코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

MSC의 이동을 조사하기 위한 기존 in vitro 방법에는 Transwell 또는 상처 치유 프로토콜이 포함됩니다. 여기에 설명된 방법은 MSC의 외식으로의 마이그레이션을 실시간으로 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 외식 배양 측면에서 다른 방법에 비해 이 방법의 장점은 시간과 비용을 절감하고 실험 단계를 단순화한다는 것입니다.

이 기법은 줄기세포가 표적으로의 호밍을 실시간으로 관찰하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 원점 복귀 효율이 최적화된 모델을 개발할 수 있습니다. 구조막의 제거는 경험이 없는 연구자에게는 어려운 일입니다. 개발 단계에 따라 구조막을 제거할 적절한 시기를 이해하는 것이 이 프로토콜의 성공을 위해 중요합니다.

연은 제 연구실의 연구원 교수인 박정은 박사와 이 Dr.Su 훈 교수가 시연할 예정입니다. 약 30분 동안 자외선을 켜서 층류 조직 배양 후드를 살균하는 것으로 시작합니다. 사용하기 전에 모든 표면에 70% 에탄올을 뿌리고 건조시키십시오.

해부 기구를 70% 에탄올에 10분 동안 넣은 다음 건조시킨 후 사용하십시오. 생후 3-4일 된 쥐의 목을 베인 후 앞머리를 70% 에탄올에 담그고 층류 후드의 직렬 현미경 아래에 놓습니다. 조직 해부 용액에 조직을 빠르게 담그면 에탄올이 제거됩니다.

수술용 칼날로 두개골의 중심선을 절단한 다음 피부를 앞쪽으로 당기고 귀의 외이도를 절단하여 두개골을 노출시킵니다. 눈선을 가로질러 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 자른 다음 두개골을 열고 뭉툭한 집게로 전뇌, 소뇌 및 뇌간을 제거합니다. 마이크로핀셋을 사용하여 달팽이관을 측두골에서 분리하고 조직 해부 용액이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.

달팽이관 이낭을 모두 조심스럽게 절개하고 내부 달팽이관 연조직만 남깁니다. 집게로 달팽이관의 모디올러스를 잡고 다른 집게로 달팽이관을 잡은 다음 두 조직을 천천히 분리합니다. 선조체 혈관과 구조막을 부드럽게 벗겨내어 제거합니다.

멸균된 플라스틱 커버슬립을 새 조직 해부 용액에 넣은 다음 기저막이 아래를 향하도록 커버슬립에 코르티 기관을 놓습니다. 집게로 Reissner의 막과 나머지 modiolus 조직을 커버슬립에 눌러 조직을 고정시킵니다. 티슈가 박힌 커버슬립을 35mm 컨포칼 접시의 중앙으로 옮깁니다.

인공와우가 접시 중앙에 위치하도록 유리 복제 실린더를 접시에 놓고 100마이크로리터의 외식 배양 배지를 실린더에 추가합니다. 골수 유래 GFP 태그가 붙은 중간엽 줄기세포 5개, 000개를 유리 실린더 외부의 배양 배지 2ml에 넣고 접시를 인큐베이터에 넣습니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 세포를 배양한 후 실린더 내부와 외부의 모든 매체를 흡인하고 컨포칼 접시에서 유리 실린더를 제거합니다.

접시에 신선한 배양 배지 2ml를 추가합니다. 분석할 준비가 될 때까지 가습된 인큐베이터에 넣습니다. 스테이지 상단 인큐베이터와 함께 컨포칼 현미경 시스템을 사용하십시오.

컨포칼 현미경, 형광등 및 컴퓨터를 켭니다. 스테이지 상단 인큐베이터의 조건을 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 대기로 설정합니다. sample 접시를 접시 고정 용기에 놓고 접시 고정 뚜껑으로 덮고 상단 히터 뚜껑으로 챔버를 닫습니다.

확대/축소 및 초점을 조정하여 시야에서 Corti 및 MSC의 기관을 지역화합니다. 이미지 처리 소프트웨어를 엽니다. 찾기 옵션에서 20X plan-apochromat objective 또는 numerical aperture 0.8 및 0.5X crop area를 선택합니다.

acquisition(획득)에서 smart setup(스마트 설정)을 클릭하고 EGFP를 선택합니다. 획득 아래의 채널 탭을 열고 레이저 출력을 0.2%로, 핀홀을 44마이크로미터로, 마스터 게인을 750볼트로, 디지털 게인을 1.0으로 설정합니다. 이미징 설정에서 ESID를 클릭하고 ESID 게인을 4로, 디지털 게인을 7.5로 설정합니다.

타일과 말뚝을 클릭하면 210개의 타일이 생성됩니다. 포커스 전략을 열고 포커스 모드를 선택합니다. 시계열에서 기간을 24시간으로 설정하고 간격을 10분으로 설정합니다.

획득에서 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로, 스캔 속도를 8로, 방향을 양방향으로, 평균을 4X로, 픽셀당 비트 수를 16으로 설정합니다. 실험 시작을 클릭하여 실험을 시작합니다. 중간엽 줄기세포(MSC)의 2차원 경로는 MSC와 코르티 기관 사이의 장벽으로 유리 실린더를 사용하여 상처 치유 방법으로 추적되었습니다.

코르티 기관이 배양되었을 때, 섬유아세포는 가장 바깥쪽 층의 바깥쪽 유모 세포에서 바깥쪽으로 매우 빠르게 성장했습니다. 대부분의 GFP 표지 MSC는 빠르게 성장하는 섬유아세포에 의해 밀려났습니다. 그럼에도 불구하고, 일부는 섬유아세포층을 뚫고 코르티 기관으로 성공적으로 이동했습니다.

72시간의 배양 결과는 MSC가 코르티 기관으로 이동했으며 주로 모디올러스와 모디올러스에서 분리된 달팽이관 신경 섬유가 있는 영역에 국한되어 있음을 보여주었습니다. MSC의 형태는 신경 섬유와 유사한 방사형 모양으로 변경되었습니다. 세포는 유모 세포 영역이 아닌 변두리 선을 따라 선형 모양으로 변형되었습니다.

MSC는 다양한 세포층과 물리적 장벽을 관통하여 신경 섬유 수집 영역에서 이동하고 성장할 수 있었습니다. 카나마이신으로 16시간 동안 시술하여 유모 세포의 손상을 유발하고 카나마이신을 제거한 후 72시간 동안 세포를 추가로 배양한 경우, MSC는 모디올러스뿐만 아니라 바깥쪽 유모 세포에도 국한되었습니다. 조직을 고정시키는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계이며 코르티의 기관이 부착되어 있습니다.

쉽게 떨어지지 않습니다. 이것은 사소하지만 성공적인 외식 배양을 위한 유용한 팁입니다. 이 방법은 MSC에서 분비되는 엑소좀의 효능을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.