Name: 적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 배우세요 적혈구 단백질의 동적 변화를 면역염색으로 검출하는 방법을. 파라포름알데히드 고정과 특이적 항체를 활용하여 기계생물학 및 적혈구 역학신호 연구에 활용할 수 있습니다.

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LK는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 인정합니다.

<ol><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li>
<li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+%28RBC%29+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li>
<li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+red+blood+cells+die%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">How do red blood cells die?</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393(2021).</li>
<li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells%3A+organelle+clearance+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076(2017).</li>
<li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells%3A+chasing+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945(2019).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li>
<li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218(2020).</li>
<li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+%26%2334%3Bsignatures%26%2334%3B+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &#34;signatures&#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li>
<li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+organization+of+a+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103(2022).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity%2C+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982(2012).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36(2019).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759(2013).</li>
<li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+vasodilation+and+the+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li>
<li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+exercise+induces+changes+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+pattern+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+red+blood+cell+deformability+is+independent+of+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).</li>
<li>Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47(2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+NOS%3A+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li>
<li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li>
<li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+deformability%2C+vasoactive+mediators%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417(2019).</li>
<li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease%3A+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206(2015).</li>
<li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li>
<li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li>
<li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology%3A+Impact+on+RBC+deformability%2C+oxidative+stress%2C+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li>
<li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li>
<li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans%3A+a+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36(2021).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813(2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Nitric+Oxide+Research%22">Methods in Nitric Oxide Research</a>. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).</li>
<li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+red+blood+cells+at+work%3A+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%3E%22%5BJournal%5D)">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li>
</ol>

모든 저자는 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.

최근 문헌은 RBC-NOS 단백질 이 RBC 변형성 15,22,23의 조절에 결정적으로 중요하다는 것을 강력히 시사하며, 이는 차례로 좁은 모세혈관을 통한 통과를 용이하게 한다 24. 단백질 활성은 번역 후 단백질 변형, 특히 특정 잔기의 인산화에 크게 의존한다18. 관심의 초점은 RBC-NOS 단백질23의 활성화와 관련된 인산화 부위 1177에 있습니다. 이 단백질의 변화는 다양한 질병(25,26,27,28,29)에서 나타났 으며</s...

적혈구(RBC)는 70일에서 140일 동안 심혈관계를 통과하며, 평균 적혈구 연령은 약 115일이다 1,2. 노화 또는 손상된 적혈구는 대식세포에 의해 구동되는 효율적인 제거 과정인 적혈구증가증에 의해 순환계에서 제거된다3. 이러한 세포의 미리 결정된 수명은 분화와 성숙 과정에서 핵, 미토콘드리아, 리보솜을 포함한 세포 소기관을 포기한 결과 중 하나이다4. 따라서 순환하는 적혈구에는 새로운 단백질의 합성을 방해하는 번역 기계가 없다3. 따라서 기존 단백질에 대한 동적 번역 후 변형은 적혈구에 작용하는 세포외 및 세포내 스트레스 요인에 대한 반응으로 급성, 생화학적 조절의 유일한 실행 가능한 메커니즘을 나타냅니다5.
기계적 힘은 적혈구 내에서 생화학적 경로의 활성화 또는 조절을 유발하는 주요 세포외 신호인 것으로 보입니다. RBC 막에서 기계 감응성 단백질인 Piezo1의 발견은 6 이 세포에서 기계적으로 활성화된 신호 전달을 조사하는 여러 연구 라인에 영감을 주었습니다 7. 예를 들어, 최근의 발전은 적혈구의 물리적 특성이 번역 후 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)9를 포함하는 단백질8의 급성 및 동적 변화에 의해 능동적으로 조절된다는 것을 보여주었다. 이러한 정상적인 변형은 특정 질병 9,10,11에서 다르기 때문에 특히 기계 생물학적 과정과 관련하여 RBC 단백질의 활성화 상태를 결정하는 것이 과학적이고 임상적으로 중요한 것으로 보입니다.
RBC 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 결정하는 것은 몇 가지 방법론적 문제를 제기합니다. 예를 들어, 추후 분석을 위해 RBC 샘플을 보관하려면 번역 후 변형이 내구성이 없기 때문에 변형된 RBC 단백질의 보존이 필요합니다. 또한, 전통적인 단백질 검출 방법(예: 웨스턴 블로팅)은 적혈구에서 표준화하기가 매우 어려운데, 이는 헤모글로빈에 비해 단백질 함량이 낮기 때문이며, 헤모글로빈은 이러한 세포에서 단백질 함량의 ~98%를 차지한다12. 따라서 화학적으로 보존된 적혈구의 항체 기반 염색은 산화질소 합성효소(RBC-NOS)의 적혈구 특이적 동형과 같은 중요한 적혈구 단백질의 급성 변형을 조사할 때 선택되는 방법이었습니다13,14. RBC-NOS는 효소적으로 산화질소(NO)를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 RBC 변형성을 포함한 필수 RBC 특성에 필수적인 것으로 보인다15,16,17. RBC-NOS의 번역 후 변형은 촉매 효소 활성을 조절하며, 세린 1177 잔기의 인산화는 효소 활성을 증가시키는 것으로 설명되는 반면, 잔기 세린 114 또는 트레오닌 495의 인산화는 RBC-NOS 활성 감소와 관련이 있습니다18,19.
총체적으로, RBC 단백질의 일시적인 변형은 중요한 세포 기능에 기여하며, 이러한 변형된 단백질의 검출을 가능하게 하는 표준화된 프로토콜은 높은 가치가 있습니다. 여기에서는 RBC-NOS 단백질 활성화의 검출을 용이하게 하기 위해 특정 항체를 활용하는 두 가지 별개의 프로토콜을 제시하고 데이터 분석 및 해석을 위한 권장 사항에 대해 논의합니다.
기술된 프로토콜의 성능은 인간 맥관 구조(5 Pa) 내에서 발생하는 것을 반영하는 기계적 힘에 대한 반응으로 세린 1177 잔기에서 RBC-NOS의 인산화 증가의 잘 보고된 증가를 측정함으로써 평가되었습니다.

<table><tbody><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride 수화물</td><td>Sigma/Merck</td><td>D5637</td><td>DAB</td></tr><tr><td>암모늄클로라이드&nbsp;</td><td>Merck /Millipore</td><td>101145</td><td>NH4Cl</td></tr><tr><td>원심분리기 5427 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5409000010</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>VWR</td><td>631-0147&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 수소 인산염 이수화물&nbsp;</td><td>Merck / Millipore</td><td>106580</td><td>Na2HPO4. 2 H2O</td></tr><tr><td>일회용 이송 피펫</td><td>VWR</td><td>612-6803</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck /Millipore</td><td>107961</td><td>현미경용 빠른 장착 매체</td></tr><tr><td>1% 메틸 에틸 케톤(MEK)을 사용하여 변성된 에탄올</td><td>Hofmann</td><td>642</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-Oxidase</td><td>시그마/머크</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>그리스 연필&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S 2002</td><td></td></tr><tr><td>말무 peroxidase / ExtrAvidin&minus; Peroxidase</td><td>Sigma/Merck</td><td>E-2886</td><td>HRP</td></tr><tr><td>염산&nbsp;</td><td>Merck / Millipore</td><td>109057</td><td>HCl</td></tr><tr><td>과산화수소, 30 %</td> <td>Merck / Millipore</td><td>107203</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>프리웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 보조 광학 회전 세포 분석기 (LORCA)</td> <td>RR 메카트로닉스</td><td></td><td>Ektacytometer 기기 메탄올 전단에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Merck / Millipore</td><td></td><td></td>106009</tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>니켈(II)-황산염 헥사하이드레이트&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>N4882</td><td>NiSO4.6H2O</td></tr><tr><td>Normal Goat serum</td><td>Agilent/DAKO</td><td>X0907</td><td>NGS</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Merck /Millipore</td><td>818715</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Pipettes Eppendorf Reference 2</td><td>VWR</td><td>613-5836/ 613-5839</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-phospho eNOS 항체 (Ser1177)</td><td>Merck/Millipore</td><td>07-428-I</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>반응 튜브, 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체 염소 안티 토끼</td><td>Agilent/DAKO</td><td>E0432</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Merck /Millipore</td><td>106404</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>나트륨 이수소 인산염 일수화물</td><td>Merck /Millipore</td><td>106346</td><td>NaH2PO4. H2O</td></tr><tr><td>수산화나트륨, 1 M</td><td>머크/밀리포어</td><td>150706</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄</td><td>머크/밀리포어</td><td>108382</td><td>트리</td></tr><tr><td>스 트립신</td><td>시그마/머크</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Merck /Millipore</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Glas 극세사 필터, 품질 GF/F</td><td>Merck /Millipore</td><td>WHA1825047</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR Chemicals</td><td>2,89,73,465</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-D-Glucose monohydrate</td><td>Merck /Millipore</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr></tbody></table>

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

적혈구(RBC) 단백질의 항체 표지는 전체 단백질 함량의 변화 또는 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 감지하기 위해 일반적으로 사용되는 반정량적 방법입니다. 적혈구 치료의 평가, 특정 질병 상태의 차이 특성화 및 세포 일관성 설명을 용이하게 합니다. 급격하게 변형된 단백질 활성화(예: 기계 형질도입을 통해)를 검출하려면 일시적인 단백질 변형을 보존하기 위해 적절한 샘플 준비가 필요합니다. 기본 원리는 특정 1차 항체의 초기 결합을 가능하게 하기 위해 원하는 RBC 단백질의 표적 결합 부위를 고정화하는 것을 포함한다. 샘플은 상응하는 1차 항체에 대한 2차 항체의 결합을 위한 최적 조건을 보장하기 위해 추가 처리됩니다. 비형광 2차 항체를 선택하려면 비오틴-아비딘 커플링과 염색을 위한 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드(DAB)의 적용을 포함한 추가 처리가 필요하며, 이는 산화를 멈추고 염색 강도를 적시에 제어하기 위해 현미경으로 실시간으로 제어해야 합니다. 염색 강도 검출을 위해 표준 광학 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 이 프로토콜의 변형에서, 플루오레세인-접합된 2차 항체가 대신 적용될 수 있으며, 이는 추가 개발 단계가 필요하지 않다는 이점을 갖는다. 그러나 이 절차에서는 염색 검출을 위해 현미경에 부착된 형광 대물렌즈가 필요합니다. 이러한 방법의 반정량적 특성을 감안할 때, 비특이적 항체 반응 및 배경 신호를 설명하기 위해 몇 가지 대조 염색을 제공하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 염색 프로토콜과 해당 분석 프로세스를 모두 제시하여 다양한 염색 기술의 각 결과와 장점을 비교하고 논의합니다.

RBC 단백질의 급성 변이의 검출을 용이하게 하는 방법을 설명하는 제시된 프로토콜은 잘 알려진 기계적으로 민감한 단백질 변이인 세린 1177 잔기에서 RBC-NOS의 인산화에 대해 테스트되었습니다. 건강한 지원자로부터 전혈을 얻은 후 두 개의 개별 분취량으로 분할했습니다. 주어진 혈액 샘플을 300초 동안 생리학적 크기(5Pa)의 기계적 전단 응력에 노출시켰으며, 이는 이전에 세린 1177에서 RBC-NOS 인산화를 유도하는 것으로 나타났습니다14. 기계적 전단 노출의 중단 직후, 혈액 샘플을 파라포름알데히드로 고정시켰다. 대조군으로서 혈액 샘플을 노출시키고 전단 장치에 로드하고 파라포름알데히드에 고정하기 전에 300초 동안 그대로 두었습니다. 휴식 시 세린 1177 잔기에서 인산화된 RBC-NOS에 대한 항체의 신호와 기계적 힘 노출에 대한 반응은 면역조직화학(그림 3A,B)과 면역형광(그림 3C,D)...

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

우리의 방법은 일시적인 단백질 변형을 제자리에 고정한 다음 특정 항체로 검출함으로써 빠르게 변화하는 기계생물학 분야에서 기계론적 세포 내 조사를 가능하게 합니다. 이 방법은 기술적으로 적용하기 쉽습니다. 결과는 매우 타당하고 재현 가능합니다.또한, 다른 기술과 비교하여, 우리의 방법은 일시적인 단백질 변형, 특히 적혈구 기계 신호전달에 의존하는 번역 후 적혈구 신호 전달의 새로운 분야에서 실제로 효과적으로 사용될 수 있습니다. RBC 단백질 고정을 수행하려면 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 1:2의 비율로 전혈을 희석합니다. 혈액 용액 132g을 실온에서 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거한다.RBC 펠릿을 0.1몰 PBS의 두 부피로 재현탁하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 다시, 샘플을 원심분리하고, RBC 펠릿을 0.1 몰 PBS의 1 부피로 재현탁하기 전에 상청액을 제거한다. 현미경 슬라이드에 샘플 ID와 적용된 항체를 알코올 내성 펜으로 표시합니다.준비된 RBC 용액 10 마이크로 리터를 첨가하십시오. 샘플에 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 놓고 샘플을 슬라이드를 따라 고르게 분산시킵니다. 5-7초 동안 일정한 움직임으로 샘플을 분젠 버너 위로 가져가서 슬라이드를 열 고정합니다.면역조직화학 염색의 경우 그리스 연필을 사용하여 슬라이드의 2/3 영역을 테스트로, 1/3 영역을 대조군으로 표시합니다. 그런 다음 30초 동안 TBS를 적용하여 샘플 영역을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 0.1% 트립신을 넣고 뚜껑이 있는 특수 제작된 배양 챔버를 사용하여 슬라이드를 덮습니다.섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 비커에 수돗물을 채우고 비커의 수돗물을 슬라이드에 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻으십시오.최종 세척 후 퍼옥시다아제 차단 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 배양 후 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻습니다. 그런 다음 3% 탈지유 용액을 넣고 30분 동안 배양합니다.배양 후 용액을 붓고 1차 항체 용액을 테스트 영역에 추가합니다. 항체 대조 용액을 대조군에 추가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음날, 항체 용액을 붓고 TBS로 두 부위를 세 번 씻으십시오. 그런 다음 3% 정상 염소 혈청 용액을 첨가하여 비특이적 결합을 방지하고 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 2차 항체 용액을 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다.항체 용액을 붓고 TBS로 해당 부위를 세 번 씻은 후 염색을 진행하십시오. 다음으로, 아비딘 결합 양 고추 냉이 과산화 효소 반응을 수행하기 위해, 희석 된 아비 딘 퍼 옥시다제 용액을 첨가하고 30 분 동안 배양한다. 슬라이드를 200배 배율로 현미경으로 놓고 새로 준비한 DAB 용액을 두 영역에 추가합니다.적혈구의 염색을 지속적으로 모니터링하고 배경이 착색되기 전에 일회용 피펫으로 DAB 용액을 제거하여 염색을 중지합니다. 샘플 탈수를 수행하려면 슬라이드를 유리 랙에 넣고 에탄올 농도를 높이고 마지막으로 자일롤에 각각 5초 동안 담그십시오. 탈수 후 상단에 적혈구가 있는 티슈 페이퍼에 슬라이드를 올려 과도한 액체를 흡수합니다.커버 슬립에 장착 매체를 2-3방울 떨어뜨리고 커버 슬립을 사용하여 슬라이드를 덮습니다. 시각화 및 이미징을 위해 슬라이드를 카메라와 결합된 투과광 현미경에 놓습니다. 광원과 카메라를 켜고 소프트웨어를 시작합니다.Bright-Field Mode(명시야 모드)에서 거칠고 미세한 초점 조정 노브를 돌려 RBC의 초점을 맞춥니다. 마찬가지로 형광 모드에서 RBC의 초점을 맞춥니다. RBC 회색 값을 분석하려면 ImageJ 소프트웨어 내의 Oval Selection Tool을 사용하여 각 RBC의 가장자리를 표시합니다.측정 명령을 사용하여 검정에서 50 적외선과 대조군에서 10 적외선의 회색 값을 측정합니다. RBC 단백질의 면역 형광 염색을 위해, 샘플을 실온에서 30 분 동안 2 차 형광 접합 항체와 함께 배양하여 빛으로부터 보호한다. 배양 후 항체 용액을 붓고 TBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.최종 세척 후 샘플에 TBS를 남겨 둡니다. 샘플을 탈수하고 시연된 대로 현미경 평가를 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 준비합니다. 현미경과 형광등을 켜고 명시야 모드에서 RBC의 초점을 맞춥니다.임의로 선택된 슬라이드의 테스트 영역 중 최소 3개의 별개 영역에서 명시야 및 형광 이미지를 캡처합니다. 형광 이미지의 노출 시간을 1초로 설정하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 명시야 모드로 전환하고 노출 시간을 자동으로 설정한 다음 해당 명시야 이미지를 캡처합니다.이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다. 슬라이드의 제어 영역에서 무작위로 선택된 최소 2개의 별개의 영역에서 형광 및 명시야 이미지를 캡처합니다. 이미지를 TIFF 형식으로 저장하여 픽셀의 원래 회색 값을 유지하고, 압축을 방지하고, 획득의 메타데이터를 전달합니다.캡처된 적혈구의 회색 값을 측정하려면 ImageJ를 엽니다. 타원형 선택 도구로 각 셀을 표시하고 측정 명령을 사용하여 분석합니다. 적혈구가 없는 3개에서 5개 사이의 영역을 강조 표시하고 배경 신호를 측정할 회색 값을 결정합니다.캡처된 이미지의 대체 데이터 분석을 수행하려면 ImageJ의 피지 릴리스를 통해 지정된 이미지의 자동 선택, 배경 보정 및 회색 값 분석을 위한 매크로 명령을 만듭니다. 피지에서 분석할 TIFF 형식 이미지를 엽니다. 그런 다음 RBC 형광을 엽니다.ijm 매크로를 선택하고 실행을 클릭합니다. RBC 산화질소 합성효소(NOS)를 표적으로 하는 항체의 신호는 휴식 시 세린 1177 잔기에서 인산화되고 기계적 힘 노출에 대한 반응으로 면역조직화학 및 면역형광을 모두 사용하여 평가되었습니다. 세린 1177 잔기에서 인산화된 RBC-NOS에 대한 항체의 신호 증가는 면역조직화학적 또는 면역형광법으로 평가했을 때 각각의 전단되지 않은 세포와 비교하여 RBC의 기계적 힘 노출에 대한 반응으로 검출되었습니다.사용자는 항체가 테스트 영역에만 적용되었는지 확인해야 합니다. 그렇지 않으면 대조군이 누락되어 샘플을 분석할 수 없습니다. 다양한 항체의 가용성을 감안할 때 이 방법을 사용하여 다양한 단백질 및 신호 전달 과정을 표적으로 삼을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

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적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

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