인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

여기에 설명된 프로토콜은 복제 역학, 숙주 세포 영양성, 선천성 면역 유도 및 인간 코로나바이러스 감염 중 코 상피의 세포 독성 유도와 같은 주요 질문을 다룹니다. 이 프로토콜은 이질적인 세포 집단 및 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 특징을 면밀히 요약하는 오가노이드 미세환경에서 인간 코로나바이러스 숙주 상호 작용을 연구할 수 있도록 합니다. 이 기술은 하부 기도에서 파생된 것과 같은 다른 ALI 배양 시스템에 적용할 수 있습니다.

또한 이 시스템은 천식 또는 낭포성 섬유증 기도와 같은 임상 질환 상태를 모방하는 데 사용할 수 있습니다. 기저 챔버와 정점 챔버를 가진 트랜스웰에서 비강 공기-액체 계면 또는 ALI 배양을 성장시키고 분화합니다. 침수 상태에서 해리된 인간 sinonasal 세포를 확장한 후, 정점 챔버에서 배지를 제거하여 공기-액체 계면에서 배양물을 분화할 수 있도록 합니다.

감염 전날, ALI 배양액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 정점으로 세척합니다. 이를 위해 200마이크로리터의 가열된 PBS를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. PBS를 흡입하고 세탁 과정을 두 번 반복합니다.

그런 다음 기저 배지를 웰당 500마이크로리터의 새 배지로 교체하고 의도한 감염 온도에서 하룻밤 동안 배양액을 평형화합니다. 다음 날, 바이러스를 무혈청 DMEM으로 희석하여 총 접종량 50마이크로리터에서 원하는 감염 다중도를 달성합니다. 바이러스 접종물을 배양액에 정점으로 첨가하고 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.

배양 중 15분마다 플레이트를 양손으로 단단히 잡고 앞뒤로 부드럽게 흔들어 바이러스 접종물의 균일한 흡착을 보장합니다. 배양 후 바이러스 접종물을 흡인하고 앞서 설명한 대로 감염된 각 배양물을 PBS로 세 번 세척하여 완전히 제거되도록 합니다. 원하는 경우 세 번째 PBS 세척을 수집하여 입력 바이러스가 적절하게 제거되었는지 확인합니다.

72시간마다 감염된 ALI의 기저 배지를 교체합니다. 감염 후 미리 결정된 시점에 감염된 각 트랜스웰의 정점 챔버에 200마이크로리터의 PBS를 추가합니다. PBS를 위아래로 5회 피펫팅하여 정점 흘린 바이러스를 최대한 수집하고, 전체 부피를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 정점 표면 액체 또는 ASL 샘플을 수집합니다.

다음으로, 표준 바이러스 플라크 분석을 사용하여 ASL 내 바이러스 입자의 농도를 정량화하기 위해 샘플을 연속으로 희석합니다. 화면에 설명된 대로 적정 중인 인간 코로나바이러스 또는 HCoV에 따라 세포 유형을 선택합니다. 원하는 경우, 감염 후 다양한 시점에서 수집된 희석되지 않은 기저 배지의 플라크 분석을 통해 기저 방출 바이러스의 부재를 확인합니다.

비강 ALI 배양에서 TEER을 측정하려면 제조업체의 지침에 따라 EVOM 기기를 세척하고 평형을 이루고 블랭크합니다. 블랭킹을 위해 비강 세포가 없는 빈 트랜스웰을 사용하고 블랭크 측정값을 기록합니다. 잔류 기저 배지를 세척하려면 감염된 각 트랜스웰을 각 웰에 칼슘과 마그네슘이 함유된 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 사전 라벨링된 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 칼슘과 마그네슘을 함유한 PBS 200마이크로리터를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 1ml를 Endohm-6 측정 챔버에 추가합니다. 집게를 사용하여 각 트랜스웰을 Endohm-6 측정 챔버에 넣고 뚜껑을 교체하여 챔버를 닫습니다.

정점 전극이 정점 구획에 있는 200마이크로리터의 PBS에 잠겨 있는지 확인합니다. 기저 전극은 챔버 바닥에 남아 있습니다. EVOM 판독값이 안정화되면 원시 TEER 측정값을 기록합니다.

적정이 필요한 경우 TEER 측정 후 ASL 샘플을 수집합니다. 원시 TEER 판독값을 화면에 표시된 방정식을 사용하여 센티미터 제곱당 옴 단위의 최종 측정값으로 변환합니다. 인간 코로나바이러스(HCoV)의 경우 감염 후 24시간 또는 48시간 간격으로 TEER을 평가합니다.

각 시점에 음수 컨트롤을 포함해야 합니다. 매체 또는 배경 대조군의 경우 ASL 샘플 수집에 사용된 것과 동일한 구성의 PBS를 사용합니다. 양성 대조군의 경우, 대조군 ALA 배양액을 200마이크로리터의 2%Triton X-100으로 정점 처리합니다.

10-15분 동안 배양한 후, Triton-positive control 샘플, mock background control 샘플, PBS control 샘플 및 실험 샘플로 구성된 플레이트 레이아웃에 따라 전체 부피를 Triton 밀봉 샘플로 수집합니다. 젖산 탈수소효소 또는 LDH 플레이트를 삼중으로 로드합니다. 마지막으로, 표시된 방정식을 사용하여 Triton 밀봉 값에 대한 세포 독성 백분율을 계산하고, 4개의 HCoV에 감염된 비강 ALI 배양에서 평균 정점으로 흘려진 바이러스 역가는 SARS-CoV-2 및 HCoV-229E가 가장 효율적으로 복제되었음에도 불구하고 각 바이러스가 생산적으로 복제되었음을 보여주었습니다.

MERS-CoV 세포 내 및 정점 방출 바이러스 역가는 감염 후 48시간(HPI)에서 거의 동일했습니다. 감염된 배양액을 바이러스 항원에 특이적인 항체 및 섬모 세포 또는 배상 세포에 대한 마커와 함께 염색한 결과, SARS-CoV-2 및 HCoV-NL63은 주로 섬모 세포를 감염시켰지만, MERS-CoV는 주로 비섬모 배상세포를 감염시켰습니다. SARS-CoV-2 및 HCoV-NL63 감염 모두에 대한 기준선에서 주어진 감염 후 시점 또는 델타-TEER까지의 TEER 차이는 MERS-CoV 감염과 달리 192 HPI에서 음수였으며, 이는 TEER에서 유의한 변화를 일으키지 않았습니다.

음의 delta-TEER 값은 상피 장벽 무결성의 손상을 나타냅니다. HCoV-229E는 96 HPI의 초기 시점에서 상피 장벽 기능 장애를 일으켰으나 감염 후반에 모의 수준으로 회복되었습니다. 시간 경과에 따른 각 감염된 트랜스웰에 대한 원시 TEER 데이터를 나타내는 TEER 추적을 통해 감염 과정 경과에 따른 TEER 추세를 시각화할 수 있었습니다.

감염 중 정점 방출 LDH를 정량화한 결과, SARS-CoV-2, HCoV-NL63 및 HCoV-229E는 비강 배양에서 유의한 세포독성을 유발한 반면, MERS-CoV는 그렇지 않은 것으로 나타났습니다. 비강 배양에서 바이러스 복제 역학을 이해하는 것은 매우 중요한데, 이는 세포 독성 및 선천성 면역 유도와 같은 다른 다운스트림 분석을 위한 최적의 시점을 결정하기 때문입니다. TEER 측정은 감염 전과 감염 후 여러 차례에 걸쳐 동일한 배양액에 대해 순차적으로 수행하여 감염 경과에 따른 TEER 변화를 모니터링하는 경우 가장 유익합니다.

우리의 현재 연구는 인간 코로나바이러스 감염 중 전사 변화를 이해하기 위해 설명된 시스템에 RNA 염기서열 분석 접근 방식을 적용하고 사이토카인 및 기타 단백질 생산을 측정하기 위한 ELISA 기술을 적용합니다.