AMEBaS: 편광 단일 셀의 비율계량 형광 타임랩스의 자동 정중선 추출 및 배경 빼기
2023년 6월 23일
편광된 단일 세포의 세포 내 역학을 분석하는 현재의 방법은 종종 수동이며 표준화가 부족합니다. 이 원고는 사용자 친화적인 온라인 인터페이스에서 단일 편광 세포의 정중선 추출을 자동화하고 시간 경과로 인한 시공간 거동을 정량화하기 위한 새로운 이미지 분석 파이프라인을 소개합니다.
이 방법은 액틴, 이온 또는 소포 역학과 같은 특정 관심 개체에 대해 형광 리포터 또는 염료를 발현하는 정중선을 따라 편광된 세포의 시공간 역학을 정량화합니다. 자동화 버전은 편향을 제거하고 확장성을 허용하며, 특히 디지털 방식으로 수동으로 수행되고 시간이 많이 걸리고 주관적일 수 있는 작업에 대해 확장성을 허용합니다. 시작하려면 Jupyter Notebook을 열고 Google CoLab 대화형 노트북 홈페이지에 액세스하거나 GitHub에서 AMEBaS_local IP YNB를 다운로드하여 열어 타임랩스 파일을 읽습니다.
로컬 버전을 사용하여 입력 및 출력 데이터에 대한 디렉터리 설정을 준비하려면 형광 타임랩스를 프로그램의 루트 폴더에 있는 data라는 폴더 안에 TIF 또는 DV 파일로 배치합니다. 생성된 데이터를 수신할 out 폴더를 만든 다음, setup code block을 실행합니다. Google CoLab에서 노트북을 사용하는 경우 설정 코드 블록을 실행하여 데이터 및 출력 폴더를 자동으로 생성한 다음 파일 입력 코드 블록을 실행하여 재생 버튼을 클릭하여 타임랩스 데이터를 읽습니다.
Google CoLab을 사용하는 경우 파일 선택 버튼을 클릭하여 타임랩스 파일을 데이터 폴더에 업로드합니다. 그런 다음 verbose 매개 변수를 true 또는 false로 설정하여 각 단계에 대한 추가 출력을 생성하도록 선택합니다. 배경에서 기본 셀과 세그먼트를 감지하려면 재생 버튼을 클릭하여 단일 셀 분할 코드 블록을 실행하여 관심 있는 셀을 배경에서 자동으로 분리하십시오.
sigma 변수의 시그마 값을 조정하여 분할 마스크의 매끄러움을 미세 조정합니다. 기본값은 2.0입니다. 이제 ISO 데이터에서 직접 추정된 임계값을 저장하려면 변수 estimate를 false로 설정하고, 로컬 다항식 회귀를 사용하여 인접 프레임에서 임계값을 평활화하려면 true로 설정합니다.
n_points 변수를 조정하여 디폴트 값이 40인 함수를 미세 조정합니다. 셀 확장을 따라 정중선을 추적하려면 재생 버튼을 클릭하여 셀 정중선 추적 code 블록을 실행하여 Lee의 방법을 사용하여 셀을 골격화하고 선형 외삽을 통해 마지막 골격의 끝을 확장합니다. 그런 다음 마지막 프레임에서 또는 프레임당 한 번씩 추적하도록 complete_skeletonization 인수를 조정하여 중간선에 대한 추적 옵션을 선택합니다.
interpolation_fraction 변수를 조정하여 외삽 중 보간을 위해 스켈레톤에서 점의 비율을 설정합니다. 기본값은 0.25입니다. 다음으로, extrapolation_length 변수를 수정하여 중간선 외삽의 길이를 결정합니다.
기본값은 마이너스 1이며, 이 경우 골격이 가장 가까운 가장자리까지 확장됩니다. 이제 재생 버튼을 클릭하여 첫 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 두 채널에 대한 카이모그래프가 자동으로 생성됩니다. kymograph_kernel 변수를 조정하여 평활화할 가우스 커널 크기를 선택합니다.
확장되지 않은 스켈레톤의 강도를 제대로 표시하려면 캡핑된 카이모그래프에 대한 사용자 정의 색상 맵이 필요합니다. shift_fraction 변수를 조정하여 배경색인 검은색으로 지정될 강도의 분수 백분율을 선택합니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 두 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하여 비율 메트릭 카이모그래프와 타임랩스를 자동으로 생성합니다.
switch_ratio 변수를 조정하여 비율 계산 중에 분자와 분모로 사용되는 채널의 순서를 변경하며, 디폴트 값은 false입니다. 비율 타임랩스에 smooth_ratio 변수를 조정하여 중앙값 필터 패스로 추가 평활화가 필요한지 확인합니다. 기본적으로 false로 설정되어 있습니다.
다음으로, reject_outliers 변수를 조정하여 분모 채널의 낮은 신호로 인한 이상값을 제거하거나 유지하도록 선택합니다. 이상치는 세 번째 사분위수 위의 사분위수 범위의 1.5배 값으로 표시됩니다. 마지막으로, 변수 background_ratio를 조정하여 배경 및 비율 메트릭 출력을 내보내야 하는지 여부를 선택합니다.
기본값은 배경을 0으로 바꾸는 false입니다. 칼슘 리포터 카멜레온을 발현하는 꽃가루 튜브, pH 지시약 플로린을 발현하는 꽃가루 튜브, 칼슘 리포터 NESYC 3.6을 발현하는 뿌리 털과 같은 데이터 세트에서 테스트한 AMEBaS는 성장 방향, 이미징 기술, 형광 리포터 및 세포 유형의 차이에도 불구하고 성공적으로 작동했습니다. 필요한 패키지를 설치할 수 있도록 블록 세트를 실행하는 것을 잊지 마십시오.
또한 보다 정확한 결과를 얻을 수 있도록 이미지에 맞게 시그마 값을 조정하는 것이 중요합니다. 그런 다음 결과 카이모그래프를 사용하여 관심 풀이의 시공간 역학을 분석할 수 있습니다. 또한 올바른 솔루션을 분석하기 위해 찾기 방법, 성장 및 시계열을 계산할 수 있습니다.
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개요
이 원고는 편광된 단일 세포의 중선 추출을 자동화하고 그들의 시공간 거동을 정량화하도록 설계된 새로운 이미지 분석 파이프라인을 제시합니다. 사용자 친화적인 온라인 인터페이스는 시간 경과 데이터 분석을 강화하여 수동 방법의 한계를 해결합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 역학
- 이미지 분석
- 형광 이미징
배경
- 편광된 세포를 분석하는 현재 방법은 종종 수동입니다.
- 수동 분석은 편견을 도입할 수 있으며 시간이 많이 소요됩니다.
- 이미지 분석의 자동화는 확장성과 표준화를 개선할 수 있습니다.
- 이 연구는 이 과정을 간소화하기 위한 새로운 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- 편광된 세포의 중선 추출을 자동화합니다.
- 시간 경과 이미징으로부터 시공간 역학을 정량화합니다.
- 연구자들을 위한 사용자 친화적인 인터페이스를 제공합니다.
사용된 방법
- 데이터 분석을 위한 Jupyter Notebook의 활용.
- Google CoLab 또는 로컬 설정을 통한 시간 경과 파일 액세스.
- 데이터 관리를 위한 입력 및 출력 디렉토리 준비.
- 데이터 처리를 위한 설정 및 파일 입력 코드 블록 실행.
주요 결과
- 이 방법은 편광된 세포의 역학을 효과적으로 정량화합니다.
- 자동화는 분석의 주관적인 편견을 줄입니다.
- 확장성은 더 큰 데이터 세트를 효율적으로 처리할 수 있게 합니다.
- 결과는 인터페이스를 통해 시각화 및 해석할 수 있습니다.
결론
- 제안된 파이프라인은 편광된 세포 역학 분석을 강화합니다.
- 이는 이미지 분석에 표준화된 접근 방식을 제공합니다.
- 이 방법은 세포 연구의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Automated midline extraction and background subtraction for ratiometric fluorescence time-lapse imaging addresses a critical bottleneck in quantifying spatiotemporal dynamics of polarized single cells. By eliminating manual tracing and arbitrary background correction, AMEBaS enhances predictive confidence and reproducibility in early discovery and target validation workflows. This capability supports robust, scalable analysis of intracellular signaling and morphological dynamics relevant to cell polarity and disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased quantification of intracellular dynamics along the cell midline for hypothesis-driven studies.
- Reduces operator bias and subjectivity in spatial analysis of cell polarity markers.
- Supports mechanistic de-risking by providing standardized, quantitative outputs for pathway interrogation.
- Facilitates portfolio triage by enabling comparative analysis across cell types and experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible kymographs and ratiometric profiles for downstream screening workflows.
- Standardizes background subtraction and midline tracing, improving assay reproducibility and scalability.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of compound effects on polarized cell dynamics.
- Supports platform reuse across diverse fluorescent reporters and imaging modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative imaging outputs with disease-relevant models of cell polarity and migration.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical validation of cellular phenotypes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative cellular readouts.
- Supports translational biomarker development by quantifying dynamic cellular processes.
Pipeline & Workflow Integration
AMEBaS integrates into the discovery-to-preclinical continuum by automating quantitative imaging analysis for polarized single cells, supporting workflows from early hypothesis testing to lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Automates hypothesis testing and pathway clarification by extracting unbiased spatiotemporal profiles.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative kymographs and ratiometric outputs for assay development.
- Analytics: Provides standardized measurements and statistical outputs for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model validation for disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable computational pipeline adaptable to multiple cell types and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell polarity studies.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative imaging analysis across teams and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, unbiased data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting cell polarity mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and computational analysis for optimal parameter adjustment.
- Needs access to Jupyter Notebook or Google CoLab environments and compatible imaging file formats.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data management practices.
- Adaptable to various cell types, fluorescent reporters, and imaging modalities with parameter tuning.
- Dependent on image quality and appropriate segmentation for accurate midline extraction and quantification.
