Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

유전학 연구는 인간 게놈 염기서열의 공개로 큰 이익을 얻었습니다. 파이로 염기서열분석(Pyro sequencing)은 유전적 변이뿐만 아니라 RNA 대립형질 불균형, DNA, 메틸화 상태 및 유전자 복제 수를 분석할 수 있는 고유한 시스템입니다. 이 비디오에서는 유전자 분석을 위한 기본 파이로 염기서열분석 반응을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 내과 캠퍼스의 찰스 에비 박사와 브라이언 게이지 박사의 실험실에서 근무하는 크리스티 킹입니다. 오늘은 파이로 시퀀싱 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차는 SNP를 분석하는 데 사용되는 가장 철저하면서도 간단한 방법 중 하나이기 때문에 유용합니다.

파이로 염기서열분석은 합성에 의한 염기서열분석을 기반으로 하며, 뉴클레오타이드가 열린 3개의 프라임 DNA 가닥에 통합될 때마다 피로인산염의 방출을 이용합니다. 플레이트가 로드되면 소프트웨어에서 제공하는 서열에 따라 뉴클레오티드가 통합됩니다.일단 방출되면 피로인산염은 TP의 방출을 초래하는 반응에 사용되며, 이는 루시퍼라아제가 루시퍼를 옥시 루시퍼로 변환하여 빛을 방출하는 데 사용됩니다. 허용된 빛은 CCD 카메라에 의해 수집되어 파이로라고도 하는 피크로 기록됩니다.

DNA 가닥에 통합되지 않은 모든 뉴클레오티드는 배경 소음을 방지하기 위해 AP pyra에 의해 분해됩니다. 이 절차에는 다음 단계가 포함됩니다. 분석 설계, 품질 관리를 위한 PCR 겔 전기영동 및 파이로 염기서열분석.

이제 파이로 시퀀싱을 시작하겠습니다. 파이로 염기서열분석을 수행하려면 먼저 PCR 산물을 준비해야 합니다. 파이로 염기서열분석을 위한 PCR은 모든 프라이머가 약 50사이클까지 사용되도록 하기 위해 대부분의 PCR보다 더 많은 사이클이 필요합니다.

파이로 염기서열분석(Pyro sequencing)은 또한 PCR 프라이머 중 하나가 비오틴화되어야 합니다. 마지막으로, 내부 프라이머도 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 오염이 존재하지 않도록 하기 위해 파이로 염기서열분석을 통해 제공되는 소프트웨어를 사용하여 효율적인 분석 설계를 수행할 수 있습니다.

그리고 PCR 산물이 존재하는지 확인하려면 음성 대조군뿐만 아니라 몇 가지 샘플에 대해 겔을 실행해야 합니다. 파이로 염기서열분석 플레이트를 만들려면 12마이크로리터의 파이로 염기서열분석 프라이머 믹스를 96웰 파이로 염기서열분석 플레이트에 추가합니다. 이를 위해서는 43.2마이크로리터의 내부 프라이머와 1396.8마이크로리터의 무릎 꿇은 버퍼가 파이로 시퀀싱 플레이트를 접착 필름으로 덮어야 합니다.

설정이 96 웰 PCR 제품의 각 웰에 50 분 이상 걸리는 경우 240 마이크로 리터 스트렙타비딘 코팅 혈청 속도를 포함하는 70 마이크로 리터의 SRO 속도 혼합물을 추가합니다. 4, 560 마이크로 리터의 바인딩 버퍼는 트리스 염화나트륨, EDTA 및 트윈 20 및 3, 600 마이크로 리터의 물로 만들어지고 뚜껑을 단단히 교체하십시오. 비드 혼합물이 포함된 96웰 PCR 제품 플레이트를 플레이트 셰이커에 넣고 실온에서 5분 동안 가열합니다.

우물 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 뚜껑이 고정되어 있는지 확인하십시오. 이 단계를 통해 연쇄상구균 ENC를 무릎 꿇고 PCR 프라이머에 있는 비오틴 태그에 코팅된 스페로스 비드를 철저히 수행할 수 있습니다. 플레이트를 준비하기 위한 워크스테이션을 설정합니다.

여기에는 시약 쓰루, PCR 산물 및 비드 혼합 트레이, 파이로 염기서열분석 프라이머 트레이가 포함됩니다. PCR 산물과 비드 믹스 플레이트, 파이로 염기서열분석 프라이머 트레이가 네거티브가 동일한 방향에 있도록 적절하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 옮기기 전에amples, 깨끗한 물에서 꺼져 있는 진공 도구를 흔들어 그 위에 있을 수 있는 구슬이나 부스러기를 제거하십시오.

남은 물을 버리고 물통을 다시 채운 다음 진공 청소기를 켭니다. 물이 모두 제거될 때까지(약 30초) 진공 도구를 물통에 그대로 두십시오. 진공 도구의 필터 팁을 PCR 비드 믹스 플레이트의 웰에 놓고 플레이트에서 모든 액체가 제거될 때까지 그대로 두십시오.

표면 장력을 방지하기 위해 부드러운 흔들림을 사용할 수 있습니다. 액체가 튜브를 통해 흐르기 시작할 때 70% 에탄올 물통에 진공을 놓습니다. 필터 팁이 5초 동안 에탄올을 빨아들이도록 합니다.

DNA를 단일 가닥 PCR로 변성시키는 0.2몰 수산화나트륨과 세척 완충액에 대해 반복합니다. PCR 산물을 정화하고 중화합니다. 진공 도구에서 진공 호스를 분리하고 진공 도구를 무릎 꿇은 버퍼 믹스에 파이로 시퀀싱 프라이머가 들어 있는 파이로 시퀀싱 플레이트에 넣습니다.

진공 호스가 여전히 연결되어 있으면 파이로 시퀀싱 플레이트에 넣으면 프라이머 혼합물이 빨려 들어갑니다. PCR 제품을 잃게 되는 팁. 파이로 염기서열분석 플레이트의 웰에 있는 진공 청소기의 끝을 부드럽게 흔들거나 흔들어 PCR 산물을 분산시킵니다.

흔들림이나 흔들림이 완료되면 파이로 시퀀싱 플레이트에서 진공 도구를 제거하고 진공 도구를 호스에 다시 연결하고 도구를 깨끗한 물에 넣어 다음 플레이트를 위해 청소합니다. 파이로 시퀀싱 플레이트를 섭씨 80도에서 2분 동안 열 블록에 놓습니다. 2분 후 열 블록에서 플레이트를 제거하고 시원한 표면에 놓습니다.

일단 냉각되고 접착 필름은 플레이트를 덮는 데 사용할 수 있습니다., 플레이트가 증발을 방지하기 위해 15분 이내에 실행되지 않는 한. 이제 파이로 염기서열분석을 시작할 때입니다. 파이로 염기서열분석의 첫 번째 단계는 분석 세부 정보를 컴퓨터에 입력하는 것입니다.

심플렉스 항목에서 새 항목을 선택하고 분석 설계 소프트웨어에서 제공하는 ID 이름 및 분석할 염기서열을 포함한 분석 정보를 입력하며, 이는 SNP와 대조군 염기 주변의 염기서열을 제공하는 품질 관리 선택 분배 순서를 허용합니다. 마지막으로 히스토그램을 선택하여 파이그램이 어떻게 생겼는지에 대한 시각적 정보를 제공합니다. 이제 캡처 실행을 시작할 차례입니다.

snip runs 및 General 탭에서 실행 이름을 입력하고 실행에 대한 계측기 파라미터를 선택합니다. 설정 탭에서 분석 항목을 선택하고 플레이트를 클릭하여 드래그합니다. 선택한 분석을 플레이트에 입력하기 위해서는 분석을 위해 서로 다른 웰을 비활성화할 수 있는 전체 플레이트를 사용할 필요가 없으며 동일한 플레이트에서 여러 다른 분석을 실행할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

보기 탭을 클릭한 다음 을 선택합니다. 달리다. 이 페이지에는 실행에 필요한 적절한 부피의 뉴클레오티드, 효소 및 기질이 나열되어 있습니다. 사용하기 전에 뉴클레오티드 또는 모세혈관과 시약 팁을 모두 세척하십시오.

팁에 물을 채우고 팁 상단에 압력을 가하여 팁이 막혔는지 확인합니다. 팁 바닥에서 물이 분출되지 않으면 물을 비웠다가 여러 번 다시 채워 물을 강제로 통과시키십시오. 또는 팁이 막힌 상태로 유지되는 경우 팁을 초음파 처리 할 수 있습니다.

버리고 새로운 팁을 얻으십시오. 효소와 기질은 사용하기 전에 물로 재현탁해야 합니다. 기포가 흔들리면 팁이 막히거나 분배가 일관되지 않을 수 있는 경우, 사용하지 않은 재현탁 효소 및 기질은 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

나중에 마이크로 fuge 튜브의 모세관 디스펜싱 팁에 사용하기 위해 뉴클레오티드와 te 버퍼 P 8을 일대일 희석합니다. 사용하기 전에 잘 섞으십시오. 뉴클레오타이드와 시약 팁을 소프트웨어에서 제안한 양에 따라 적절한 부피로 채웁니다.

팁 측면으로 액체를 부드럽게 분사하여 기포가 피펫팅되어 막히는 것을 방지합니다. 뉴클레오티드 분배 팁에 기포가 있는지 확인하십시오. 기포가 있는 경우 기포가 표면화될 때까지 팁의 측면을 두드리거나 깨끗한 피펫 팁으로 기포를 제거하기만 하면 됩니다.

카트리지를 채운 후 테스트 플레이트를 실행하십시오. 카트리지를 파이로 염기서열분석 기기에 넣고 테스트 플레이트를 96웰 플레이트 플랫폼에 놓습니다. 플레이트 위에 접착 필름을 배치하면 시약과 뉴클레오티드 분배를 쉽게 볼 수 있습니다.

화면 왼쪽에 있는 Instrument 탭을 선택한 다음 Manage(관리)를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 기기를 선택합니다. 테스트를 클릭하면 경고가 나타납니다.

시험판이 기기에 장착되었는지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인을 클릭합니다. 완료되면 테스트 플레이트를 제거하고 플레이트 중앙에 4개의 뉴클레오티드, 효소 및 기질을 나타내는 6개의 웰 위에 액체 점이 있어야 합니다.

작은 점이 6개 미만이면 막힘이 발생한 것이므로 팁에 막힌 부분이 없는지 확인하고 제거해야 합니다. 파이로 시퀀싱 96웰 플레이트 플랫폼에 플레이트를 놓습니다. 모든 레버를 닫고 개별 플레이트에서 실행을 클릭합니다.

효소 기질을 설정하고 뉴클레오티드가 미리 결정된 순서로 분배됩니다. 파이로 시퀀서에 의해 런을 분석했으면 런을 검사할 차례입니다. 파란색 우물은 지나가는 유전자형과 파이로를 나타냅니다.

주황색 우물은 사람의 개입이 필요하며 관심 있는 우물을 클릭하고 예측된 히스토그램을 열어 편집할 수 있습니다. 유전자형은 통과, 실패 또는 확인될 수 있을 뿐만 아니라 유전자형 자체도 적절하게 변경될 수 있습니다. 우물이 편집되면 플레이트 맵에 다크 서클이 표시됩니다.

네거티브 컨트롤은 음수로 점수를 매겨야 합니다. 음의 웰에 비특이적 피크가 있을 수 있지만, 이는 일반적으로 내부 프라이머의 루핑으로 인해 발생합니다. 그래서 우리는 방금 인간 유전체학에서 다형성을 py로 배열하는 방법을 보여드렸습니다.

DNA 파이로 염기서열분석은 광범위한 응용 분야에 적용할 수 있기 때문에 다른 염기서열분석 절차보다 유용합니다. 또한 저농도 및 분해된 DNA를 포함한 모든 출처의 DNA를 처리할 수 있을 만큼 충분히 견고합니다. 이 절차를 수행할 때 깨끗하고 좋은 PCR 제품으로 시작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

각 분석에 대해 음성 대조군을 포함하고 모든 시약이 양호한지 확인하십시오. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.