Name: 코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 MSCs가 코르티 기관으로 이동하는 실시간 이미징 방법을 공초점 현미경을 사용하여. 이 기법은 줄기세포 호밍 역학을 연구하고 세포 이동 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 작품은 한국국립연구재단(NRF)과 한림대학교 연구기금(NRF)의 연구보조금(NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66)에 의해 지원되었다.

ICR 마우스와 관련된 모든 연구 프로토콜은 원주의 의과대학의 연세대학교 기관동물관리및이용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었다. 이 프로토콜에서 임신 한 ICR 마우스는 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12/12 h 빛 / 어두운 주기에 보관되었습니다.
1. 달팽이관 해부
<ol><li>30분 동안 자외선을 켜서 라미나르 유동 조직 배양 후드를 살균하고, 사용하기 전에 70% 에탄올로 모든 표면을 분무한다. 표면이 건조하도록 합니다.</li>
	<li>해부 악기를 70% 에탄올에 10분 동안 놓고 사용하기 전에 건조하십시오.</li>
	<li>수술 블레이드를 사용하여 산후 3-4 일 된 마우스(그림 2A)를참수하십시오.</li>
	<li>라미나르 플로우 후드의 스테레오현미경 아래에 두개골을 놓고 70% 에탄올에 티슈를 담그세요.</li>
	<li>조직을 빠르게 흡수하여 조직 해부 용액(1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액, 1mM HEPES)을 사용하여 에탄올을 제거합니다.</li>
	<li>수술 블레이드(그림 2B,C)로두개골의 중심선을 잘라.</li>
	<li>피부를 앞쪽으로 당기고 귀의 외부 청각 운하를 절단하여 두개골을 노출시다(도2D).</li>
	<li>전방에서 눈선을 가로질러 두개골의 후방 부분으로 잘라냅니다(그림2E).</li>
	<li>두개골을 열고 무딘 집게로 전뇌, 소뇌 및 뇌간을 제거합니다(그림 2F,G).</li>
	<li>마이크로 포셉을 사용하여 달팽이를 측두골(도2H)에서분리한다.</li>
	<li>달팽이관을 조직 해부 용액을 함유한 페트리 접시에 옮기다.</li>
	<li>모든 달팽이관 오틱 캡슐을 신중하게 해부하여 내부 달팽이관 연조직(도2I,J)만남깁니다.</li>
	<li>다른 한 쌍의 집게로 달팽이관과 달팽이관의 골수를 잡고 두 조직(도 2K)을천천히 분리합니다.</li>
	<li>그들을 부드럽게 벗겨내어 황반 혈관 및 지각 막을 제거하십시오(그림2L,M).</li>
	<li>살균 플라스틱 커버슬립을 새로운 조직 해부 용액에 넣고 코르티 의 장기를 직경 9mm의 커버슬립에 놓고 바실라 멤브레인이 아래쪽으로 향하게 합니다(그림2N-P).</li>
	<li>리스너의 막과 나머지 모골 조직을 집게로 커버슬립에 눌러 조직을 고정시킵니다(도2N-P).</li>
	<li>임베디드 조직으로 커버슬립을 직경 35mm의 공초점 접시의 중심으로 옮기.</li>
	<li>유리 클론 실린더를 접시중앙에 달팽이관이 배치하고, 100μL의 축축배 배지(DMEM/F12, 10% 태아소 세럼(FBS), 1% N2 보충제, 암피실린(10 μg/mL))을 접시에 놓는다.</li>
	<li>플레이트 5 × 103 개의 마우스 골수 유래 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그 된 MSC 배양 매체 2 mL (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 보충제, 10 μg/mL 의 암피실린) 외부 유리 실린더(그림2R).<ol>
<li>MSC가 80-90 % 컨캔트 일 때 트립신 에틸렌디아민 테트라아세트산으로 분리하여 통과시하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공초점 접시를 가습된 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 5%CO2 분위기에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>실린더 내부와 바깥쪽에 있는 모든 매체를 흡인한 다음 공초점 접시에서 유리 실린더를 제거합니다.</li>
	<li>공초점 접시에 신선한 배양 배지 2mL를 추가하고 분석 준비가 될 때까지 가습 된 인큐베이터에 조직 문화 접시를 배양하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> 그림 2. 코르티와 MSC의 기관의 마우스 달팽이관 및 공동 문화의 해부. (A)마우스의 참수,(B)및(C)머리의 중간선 처질 해부,(D)및(E)뇌의 관상 해부,(F)및(G)뇌및 측두골의 제거,(H)달팽이벽의 제거,(J)달팽이관벽의 제거, (J) 달팽이관의 분리,(J)달팽이,(J)달팽이의 분리(L)코르티의 오르간으로부터 의 트리아 혈관(SV) 및 나선형 인대(SL)의 분리,(M)지각막 제거,(N-P)플라스틱 커버 슬립에 달팽이관 고정,(Q)공초점 요리에서 커버슬립 및 유리 실린더의 위치, (R) 공초점 요리에서,(R)현미경의 백색 배율 주황색(F, G, P)및 노란색 스케일 바(H,I)= 1mm; 녹색 스케일 바(J-O) = 0.5mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 타임랩스 이미징
<ol><li>여기에 제시 된 실험의 경우 스테이지 탑 인큐베이터 시스템을 갖춘 공초점 현미경 시스템을 사용하십시오.</li>
	<li>공초점 현미경, 형광등 및 컴퓨터를 켭니다.</li>
	<li>공초점 현미경의 단계에 배치 된 스테이지 탑 인큐베이터의 조건을 37 °C 및 5 % CO2 대기로 설정합니다.</li>
	<li>접시 고정 용기에 샘플 접시를 놓고 접시 고정 뚜껑으로 덮고 상단 히터 뚜껑으로 챔버를 닫습니다.</li>
	<li>줌 및 포커스를 조정하여 시야에서 Corti 및 MSC의 장기를 현지화합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어를 엽니다. 찾기 옵션에서 20x 플랜-아포크로마트 목표(숫자 조리개 0.8)와 0.5배 자르기 영역을선택합니다.</li>
	<li>인수에서 스마트 설정을 클릭하고 EGFP를 선택합니다.</li>
	<li>획득하에 채널 탭을 열고 레이저 전원을 0.2%로 설정하고 핀홀을 44 μm로설정하고 마스터 게인을 750V로설정하고 디지털 게인을 1.0으로설정합니다.</li>
	<li>이미징 설정에서 ESID를 클릭하고 ESID 게인을 4로 설정하고 디지털 게인을 7.5로설정합니다.</li>
	<li>타일과 스테이크를 클릭하여 210개의 타일을 생성합니다.</li>
	<li>포커스 전략을 열고 포커스 모드를 선택합니다.</li>
	<li>기간 중, 지속 시간을 24시간으로 설정하고 간격을 10분으로 설정합니다.</li>
	<li>획득하에프레임 크기를 512 x 512픽셀로 설정하고, 속도를 8로, 양방향 방향, 평균을 4배로, 픽셀당 비트는 16으로설정한다.</li>
	<li>실험을 시작하려면 실험을 시작합니다.</li>
</ol>3. 이미지 파일 수정
<ol><li>처리 중, 스티치를클릭하고, 5 %로 최소 오버레이를 설정하고 최대 이동을 10 %로 설정합니다.</li>
	<li>영화 내보내기를클릭하고 압축되지 않은설정하고 속도를 7.5로설정합니다.</li>
</ol>4. 면역 염색
<ol><li>배지를 주의 깊게 흡입하고 인산완충식염(PBS)으로 샘플을 5분 간 세척합니다.</li>
	<li>PBS에서 4% 포르말린으로 샘플을 15분 동안 수정하고 PBS로 샘플을 3회 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.1% 트리톤 X-100으로 샘플을 10분 동안 세척하고 PBS로 3회 5분 간 세척합니다.</li>
	<li>250 μL의 phalloidin-iFluor 647 시약 (PBS에서 1:1000 희석)을 추가하고 셰이커의 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 샘플을 3회 3회 세척하여 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>커버슬립을 유리 슬라이드에 옮기고 2방울의 장착 용액을 추가합니다.</li>
	<li>슬라이드에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다.</li>
	<li>명확한 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 세포가 관찰 될 때까지 어둠 속에서 4 °C에 저장합니다.</li>
	<li>내분/방출(Ex/Em)=650/665 nm에서 적절한 필터를 사용하여 공초점 현미경을 사용하고, EGFP의 경우 Ex/Em=488/507 nm에서 슬라이드를 이미지합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
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<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

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손상된 세포의 재생을 촉진하기 위해 손상된 부위로 MSC를 이식하는 것은 광범위하게 연구되었으며 치료 효과가 분명합니다. MSC의 이식 및 후속 분화는 3-니트로프로피온산(13)에 의해 유도된난청을 가진 쥐의 청력을 회복하는 것으로 보고되었다. Lee et al.은 인간에게 MSC를 적용했지만,14번 청각에서 상당한 개선을 이루지 못했습니다. 최근까지, MSC 이식에 의한 설치류 모델에서 청력을 회복하기 위해 거의 12개의 실험이 수행되었다. 결과는 이질성 때문에 다소 불분명하지만, MSC가 청력을 촉진 할 수 있다는 몇 가지 징후가 있다.
화학요법과 관련된 다양한 성장인자 및 케모신은 이질성 또는 균질성에 관계없이 손상된 부위로 이식된 줄기세포의 이동에관여한다. Chemokines는 조직 항상성, 면역 반응 및 상처 치유를 위한 세포 이동의 주요 조절...

청력 손실은 선천적으로 발생할 수 있으며 노화, 약물 및 소음을 포함한 여러 가지 요인에 의해 점진적으로 발생할 수 있습니다. 청력을 담당하는 모발 세포가 손상되면 손상된 기능을 복원하기가 매우 어렵기 때문에 청력 손실은 종종 치료하기가어렵습니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 4억 6,100만 명이 청력 손실을 입은 것으로 추정되며, 이는 전 세계 인구의 6.1%를 차지합니다. 청력 상실을 가진 사람들 중 93%는 성인이고 7%는 어린이입니다.
청력 손실을 치료하기 위해 여러 가지 접근 법이 시도되었습니다. 특히, MSC를 이용한 재생 접근법은 유망한 치료법으로 부상했습니다. 조직이 손상되면, MSC는 자연적으로 순환 계통으로 방출되고 다양한 분자를 분비하는 상해 부위로 이동하여 재생을 촉진하는 미세 환경을 형성한다2. 따라서, 손상된 세포 기능3, 4, 5의 복원을 향상시키기 위해 강력한 면역 조절, 혈관신생 및 항 세포멸을 유발하는 분자의 장기 및 후속 분비를 표적으로 하는 외부 이식된 MSC의 이동을 통해 손상된 조직을 치료하는 방법을 개발하는 것이 중요하다3,4,5.
MSC가 손상된 조직으로 마이그레이션하는 호밍 프로세스가 극복해야 할 가장 중요한 장애물이 될 수 있습니다. MSC는 테더링 /롤링, 활성화, 체포, 트랜스 마이그레이션 / diapedesis 및 마이그레이션6,7,8의순차적 단계를 갖는 전신 호밍메커니즘을가지고 있습니다. 현재 이러한 단계를 개선할 방법을 파악하기 위한 노력이 진행 중입니다. 유전자 변형, 세포 표면 공학, 체외 프라이밍 및 자기 지도를 포함한 다양한 전략이6,7로테스트되었습니다. 또한 손상된 달팽이관 부위에 MSC를 호밍하여 청각 모발 세포의 보호 및 재생을 촉진하기 위한 여러 시도가 있었습니다. 그러나 생체 내에서 MSC를 추적하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 고도로 전문화된 기술9이필요합니다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 몇 시간 동안 세포의 이주를 촬영한 시간 경과 공초점 현미경검사를 통해 달팽이관내의 MSC의 호밍을 관찰하는 방법이 개발되었다(도1). 그것은 20세기 초에 개발 되었으며 최근 특정 세포의 마이그레이션을 공부 하기 위한 강력한 도구가 되고있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> 도 1: 그래픽 추상화. (A)코르티의 해부 기관이 집게를 사용하여 플라스틱 커버슬립에 부착된 후, 커버슬립은 35mm 유리 바닥의 공초점 미세한 접시에 배치되고(B)유리 실린더가 배치된다. (C)유리 실린더 내부를 중간으로 채운 후,(D)GFP 라벨이 부착된 MSC를 매체로 기르기 바깥에 신중하게 첨가한다. (E)하룻밤 동안 인큐베이션 후유리실린더가 제거되고, 이미지는 공초점 현미경으로 촬영된다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; MSC = 중간 엽 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS 완충액</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% 포르말린</td><td>T& I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 접시</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr>DAPI 시그마<td>가 있는 플루오쉴드</td><td>&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 시약</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 탑 인큐베이터</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>균주 C57BL/6 마우스 메시텐피 줄기세포와 GFP</td><td>시아겐</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

세포 재생 및 치료에 대한 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 효과를 연구하기 위해이 방법은 달팽이관 상피와 공동 배양 후 MSC 마이그레이션 및 형태 학적 변화를 추적합니다. 코르티의 장기는 해부 중에 생성된 Reissner 막의 일부를 눌러 플라스틱 커버슬립에 고정되었습니다. 실린더를 제거할 때 유리 실린더에 의해 수감된 MSC가 달팽이관 상피로 이동했습니다. 그들의 지배적인 국소화는 코르티의 기관의 modiolus에서 관찰되었다, 신경 섬유의 것과 유사한 방향으로 정렬. 그러나 일부 MsMC는 림푸스 지역에 국한되어 수평으로 길쭉한 모양을 보였습니다. 또한, 모발 세포 영역으로의 이동이 증가되었고, MSC의 형태는 가나마이신 치료 후 다양한 형태로 변경되었다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 달팽이관 상피와 MSC의 공존이 세포 이식을 통해 치료의 발달과 다양한 조건과 요인을 검사 할 수있는 세포 재생연구에 유용 할 것임을 나타냅니다.

3차원 모드에서 MSC의 체외 이동은 트랜스웰 시스템 또는 전통적인 상처 치유 방법에 의해 2차원(2D)모드(11)에서마이그레이션을 관찰하도록 평가되었다. 코르티의 기관은 보처 세포, 클라우디우스 세포, 디터 세포, 기둥 세포, 헨센의 세포, 외부 헤어 셀, 내부 모발 세포, 신경 섬유, 바실라 막 및 망상 라미나12와같은 다양한 세포로 구성된 복잡한 구조이다. 이러한 복잡한 세포로 구성된 조직으로 MSP를 이식할 때, 세포를 모집하고 안정화하는 위치를 확인하는 기술의 사용은 MSC를 사용하여 세포 치료 및 재생메커니즘을 이해하는 데 중추적인 역할을 한다. 또한, 손상의 유무에 따라 MSC가 국소화되는 방식을 결정하기 위해, 상처 치유 방법과 같은 2D 방법은 세포가 무작위로 한 방향으로 아래로 이동하는 트랜스웰 시스템보다 더 적합하다.
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본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

MSC의 이동을 조사하기 위한 기존 in vitro 방법에는 Transwell 또는 상처 치유 프로토콜이 포함됩니다. 여기에 설명된 방법은 MSC의 외식으로의 마이그레이션을 실시간으로 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 외식 배양 측면에서 다른 방법에 비해 이 방법의 장점은 시간과 비용을 절감하고 실험 단계를 단순화한다는 것입니다.이 기법은 줄기세포가 표적으로의 호밍을 실시간으로 관찰하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 원점 복귀 효율이 최적화된 모델을 개발할 수 있습니다. 구조막의 제거는 경험이 없는 연구자에게는 어려운 일입니다. 개발 단계에 따라 구조막을 제거할 적절한 시기를 이해하는 것이 이 프로토콜의 성공을 위해 중요합니다.시연은 제 연구실의 연구원 교수인 박정은 박사와 이 Dr.Su 훈 교수가 시연할 예정입니다. 약 30분 동안 자외선을 켜서 층류 조직 배양 후드를 살균하는 것으로 시작합니다. 사용하기 전에 모든 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 건조시키십시오.해부 기구를 70% 에탄올에 10분 동안 넣은 다음 건조시킨 후 사용하십시오. 생후 3-4일 된 쥐의 목을 베인 후 앞머리를 70% 에탄올에 담그고 층류 후드의 직렬 현미경 아래에 놓습니다. 조직 해부 용액에 조직을 빠르게 담그면 에탄올이 제거됩니다.수술용 칼날로 두개골의 중심선을 절단한 다음 피부를 앞쪽으로 당기고 귀의 외이도를 절단하여 두개골을 노출시킵니다. 눈선을 가로질러 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 자른 다음 두개골을 열고 뭉툭한 집게로 전뇌, 소뇌 및 뇌간을 제거합니다. 마이크로핀셋을 사용하여 달팽이관을 측두골에서 분리하고 조직 해부 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.달팽이관 이낭을 모두 조심스럽게 절개하고 내부 달팽이관 연조직만 남깁니다. 집게로 달팽이관의 모디올러스를 잡고 다른 집게로 달팽이관을 잡은 다음 두 조직을 천천히 분리합니다. 선조체 혈관과 구조막을 부드럽게 벗겨내어 제거합니다.멸균된 플라스틱 커버슬립을 새 조직 해부 용액에 넣은 다음 기저막이 아래를 향하도록 커버슬립에 코르티 기관을 놓습니다. 집게로 Reissner의 막과 나머지 modiolus 조직을 커버슬립에 눌러 조직을 고정시킵니다. 티슈가 박힌 커버슬립을 35mm 컨포칼 접시의 중앙으로 옮깁니다.인공와우가 접시 중앙에 위치하도록 유리 복제 실린더를 접시에 놓고 100마이크로리터의 외식 배양 배지를 실린더에 추가합니다. 골수 유래 GFP 태그가 붙은 중간엽 줄기세포 5개, 000개를 유리 실린더 외부의 배양 배지 2ml에 넣고 접시를 인큐베이터에 넣습니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 세포를 배양한 후 실린더 내부와 외부의 모든 매체를 흡인하고 컨포칼 접시에서 유리 실린더를 제거합니다.접시에 신선한 배양 배지 2ml를 추가합니다. 분석할 준비가 될 때까지 가습된 인큐베이터에 넣습니다. 스테이지 상단 인큐베이터와 함께 컨포칼 현미경 시스템을 사용하십시오.컨포칼 현미경, 형광등 및 컴퓨터를 켭니다. 스테이지 상단 인큐베이터의 조건을 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 대기로 설정합니다. sample 접시를 접시 고정 용기에 놓고 접시 고정 뚜껑으로 덮고 상단 히터 뚜껑으로 챔버를 닫습니다.확대/축소 및 초점을 조정하여 시야에서 Corti 및 MSC의 기관을 지역화합니다. 이미지 처리 소프트웨어를 엽니다. 찾기 옵션에서 20X plan-apochromat objective 또는 numerical aperture 0.8 및 0.5X crop area를 선택합니다.acquisition(획득)에서 smart setup(스마트 설정)을 클릭하고 EGFP를 선택합니다. 획득 아래의 채널 탭을 열고 레이저 출력을 0.2%로, 핀홀을 44마이크로미터로, 마스터 게인을 750볼트로, 디지털 게인을 1.0으로 설정합니다. 이미징 설정에서 ESID를 클릭하고 ESID 게인을 4로, 디지털 게인을 7.5로 설정합니다.타일과 말뚝을 클릭하면 210개의 타일이 생성됩니다. 포커스 전략을 열고 포커스 모드를 선택합니다. 시계열에서 기간을 24시간으로 설정하고 간격을 10분으로 설정합니다.획득에서 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로, 스캔 속도를 8로, 방향을 양방향으로, 평균을 4X로, 픽셀당 비트 수를 16으로 설정합니다. 실험 시작을 클릭하여 실험을 시작합니다. 중간엽 줄기세포(MSC)의 2차원 경로는 MSC와 코르티 기관 사이의 장벽으로 유리 실린더를 사용하여 상처 치유 방법으로 추적되었습니다.코르티 기관이 배양되었을 때, 섬유아세포는 가장 바깥쪽 층의 바깥쪽 유모 세포에서 바깥쪽으로 매우 빠르게 성장했습니다. 대부분의 GFP 표지 MSC는 빠르게 성장하는 섬유아세포에 의해 밀려났습니다. 그럼에도 불구하고, 일부는 섬유아세포층을 뚫고 코르티 기관으로 성공적으로 이동했습니다.72시간의 배양 결과는 MSC가 코르티 기관으로 이동했으며 주로 모디올러스와 모디올러스에서 분리된 달팽이관 신경 섬유가 있는 영역에 국한되어 있음을 보여주었습니다. MSC의 형태는 신경 섬유와 유사한 방사형 모양으로 변경되었습니다. 세포는 유모 세포 영역이 아닌 변두리 선을 따라 선형 모양으로 변형되었습니다.MSC는 다양한 세포층과 물리적 장벽을 관통하여 신경 섬유 수집 영역에서 이동하고 성장할 수 있었습니다. 카나마이신으로 16시간 동안 시술하여 유모 세포의 손상을 유발하고 카나마이신을 제거한 후 72시간 동안 세포를 추가로 배양한 경우, MSC는 모디올러스뿐만 아니라 바깥쪽 유모 세포에도 국한되었습니다. 조직을 고정시키는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계이며 코르티의 기관이 부착되어 있습니다.쉽게 떨어지지 않습니다. 이것은 사소하지만 성공적인 외식 배양을 위한 유용한 팁입니다. 이 방법은 MSC에서 분비되는 엑소좀의 효능을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

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연구

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Medicine

의학

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 MSCs가 코르티 기관으로 이동하는 실시간 이미징 방법을 공초점 현미경을 사용하여. 이 기법은 줄기세포 호밍 역학을 연구하고 세포 이동 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

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