티오트로포블라스트로 분화했습니다. 10일째, CGB 양성 철새 대열 세포의 형성은 최대였고, 이는 현재 HCG 생산의 급증에 의해 확인되었다.HLA-G에 대 한 긍정적인 염색 철새 trophoblasts, 또한 등장 하 고 배아 몸에서 멀리 이동 하기 시작. 12일째까지 STB 분화는 감소하고 MTB 생산이 더욱 두드러졌으며, 10일째에 호르몬 생산에서 세포 이동으로 12일째에 중점을 두는 것을 시사했습니다. 이러한 변화는 페리 이식 기간의 시간 경과 비디오에서 관찰될 수 있다.비디오는 blastocele의 붕괴, STB의 형성 및 MTB의 최종 분화 및 마이그레이션을 보여줍니다. 이 절차를 완료할 때 명심해야 할 가장 중요한 것은 온도, 진동 및 pH의 변화에 민감한 살아있는 배아와 함께 작업하고 있다는 것입니다. 배아가 배아 건강 상태를 유지하는 데 중요한 배식기에서 나오는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.이 절차를 완료한 후, 조사자들은 단세포 RNA 염기서열 분석 및 전체 게놈 편심염 시퀀싱과 같은 하류 단일 세포 오믹스 분석법에 대해 격리된 단일 세포를 사용하여 인간 이식 및 초기 태반 형성 중 후생유전학 및 전사적 변화를 더 잘 이해할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 blastocysts의 고립과 blastocysts에서 trophoblast의 줄기 세포의 유도를 보여줍니다. 우리는 또한 줄기 세포 속성의 유지 보수뿐만 아니라 문화에 분화의 유도에 대한 조건을 설명합니다.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

이 프로토콜에서는, 우리는 Percoll 기울기를 사용하여 trophoblast 세포의 분리에 이어 임신 d10.5에 마우스에서 placentae의 절개를 설명합니다. 우리는 matrigel의 침공 분석에서 분리 된 세포의 사용을 보여줍니다.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

영양막 거대 세포(TGC)는 태반에서 건강한 임신을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 우리는 착상 후 배아의 저온 유지 절편에서 초기 형광 제자리 교잡 또는 배아 7일차 외부 태반 원뿔의 단기 배양에 의해 TGC에서 유전자의 전사 상태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em&gt; 생체</em&gt; 영양막 세포 거대 세포 또는<em&gt; 체외</em&gt; Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

이 프로토콜은 인간 기저 배반의 소추모 및 융모막에서 1차 HLA-G+ 외 영양층(EVT)의 정제, 특성 분석 및 배양을 가능하게 합니다. 1차 EVT 배양은 96시간 동안 생존 가능성을 유지하여, 샘플이 일치한 모체 면역세포와의 공동 배양과 이들의 상호작용에 대한 유동 세포 및 분자 분석을 가능하게 합니다.

표현형 및 기능 분석을 위한 HLA-G+ 외 영양층 정제 인간 임기 태반 조직에서

배우세요 체외에서 유리화된 인간 배아를 해동하고 배양하여 착상기 트로포블라스트 세포를 단일 세포로 분리 수집하는 방법을. 이 기술은 초기 임신 손실과 착상 실패의 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집

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