Name: 인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포를 이용하여 인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을. 이 기술은 복제 동역학, 숙주 세포 특이성 및 선천성 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 연구의 자금 출처는 다음과 같습니다: 미국 국립보건원(NIH) R01AI 169537(S.R.W. 및 N.A.C.), NIH R01AI 140442(S.R.W.), VA Merit Review CX001717(N.A.C.), VA Merit Review BX005432(S.R.W. 및 N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation(S.R.W. 및 N.A.C.), T32 AI055400(CJO), T32 AI007324(AF).

비강 검체의 사용은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(프로토콜 # 800614) 및 필라델피아 VA 기관 검토 위원회(프로토콜 # 00781)의 승인을 받았습니다.
1. 비강 ALI 배양 감염
참고: 임상 검체의 획득과 비강 ALI 배양의 성장 및 분화는 이 논문의 범위를 벗어납니다. 일차 비강 상피 세포를 배양하기 위한 구체적인 방법은 이러한 배양물을 이용하여 최근에 발표된 연구에서 찾을 수 있다 18,22,23. 아래 프로토콜은 원하는 경우 상업적으로 이용 가능한 비강 상피 ALI 배양에 추가로 적용할 수 있습니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜과 용량은 24웰 플레이트 트랜스웰 인서트(직경 6.5mm, 멤브레인 표면적 0.33cm2)에 적용할 수 있습니다. 더 큰 트랜스웰(즉, 12웰 플레이트, 직경 12mm, 표면적 1.12cm2)에서 성장한 ALI 배양액을 사용하는 경우 트랜스웰 크기를 반영하도록 부피를 비례적으로 조정합니다.
<ol><li>감염 전날:<ol><li>인산염 완충 식염수(PBS)로 ALI 배양액을 3배 세척합니다(~200μL의 데워진 PBS를 추가하고 37°C 인큐베이터에 5분 동안 넣고 PBS를 흡입하고 반복).</li>
		<li>기초 배지(500μL)를 교체합니다.</li>
		<li>하룻밤 동안 감염이 수행될 온도에서 배양액이 평형을 이루도록 합니다(즉, 33°C에서 감염하는 경우 PBS 세척 후 배양액을 33°C 인큐베이터에 넣음). 참고: HCoV-229E 및 HCoV-NL63과 같은 감기와 관련된 HCoV는 33°C에서 더 효율적으로 복제되는 것으로 보고되었습니다. 또한 생체 내 비강 상피의 온도는 33°C입니다(이는 폐의 온도인 37°C와 다릅니다).</li>
	</ol></li>
	<li>혈청이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 필요에 따라 바이러스를 희석하여 총 접종 용량 50μL에서 원하는 감염 다중성(MOI)을 달성합니다. 참고: 감염은 일반적으로 MOI = 5(높은 MOI)에서 수행되었습니다. 그러나 MOI = 0.5(낮은 MOI)의 감염은 SARS-CoV-2 및 일반적인 감기 관련 HCoV에도 사용되었으며, 이로 인해 유사한 피크 바이러스 역가가 발생하지만 다양한 역학(MOI 중 하나가 허용됨)이 있습니다.</li>
	<li>접종물을 정점으로 추가하고 배양액을 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.</li>
	<li>감염 시 15분마다 판을 부드럽게 돌립니다(양손으로 판을 단단히 잡고 앞뒤로 좌우로 흔들어 바이러스 접종물의 균일한 흡착을 보장함).</li>
	<li>1시간 배양 후 바이러스 접종물을 흡인하고 감염된 각 배양액을 PBS로 3회 세척하여 바이러스 접종물을 제거합니다(세척할 때마다 PBS 200μL를 추가하고 5분 동안 배양한 후 피펫으로 흡인 또는 제거).</li>
	<li>원하는 경우 세 번째 PBS 세척을 수집하여 입력 바이러스가 적절하게 제거되었는지 확인합니다.</li>
	<li>감염 기간 동안 72시간마다 감염된 ALI의 기초 배지를 새 배지로 교체합니다.</li>
</ol>2. 정점 표면 액체(ASL) 수집 및 유출된 바이러스 적정
<ol><li>감염 후 미리 결정된 시점에 200μL의 PBS를 감염된 각 트랜스웰의 정점 챔버에 추가합니다. 참고: 관련 시점은 관심 HCoV에 따라 다르며 감염 후 24시간에서 192시간 사이입니다(다양한 HCoV에 대한 바이러스 복제 데이터는 대표 결과 섹션 참조).</li>
	<li>PBS를 위아래로 5배 피펫팅하여 정점으로 흘린 바이러스를 최대한 수집하고 전체 부피를 마이크로 원심분리 튜브(ASL 샘플)에 수집합니다. 참고: ASL에는 ALI 배양액에서 분비되는 점액 및 기타 산물 외에도 흘린 바이러스 입자가 포함됩니다.</li>
	<li>표준 바이러스 플라크 분석(바이러스 입자의 농도를 정량화하기 위해 바이러스 함유 샘플을 연속적으로 희석)을 통해 ASL에서 감염성 바이러스를 정량화합니다. 참고: 플라크 분석에 사용되는 세포 유형 및 잠복기는 사용된 바이러스에 따라 다릅니다: SARS-CoV-2(VeroE6 세포); MERS-CoV(VeroCCL81 세포); HCoV-NL63(LLC-MK2 세포); HCoV-229E(Huh7 세포). 바이러스 플라크 분석을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이 원고의 범위를 벗어나지만 이전에 Journal of Visualized Experiments(JoVE) 간행물24에 자세히 설명되어 있습니다.</li>
	<li>원하는 경우 감염 후 여러 번 기저 배지를 수집하여 기저 방출 바이러스가 없는지 확인합니다. HCoV는 일반적으로 비강 상피 세포에서 정점으로 방출되지만 희석되지 않은 기저 배지의 플라크 분석을 통해 이를 확인합니다.</li>
	<li>채취 당일에 플라크 분석에 의한 정량이 발생하지 않는 경우 ASL 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. 세포내 바이러스 정량
<ol><li>ASL 검체를 채취한 후 각 트랜스웰을 2% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 500μL의 DMEM이 사전 로드된 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다. 참고: FBS가 2% 함유된 DMEM은 후속 동결-해동 주기 동안 바이러스를 안정화하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>각 트랜스웰을 PBS로 3번 정진맥으로 세척하여 정맥으로 흘린 바이러스를 완전히 제거합니다.</li>
	<li>최종 PBS 세척을 제거하기 위해 흡인 한 후 2% FBS가 포함된 DMEM 100μL를 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>정점 및 기저 배지가 모두 있는 트랜스웰이 포함된 플레이트를 -80°C 냉동고로 옮기고 3회 연속 동결-해동 주기를 완료하여 세포를 용해합니다.</li>
	<li>최종 동결-해동 사이클 후 정점(100μL)과 기저(500μL) 배지를 깨끗한 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>500× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.</li>
	<li>상층액을 수집합니다. 이것은 표준 플라크 분석을 통한 적정을 위한 세포 내 바이러스 샘플입니다. 참고: ASL 수집과 관련하여 수집 과정에서 3중 희석이 발생합니다. ASL 샘플은 200μL의 PBS에서 수집되는 반면, 세포 내 바이러스 샘플은 총 600μL로 수집됩니다.</li>
</ol>4. 경상피 전기 저항(TEER) 측정
알림: TEER 측정의 경우 칼슘과 마그네슘이 보충된 PBS(PBS + Ca 2+/Mg2+)를 사용해야 합니다. 옴 단위로 읽도록 설정된 상피 전압/저항계가 사용됩니다(재료 표 참조).
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 EVOM 기기를 청소, 평형 및 비우십시오. 블랭킹을 위해 비강 세포가 추가되지 않은 "비어있는" 트랜스웰을 사용하십시오. 빈 TEER 측정을 기록합니다. 알림: 여러 바이러스를 사용하는 경우 교차 오염을 방지하기 위해 조건 사이에 EVOM 기기를 엄격하게 세척해야 합니다(70% 에탄올로 세척한 후 탈이온수로 세척하면 충분함).</li>
	<li>감염된 각 트랜스웰을 500μL의 PBS + Ca 2+/Mg 2+ 기저가 있는 사전 라벨이 부착된 깨끗한24 웰 플레이트로 이동하여 트랜스웰에서 잔류 기저 배지를 세척합니다.</li>
	<li>200μL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>1mL의 PBS + Ca 2+/Mg2+를 Endohm-6 측정 챔버에 추가합니다.</li>
	<li>각 트랜스웰을 Endohm-6 측정 챔버로 이동하고 정점 전극이 정점 구획의 PBS 200μL에 놓이도록 챔버의 뚜껑을 교체합니다. 기저 전극은 Endohm-6 챔버의 바닥에 내장되어 있습니다.</li>
	<li>EVOM 판독값이 안정화되도록 하고 원시 TEER 측정을 기록합니다.</li>
	<li>적정이 필요한 경우 TEER 측정을 수행한 후 위에서 설명한 대로 ASL 샘플을 수집합니다(TEER 측정을 위해 추가된 PBS + Ca 2+/Mg 2+의200μL에서 수집). 참고: ASL 샘플 수집은 상피 장벽에 미세 파열을 유도하여 TEER 판독값을 혼동할 수 있으므로 TEER 측정 후 ASL을 수집해야 합니다. 또한 기저 매체는 TEER 값에도 영향을 미칠 수 있으므로 TEER 판독 직전에 변경해서는 안 됩니다.</li>
	<li>원시 TEER 판독값을 Ohms/cm2 단위의 최종 측정값으로 변환하려면 빈 TEER 값을 빼고 방정식 (1)을 사용하여 이 값에 트랜스웰 멤브레인의 표면적을 곱합니다. TEER = [TEER 판독값 - 공백 TEER 값] ×(트랜스웰의 표면적) (1)</li>
	<li>HCoV의 경우 감염 후 24시간 또는 48시간마다 TEER을 평가합니다. TEER 변화의 동역학은 바이러스에 따라 달라지는 경우가 많으며 다양한 시점에서 문제 해결이 필요합니다.</li>
	<li>TEER을 측정할 때는 항상 모의 감염 배양을 포함하고 각 시점(음성 대조군)에서 평가합니다. 참고: 모의 배양의 경우 TEER 측정은 안정적으로 유지되거나 배양 분화가 완료된 후 기준선에서 약간 증가할 수 있습니다. 멤브레인 지지대의 표면적은 트랜스웰의 크기와 제조업체에 따라 달라집니다. 24웰 트랜스웰의 표면적은 일반적으로 0.33cm2입니다.</li>
</ol>5. 젖산 탈수소효소(LDH) 분석을 통한 감염 중 세포독성 측정
참고: 이 연구에서는 ASL 샘플의 LDH 함량을 시판되는 세포독성 검출 키트를 사용하여 정량화했습니다. 기초 배지의 LDH 신호는 종종 검출 한계 미만이었고 HCoV 감염 배양의 ASL 샘플에서 정량화된 LDH보다 재현성이 떨어지는 경우가 많았습니다.
<ol><li>LDH 분석에 필요한 추가 대조군을 준비합니다.<ol><li>배경 제어: PBS를 사용합니다(ASL 샘플이 이러한 방식으로 수집된 경우 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 사용).</li>
		<li>양성 대조군(한계값): Triton X-100으로 ALI를 정점으로 처리합니다. Triton 대조군을 수집합니다(일반적으로 각 시점에서 3개의 ALI 배양을 사용합니다).<ol><li>PBS의 2% Triton X-100 200μL 200을 트랜스웰의 정점 구획에 직접 추가합니다.</li>
			<li>세포가 완전히 용해될 수 있도록 10-15분 동안 배양합니다.</li>
			<li>전체 부피를 Triton 천장 샘플로 수집합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>음성 대조군(낮은 대조군/기준선 LDH 방출): 감염된 배양물과 동일한 공여체에서 유래한 모의 감염 ALI 배양물에서 ASL을 수집합니다.<ol><li>위의 ASL 수집 절차에 따라 음성 대조군 모의 ASL을 수집합니다. 알림: 모든 시점에 대해 이 네거티브 컨트롤에 동일한 트랜스웰을 사용할 수 있는 반면, Triton 컨트롤의 경우 각 시점에 대해 새로운 트랜스웰이 필요합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>각 ASL 샘플의 LDH 판독값과 함께 흘린 바이러스를 정량화하려면 다음과 같이 광학적으로 투명한 평평한 바닥의 검은색 96웰 플레이트를 로드합니다.<ol><li>45μL의 샘플과 55μL의 PBS(총 부피 100μL)를 사용하여 모든 샘플을 PBS로 희석합니다.</li>
		<li>Triton 양성 대조군과 모의 배경 대조군 표본을 동일한 방식으로 처리합니다. 참고: 이 희석을 통해 각 실험 샘플(45μL x 3)을 3배로 로딩하고 플라크 분석을 통한 적정을 위한 충분한 잔류 ASL 부피를 얻을 수 있습니다.</li>
		<li>LDH 플레이트를 세 번 로드: Triton 천장, 모의 배경 제어, PBS 제어 및 실험 샘플.</li>
		<li>제조업체가 표시한대로 반응 혼합물을 준비합니다 (염료 용액 + 촉매).<ol><li>각 웰에 100μL의 반응 혼합물을 첨가하고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>20분 후 492nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
		<li>방정식 (2)를 사용하여 Triton 천장 값에 상대적인 세포 독성 백분율을 계산합니다. 세포 독성 (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. 면역형광(IF) 이미징을 위한 비강 ALI 배양 준비
<ol><li>트랜스웰을 새 24웰 플레이트로 옮기고 PBS로 정점으로 3회 세척합니다(역가가 있는 경우 첫 번째 PBS 세척을 ASL로 수집한 다음 두 번의 추가 PBS 세척을 수행하여 IF 품질을 저해할 수 있는 과도한 흘린 바이러스를 제거)</li>
	<li>최종 PBS 세척 후 트랜스웰을 정점과 기초 방향으로 4% PFA로 덮습니다.</li>
	<li>30분 동안 배양하여 4% PFA로 고정한 다음 제거하고 PBS로 3번 세척합니다.</li>
	<li>날카로운 면도날이나 가위를 사용하여 세포가 들어 있는 트랜스웰 지지대를 절제합니다.</li>
	<li>각 트랜스웰에 대한 IF 표적 수를 늘리려면 각 멤브레인을 반으로 자르고 각 절반을 서로 다른 항체 조합으로 염색합니다.</li>
	<li>PBS에서 0.2% Triton X-100으로 10분 동안 투과시킵니다.</li>
	<li>PBST(PBS + 0.2% Triton X-100)의 10% 정상 당나귀 혈청과 1% BSA로 실온에서 60분 동안 차단합니다. 알림: 이 단계부터 빛에 노출되지 않도록 샘플을 보호하십시오.</li>
	<li>4°C에서 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 모든 항체를 차단 완충액에 1:1,000으로 희석합니다. 참고: HCoV 뉴클레오캡시드 염색을 위한 대표적인 항체와 상피 세포 유형 마커 및 세포골격 염색은 아래에 나열되어 있습니다(제조업체 정보 및 카탈로그 번호는 재료 표 참조).<ol><li>HCoV 항원 염색의 경우 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 및 HCoV-NL63 뉴클레오캡시드를 표적으로 하는 항체를 사용합니다.</li>
		<li>상피 세포 유형을 식별하려면 잔 세포 마커 MUC5AC 및 섬모 세포 마커 유형 IV β-튜불린을 표적으로 하는 항체를 사용합니다.</li>
		<li>세포골격 마커의 경우 팔로이딘(F-액틴과 결합)에 대한 항체와 상피 세포 접착 마커인 EpCAM(CD326)을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실온에서 60분 동안 2차 항체 용액에서 배양합니다. 차단 완충액에 1:1,000으로 희석된 2차 항체 염료를 사용합니다.</li>
	<li>염색이 완료되면 멤브레인을 주걱으로 유리 슬라이드에 옮기고 정점 쪽이 슬라이드를 향하도록 트랜스웰을 향하게 한 다음 장착 용액을 추가합니다. 가장자리 주위에 투명한 매니큐어를 바르기 전에 15-30분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 획득(Z축 단계: 0.5μm, 순차 스캐닝)1,16,17. 참고: 배양액을 4% PFA에 고정하고 PBS로 세척한 후 고정 배양액을 4°C에서 몇 주에서 몇 달 동안 보관한 후 염색 및 이미징 준비를 할 수 있습니다. 멤브레인을 염색하고 장착한 후 시료는 어두운 곳에서 4°C에서 장기간(&gt;2년) 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 서양 면역블로팅을 위한 세포 내 단백질 수집 또는 RT-qPCR 분석을 위한 RNA
<ol><li>바이러스 역가를 정량화하는 경우 위에서 설명한 대로 ASL을 수집합니다(프로토콜 섹션 2).</li>
	<li>멤브레인을 긁으면 인서트가 파손될 수 있으므로 트랜스웰을 깨끗한 24웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>웨스턴 블롯 분석의 경우, 프로테아제 억제제 및 인산가수분해효소 억제제가 보충된 125μL의 RIPA 완충액(50mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 1% NP40)에서 총 단백질 용해물을 수집합니다.</li>
	<li>125 μL의 RIPA 완충액을 정점 격실에 추가하고 5-10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>P200 피펫 팁을 사용하여 멤브레인을 긁어 부착된 나머지 세포를 제거하고 전체 부피를 수집합니다(멤브레인의 전체 표면을 세게 긁은 다음 위아래로 여러 번 피펫팅하여 전체 샘플을 수집).</li>
	<li>단백질 용해물 시료를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음 4°C에서 10분 동안 최대 속도(20,000 × g)로 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 4x Laemmli 샘플 버퍼와 β-메르캅토에탄올(환원제)과 제조업체 프로토콜에 따라 혼합합니다.</li>
	<li>단백질 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓인 다음 전통적인 웨스턴 블로팅 프로토콜 1,16,17을 사용하여 실행합니다.</li>
	<li>전체 RNA를 수집하려면 시중에서 판매되는 RNA 추출 키트를 선택하십시오. 참고: 24웰 트랜스웰 인서트의 정점 격실은 최대 부피가 ~200μL입니다. 따라서 총 권장 용량에 도달하기 위해 각 배양액에 대해 두 번의 순차적 세척을 수행합니다. 아래 세부 정보는 총 부피 350μL의 RNA 샘플의 권장 수집에 해당합니다.</li>
	<li>200μL의 용해 완충액을 감염된 트랜스웰의 정점 구획에 추가합니다.</li>
	<li>5-10분 동안 그대로 두었다가 피펫 팁을 사용하여 멤브레인에 남아 있는 세포를 긁어내고 전체 부피를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브에 모읍니다.</li>
	<li>150μL의 추가 용해 완충액을 트랜스웰의 정점 구획에 추가하고 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 수집하기 전에 위아래로 피펫팅합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.</li>
</ol>

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</ol>

수잔 와이스(Susan Weiss)는 오큐젠(Ocugen)의 과학 자문 위원회에 소속되어 있습니다. 노암 A. 코헨(Noam A. Cohen)은 GSK, 아스트라제네카(AstraZeneca), 노바티스(Novartis), 사노피/레제론(Sanofi/Regeron), 오이스터 포인트 파마슈티컬스(Oyster Point Pharmaceuticals)의 자문을 맡고 있으며, 미국 특허인 "호흡기 감염 치료 및 진단"(10,881,698 B2, WO20913112865)을 보유하고 있으며, GeneOne Life Sciences와 라이선스 계약을 체결했습니다.

여기에 자세히 설명된 방법은 환자 유래 비강 상피 세포가 공기-액체 계면에서 성장하고 HCoV-숙주 상호 작용 연구에 적용되는 1차 상피 배양 시스템을 설명합니다. 일단 분화되면, 이러한 비강 ALI 배양은 섬모, 잔 및 기저 세포가 대표되는 이질적인 세포 집단뿐만 아니라 섬모와 점액 분비가 강력하게 박동하는 온전한 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 많은 특징을 요약합니다. 이러한 이질적인 세포 집단은 바이러스 감염 중 숙주 세포 영양성의 특성을 분석할 수 있기 때문에 기존 호흡기 상피 세포주에 비해 이 배양 시스템의 주요 이점입니다( 그림 2 참조). 또한 전통적인 기도 상피 세포주에는 인터페론 생성과 같은 선천성 면역 경로와 함께 호흡기 바이러스에 대한 1차 방어에 중요한 역할을 하는 기능적 점액섬모 제거 메커니즘이 없습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계에는 초기 감염 절차가 포함됩니다. 예를 ...

현재까지 7종의 인간 코로나바이러스(HCoV)가 확인되었으며 다양한 호흡기 질환을 유발합니다2. 일반적인 또는 계절성 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)는 일반적으로 상기도 병리와 관련이 있으며 매년 일반적인 감기 사례의 약 10%-30%를 유발합니다. 이는 일반적인 HCoV와 관련된 전형적인 임상 표현형이지만, 이러한 바이러스는 어린이, 노인 및 면역 저하자를 포함한 위험에 처한 인구 집단에서 더 심각한 하기도 질환을 유발할 수 있습니다 3,4. 중증급성호흡기증후군(SARS)-CoV, 중동호흡기증후군(MERS)-CoV, SARS-CoV-2 등 3가지 병원성 HCoV가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중보건 비상사태를 일으켰습니다. 치명적 HCoV는 더 심각한 호흡기 병리와 관련이 있으며, 이는 MERS-CoV 사례와 관련된 >34%의 치사율(2012년 출현 이후 2,500건 이상의 사례에서 894명 사망)5,6으로 명확하게 설명됩니다. 또한 현재 진행 중인 COVID-19 팬데믹에서 볼 수 있듯이 치명적인 HCoV는 무증상 감염에서 치명적인 폐렴에 이르기까지 다양한 호흡기 질환을 유발한다는 점에 유의해야 합니다7.
HCoV는 다른 호흡기 병원체와 마찬가지로 호흡기로 들어가 비강 상피에 생산적인 감염을 일으킨다8. 하기도로의 전이는 구강/비강에서 폐로의 흡인과 관련이 있는 것으로 생각되며, 여기서 HCoV는 더 심각한 하기도 병리를 유발한다 9,10,11. 따라서, 코는 바이러스 진입을 위한 초기 관문 역할을 하며, 강력한 점액섬모 제거 기계와 하부 기도로의 바이러스 확산을 막기 위한 독특한 선천성 면역 기전을 통해 감염에 대한 주요 장벽이 된다12,13. 예를 들어, 비강 상피세포는 항바이러스 인터페론 및 인터페론 자극 유전자의 평균 기초 수준보다 높은 발현을 하는 것으로 보고되었으며, 이는 비강 세포가 호흡기 바이러스에 대한 조기 반응을 위해 준비될 수 있음을 나타냅니다14,15,16.
우리는 이전에 HCoV 감염이 시작되는 코에서 HCoV-숙주 상호 작용을 모델링하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 성장한 환자 유래 일차 비강 상피 세포를 활용했습니다. 비강 ALI 배양은 병원성(SARS-CoV-2 및 MERS-CoV)과 일반적인 HCoV(HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 모두에 허용되며 A549(폐 선암 세포주)16,17와 같은 기존 기도 상피 세포주에 비해 다양한 이점을 제공합니다. 분화 후, 비강 ALI 배양물은 이질적인 세포 집단을 포함하며, 점액섬모 청소 기계(mucociliary clearance mechanism)와 같은 생체 내 비강 상피에서 기대되는 많은 기능을 나타낸다18. 또한 비강 세포는 하부 기도 배양 시스템(예: 인간 기관지 상피 세포, HBEC)에 비해 이점을 제공하는데, 이는 세포학적 칫솔질을 통한 비강 상피 세포 획득이 HBECs 19,20,21을 얻기 위해 기관지 내시경과 같은 기술을 사용하는 것에 비해 훨씬 덜 침습적이기 때문입니다.
이 논문은 이 비강 ALI 배양 시스템을 활용하여 비강 상피에서 HCoV-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을 설명합니다. SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E를 비교하기 위해 최근 발표된 연구에서 이러한 방법을 적용했습니다 1,16,17. 이러한 방법과 대표적인 결과는 이 비강 세포 모델에서 HCoV에 대한 연구를 강조하지만, 이 시스템은 다른 HCoV 및 기타 호흡기 병원체에 매우 잘 적응합니다. 또한, 이러한 방법은 바이러스 복제 및 세포 영양성뿐만 아니라 감염 후 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 조사하기 위해 다른 ALI 배양 시스템에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 2차 항체 (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cytotoxicity detection kit</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + 칼슘 + 마그네슘</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Endohm-6G 측정 챔버</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>상피 세포 접착 마커(EpCAM; CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW software for imaging</td><td>Olympus</td><td>버전 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td><td>BEI 리소스</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 뉴클레오캡시드 항체</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼 (4x)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV(인간 코로나바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>BEI 리소스&nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>MERS-CoV 뉴클레오캡시드 항체</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>MUC5AC 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>모든 플레이트 리더 또는 ELISA 리더로 충분합니다. 492nm</td></tr><tr><td>RIPA 버퍼(50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1% NP40)</td>에서 흡광도를 읽을 수 있어야 합니다. <td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2(SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td><td>BEI 리소스</td><td>NR-52281</td>에서 흡광도를 읽을 수 있어야 합니다.<td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 항체</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Type IV &beta;-tubulin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>VeroCCL81 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>SARS-CoV-2 적정</td></tr></tbody></table>

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

SARS-CoV(2002년), MERS-CoV(2012년), SARS-CoV-2(2019년)의 세 가지 고병원성 인간 코로나바이러스(HCoV)가 출현하여 지난 20년 동안 심각한 공중 보건 위기를 초래했습니다. 매년 4개의 추가 HCoV(HCoV-NL63, -229E, -OC43 및 -HKU1)가 일반적인 감기 사례의 상당 부분을 유발하며, 이는 생리학적으로 관련된 시스템에서 이러한 바이러스를 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. HCoV는 호흡기로 들어가 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 부위인 비강 상피에 감염을 일으킵니다. 당사는 환자 유래 비강 샘플이 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되는 1차 비강 상피 배양 시스템을 사용하여 이 중요한 감시 부위에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구합니다. 이러한 배양은 존재하는 세포 유형, 섬모 기능 및 점액 생성을 포함하여 생체 내 기도의 많은 특징을 요약합니다. 치사량과 계절성 HCoV를 비교한 최근 연구를 예시1로 사용하여 HCoV 감염 후 비강 ALI 배양에서 바이러스 복제, 숙주 세포 영양성, 바이러스 유도 세포 독성 및 선천성 면역 유도를 특성화하는 방법을 설명합니다. 코에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 HCoV 및 향후 등장할 가능성이 있는 기타 호흡기 바이러스에 대한 항바이러스 치료제의 새로운 표적을 제공할 수 있습니다.

대표적인 수치는 원고 Otter et al.1에서 찾을 수 있는 데이터에서 부분적으로 각색되었습니다. 4명 또는 6명의 기증자로부터 유래한 비강 ALI 배양은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 4가지 HCoV(SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 및 HCoV-229E) 중 하나에 감염되었으며, 각 바이러스에 대한 평균 정점 탈락 바이러스 역가는 그림 1A에 나와 있습니다. 이 4가지 HCoV는 모두 비강 ALI 배양에서 생산적으로 복제되지만 SARS-CoV-2 및 HCoV-229E가 가장 효율적으로 복제됩니다. 이는 평균적인 바이러스 역가이며, 개별 기증자의 각 HCoV에 대한 역가가 최근에 발표되었다는 점에 유의하십시오1. 프로토콜 섹션 3에 설명된 대로 비강 ALI 배양을 세척한 후 정점 표면 액체(ASL)의 MERS-CoV 역가를 그...

비강 상피는 모든 호흡기 병원체가 만나는 주요 장벽 부위입니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 시스템에서 인간 코로나바이러스-숙주 상호 작용을 특성화하기 위해 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양으로 성장한 일차 비강 상피 세포를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

여기에 설명된 프로토콜은 복제 역학, 숙주 세포 영양성, 선천성 면역 유도 및 인간 코로나바이러스 감염 중 코 상피의 세포 독성 유도와 같은 주요 질문을 다룹니다. 이 프로토콜은 이질적인 세포 집단 및 점액 섬모 기능을 포함하여 생체 내 비강 상피의 특징을 면밀히 요약하는 오가노이드 미세환경에서 인간 코로나바이러스 숙주 상호 작용을 연구할 수 있도록 합니다. 이 기술은 하부 기도에서 파생된 것과 같은 다른 ALI 배양 시스템에 적용할 수 있습니다.또한 이 시스템은 천식 또는 낭포성 섬유증 기도와 같은 임상 질환 상태를 모방하는 데 사용할 수 있습니다. 기저 챔버와 정점 챔버를 가진 트랜스웰에서 비강 공기-액체 계면 또는 ALI 배양을 성장시키고 분화합니다. 침수 상태에서 해리된 인간 sinonasal 세포를 확장한 후, 정점 챔버에서 배지를 제거하여 공기-액체 계면에서 배양물을 분화할 수 있도록 합니다.감염 전날, ALI 배양액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 정점으로 세척합니다. 이를 위해 200마이크로리터의 가열된 PBS를 각 트랜스웰의 정점 구획에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. PBS를 흡입하고 세탁 과정을 두 번 반복합니다.그런 다음 기저 배지를 웰당 500마이크로리터의 새 배지로 교체하고 의도한 감염 온도에서 하룻밤 동안 배양액을 평형화합니다. 다음 날, 바이러스를 무혈청 DMEM으로 희석하여 총 접종량 50마이크로리터에서 원하는 감염 다중도를 달성합니다. 바이러스 접종물을 배양액에 정점으로 첨가하고 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.배양 중 15분마다 플레이트를 양손으로 단단히 잡고 앞뒤로 부드럽게 흔들어 바이러스 접종물의 균일한 흡착을 보장합니다. 배양 후 바이러스 접종물을 흡인하고 앞서 설명한 대로 감염된 각 배양물을 PBS로 세 번 세척하여 완전히 제거되도록 합니다. 원하는 경우 세 번째 PBS 세척을 수집하여 입력 바이러스가 적절하게 제거되었는지 확인합니다.72시간마다 감염된 ALI의 기저 배지를 교체합니다. 감염 후 미리 결정된 시점에 감염된 각 트랜스웰의 정점 챔버에 200마이크로리터의 PBS를 추가합니다. PBS를 위아래로 5회 피펫팅하여 정점 흘린 바이러스를 최대한 수집하고, 전체 부피를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 정점 표면 액체 또는 ASL 샘플을 수집합니다.다음으로, 표준 바이러스 플라크 분석을 사용하여 ASL 내 바이러스 입자의 농도를 정량화

infection-primary-nasal-epithelial-cells-grown-at-an-air-liquid

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을...

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

기-액 계면 배양된 인간 비강 상피 세포에서의 바이러스 성장

이 보고서의 연구 결과와 결론은 저자의 이러한하며 반드시 질병 통제 예방 센터 (CDC)의 의견을 대표하지 않습니다.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

배우세요 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포를 이용하여 인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하는 방법을. 이 기술은 복제 동역학, 숙주 세포 특이성 및 선천성 면역 반응 연구에 활용됩니다.

인간 코로나바이러스-숙주 상호작용을 특성화하기 위해 공기-액체 계면에서 성장한 일차 비강 상피 세포의 감염

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