AMEBaS: 편광 단일 셀의 비율계량 형광 타임랩스의 자동 정중선 추출 및 배경 빼기

이 방법은 액틴, 이온 또는 소포 역학과 같은 특정 관심 개체에 대해 형광 리포터 또는 염료를 발현하는 정중선을 따라 편광된 세포의 시공간 역학을 정량화합니다. 자동화 버전은 편향을 제거하고 확장성을 허용하며, 특히 디지털 방식으로 수동으로 수행되고 시간이 많이 걸리고 주관적일 수 있는 작업에 대해 확장성을 허용합니다. 시작하려면 Jupyter Notebook을 열고 Google CoLab 대화형 노트북 홈페이지에 액세스하거나 GitHub에서 AMEBaS_local IP YNB를 다운로드하여 열어 타임랩스 파일을 읽습니다.

로컬 버전을 사용하여 입력 및 출력 데이터에 대한 디렉터리 설정을 준비하려면 형광 타임랩스를 프로그램의 루트 폴더에 있는 data라는 폴더 안에 TIF 또는 DV 파일로 배치합니다. 생성된 데이터를 수신할 out 폴더를 만든 다음, setup code block을 실행합니다. Google CoLab에서 노트북을 사용하는 경우 설정 코드 블록을 실행하여 데이터 및 출력 폴더를 자동으로 생성한 다음 파일 입력 코드 블록을 실행하여 재생 버튼을 클릭하여 타임랩스 데이터를 읽습니다.

Google CoLab을 사용하는 경우 파일 선택 버튼을 클릭하여 타임랩스 파일을 데이터 폴더에 업로드합니다. 그런 다음 verbose 매개 변수를 true 또는 false로 설정하여 각 단계에 대한 추가 출력을 생성하도록 선택합니다. 배경에서 기본 셀과 세그먼트를 감지하려면 재생 버튼을 클릭하여 단일 셀 분할 코드 블록을 실행하여 관심 있는 셀을 배경에서 자동으로 분리하십시오.

sigma 변수의 시그마 값을 조정하여 분할 마스크의 매끄러움을 미세 조정합니다. 기본값은 2.0입니다. 이제 ISO 데이터에서 직접 추정된 임계값을 저장하려면 변수 estimate를 false로 설정하고, 로컬 다항식 회귀를 사용하여 인접 프레임에서 임계값을 평활화하려면 true로 설정합니다.

n_points 변수를 조정하여 디폴트 값이 40인 함수를 미세 조정합니다. 셀 확장을 따라 정중선을 추적하려면 재생 버튼을 클릭하여 셀 정중선 추적 code 블록을 실행하여 Lee의 방법을 사용하여 셀을 골격화하고 선형 외삽을 통해 마지막 골격의 끝을 확장합니다. 그런 다음 마지막 프레임에서 또는 프레임당 한 번씩 추적하도록 complete_skeletonization 인수를 조정하여 중간선에 대한 추적 옵션을 선택합니다.

interpolation_fraction 변수를 조정하여 외삽 중 보간을 위해 스켈레톤에서 점의 비율을 설정합니다. 기본값은 0.25입니다. 다음으로, extrapolation_length 변수를 수정하여 중간선 외삽의 길이를 결정합니다.

기본값은 마이너스 1이며, 이 경우 골격이 가장 가까운 가장자리까지 확장됩니다. 이제 재생 버튼을 클릭하여 첫 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 두 채널에 대한 카이모그래프가 자동으로 생성됩니다. kymograph_kernel 변수를 조정하여 평활화할 가우스 커널 크기를 선택합니다.

확장되지 않은 스켈레톤의 강도를 제대로 표시하려면 캡핑된 카이모그래프에 대한 사용자 정의 색상 맵이 필요합니다. shift_fraction 변수를 조정하여 배경색인 검은색으로 지정될 강도의 분수 백분율을 선택합니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 두 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하여 비율 메트릭 카이모그래프와 타임랩스를 자동으로 생성합니다.

switch_ratio 변수를 조정하여 비율 계산 중에 분자와 분모로 사용되는 채널의 순서를 변경하며, 디폴트 값은 false입니다. 비율 타임랩스에 smooth_ratio 변수를 조정하여 중앙값 필터 패스로 추가 평활화가 필요한지 확인합니다. 기본적으로 false로 설정되어 있습니다.

다음으로, reject_outliers 변수를 조정하여 분모 채널의 낮은 신호로 인한 이상값을 제거하거나 유지하도록 선택합니다. 이상치는 세 번째 사분위수 위의 사분위수 범위의 1.5배 값으로 표시됩니다. 마지막으로, 변수 background_ratio를 조정하여 배경 및 비율 메트릭 출력을 내보내야 하는지 여부를 선택합니다.

기본값은 배경을 0으로 바꾸는 false입니다. 칼슘 리포터 카멜레온을 발현하는 꽃가루 튜브, pH 지시약 플로린을 발현하는 꽃가루 튜브, 칼슘 리포터 NESYC 3.6을 발현하는 뿌리 털과 같은 데이터 세트에서 테스트한 AMEBaS는 성장 방향, 이미징 기술, 형광 리포터 및 세포 유형의 차이에도 불구하고 성공적으로 작동했습니다. 필요한 패키지를 설치할 수 있도록 블록 세트를 실행하는 것을 잊지 마십시오.

또한 보다 정확한 결과를 얻을 수 있도록 이미지에 맞게 시그마 값을 조정하는 것이 중요합니다. 그런 다음 결과 카이모그래프를 사용하여 관심 풀이의 시공간 역학을 분석할 수 있습니다. 또한 올바른 솔루션을 분석하기 위해 찾기 방법, 성장 및 시계열을 계산할 수 있습니다.