Name: 반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 학습하세요 광조사 기법을 활용한 임상 샘플의 자가형광 감소 및 면역세포 공간 분석 방법을. 이 프로토콜은 폐 조직의 결핵균 및 다양한 병리에서 면역세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.3% 트리톤-X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td>버퍼 차단용 솔루션</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4503</td><td>버퍼 차단용 솔루션</td></tr><tr><td>1% 인간 BD Fc 블록</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>564220</td><td>버퍼 차단에 필요한 Fc 블록</td></tr><tr><td>150W LED 램프</td><td>아마존</td><td>B07VH3CVSF</td><td>조직 광조사용 LED 광원</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>깁코</td><td>10010-023</td><td>버퍼 및 세척 단계를 차단하기 위한 솔루션</td></tr><tr><td>20갤런 저장 용기</td><td>아마존</td><td>B001B1C4G0</td><td>광조사 공정용 용기</td></tr><tr><td>40W RGBW 투광 LED 램프&nbsp;</td><td>아마존</td><td>B08QFPJSMD</td><td>조직 광조사용 RGB 광원</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>아브캠</td><td>AB43019/NA</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>알파 평활근 액틴 DyLight 755</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>아비딘/비오틴 차단 키트</td><td>아브캠</td><td>AB64212</td><td>아비딘 및 비오틴 차단 용액</td></tr><tr><td>BD 사이토픽스/사이토퍼름</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>554714</td><td>고정 솔루션</td></tr><tr><td>BOND 탈랍 솔루션</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NC0221076</td><td>탈파라핀화 용액</td></tr><tr><td>BOND 에피토프 회출 솔루션 1</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NC0235529</td><td>구연산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액(ER1)</td></tr><tr><td>BOND 에피토프 회출 솔루션 2</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NC0235530</td><td>EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)</td></tr><tr><td>BOND 연구 탐지 시스템</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NC0396648</td><td>자동 연구용 염색 시약</td></tr><tr><td>BOND RX 연구 염색기</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NA</td><td>자동화된 연구용 염색 플랫폼</td></tr><tr><td>BOND 워시 솔루션</td><td>라이카 바이오시스템즈</td><td>NC0221077</td><td>세척 완충액</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>347420/AB_400298</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>CD20 e플루어 660</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>CD4 알렉사 플루어 488</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>CD45 피코에리트린(PE)</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>CD68 아이플루어 594</td><td>카프리코 바이오테크놀로지</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>EasyDip 염색 시스템</td><td>신규 공급</td><td>5300킷</td><td>슬라이드 염색 시스템</td></tr><tr><td>플루오로마운트-G</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>00-4958-02</td><td>마운팅 미디어</td></tr><tr><td>회크스트</td><td>생물 유통</td><td>40046</td><td>IBEX 이미징을 위한 핵 염색. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Imaris 파일 변환기 x64 10.2.0</td><td>이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트</td><td></td><td>무료 파일 변환기</td></tr><tr><td>ImarisViewer 소프트웨어 x64 10.2.0</td><td>이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트</td><td></td><td>무료 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImmEdge 펜</td><td>벡터 연구소</td><td>H-4000</td><td>소수성 배리어 펜</td></tr><tr><td>수소화붕리튬(1g)</td><td>STREM 화학</td><td>93-0397</td><td>염료 비활성화용 화학 물질, 이 화학 물질의 작은 분취량(1g)을 구입하십시오.</td></tr><tr><td>루미칸 비오틴</td><td>R& D 시스템</td><td>BAF2846</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>유리 슬라이드 커버</td></tr><tr><td>범사이토케라틴 알렉사 플루어 750</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>PELCO BioWave Pro 마이크로파 시스템</td><td>테드 펠라 Inc</td><td>36500-230</td><td>비가열 과학 전자레인지</td></tr><tr><td>PELCO 스테디템프 프로</td><td>테드 펠라 Inc</td><td>50062</td><td>과학용 전자레인지를 위한 완전 자동화된 온도 제어</td></tr><tr><td>심플이케이</td><td>오픈 소스 소프트웨어</td><td></td><td>등록 및 채널 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 알렉사 플루어 594</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>S11227</td><td>IBEX 이미징용 라벨링 시약. 표 1을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>광시야 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td>NA</td><td>LED8 광원과 LAS X 소프트웨어(3.7.1.21655)가 있는 라이카 마이크로시스템즈 THUNDER 이미저. 형광 이미징의 경우, 외부 필터 휠(PN: 11536075)과 2개의 추가 단일 대역 필터(PN: 8118215)가 있는 맞춤형 쿼드 밴드 필터를 사용하여 패스당 7개의 염료 채널을 이미지화했습니다. 필터 여기, 이색성 및 방출선은 (1) 쿼드 밴드 큐브: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31에서 이색성, 여기 또는 방출 필터 없음; (2) 외부 필터 휠 위치 1: 434/32, 위치 2: 520/40, 위치 3: 585/20, 위치 4: 720/60, 위치 5: 통과; (3) 단일 대역 1&mdash; 585/22 여기, 594 이색성, 625/30 방출; (4) 단일 대역 2&mdash; 635/20 여기, 647 이색성, 667/30 방출.</td></tr><tr><td>Zeiss 광학 렌즈 클리너</td><td>아마존</td><td>B00GPVQVCO</td><td>현미경 대물 렌즈 클리너</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>아브캠</td><td>AB43019</td><td>다클론 토끼 IgG, 주기 1</td></tr><tr><td>알파 평활근 액틴 DyLight 755</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, 사이클 1</td></tr><tr><td>CD4 알렉사 플루어 488</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB8165G</td><td>다클론 염소 IgG, 주기 1</td></tr><tr><td>CD8 알렉사 플루어 647</td><td>바이오레전드</td><td>372906</td><td>C8/144B, 사이클 1</td></tr><tr><td>CD68 아이플루어 594</td><td>카프리코 바이오테크놀로지</td><td>1064135</td><td>KP1, 주기 1</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32814</td><td>다클론 당나귀, 주기 1</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32787</td><td>다클론 당나귀, 주기 1</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32794</td><td>다클론 당나귀, 주기 1</td></tr><tr><td>회크스트</td><td>생물 유통</td><td>40046</td><td>핵 라벨, 사이클 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>347420</td><td>MMA, 사이클 2</td></tr><tr><td>CD20 e플루어 660</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>50-0202-82</td><td>L26, 주기 2</td></tr><tr><td>CD45 피코에리트린(PE)</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, 사이클 2</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>715-545-020</td><td>다클론 당나귀, 주기 2</td></tr><tr><td>루미칸 비오틴</td><td>R& D 시스템</td><td>BAF2846</td><td>다클론 염소 IgG, 주기 2</td></tr><tr><td>범사이토케라틴 알렉사 플루어 750</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, 사이클 2</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 알렉사 플루어 594</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>S11227</td><td>N/A, 주기 2</td></tr><tr><td>회크스트</td><td>생물 유통</td><td>40046</td><td>주기 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼(주기 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td>0.3% 부피 기준</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4503</td><td>부피 기준 1%</td></tr><tr><td>인간 BD Fc 블록</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>564220</td><td>부피 기준 1%</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>깁코</td><td>10010-023</td><td>97.7% (부피 기준)</td></tr><tr><td><강>1차 항체 염색액 #1(사이클 1)</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼(주기 1)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>회크스트</td><td>생물 유통</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>바이오레전드</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td>1차 항체 염색 용액 #2(사이클 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼(주기 1)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; AF488</td><td>R& D 시스템</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>아브캠</td><td>AB43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td><강함>2차 항체 염색액 #1(사이클 1)</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼(주기 1)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 AF 플러스 488</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 AF 플러스 555</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 AF 플러스 647</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td><강함>1차 항체 염색액 #3(사이클 1)</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차단 버퍼(주기 1)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>카프리코 바이오테크놀로지</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>BSA 프리 차단 완충액(사이클 2)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td>0.3% 부피 기준</td></tr><tr><td>인간 BD Fc 블록</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>564220</td><td>부피 기준 1%</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>깁코</td><td>10010-023</td><td>98.7% (부피 기준)</td></tr><tr><td><강함>1차 항체 염색액 #4(사이클 2)</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>루미칸 비오틴</td><td>R& D 시스템</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 e플루어 660</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>범사이토케라틴 AF750</td><td>노부스 바이오로제스</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td><강>2차 항체 염색액 #2(사이클 2)</강함></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)</td><td>위 참조</td><td></td><td>항체 추가 후 볼륨까지 보충</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgM AF488</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>스트레파비딘 AF594</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

multiplexed antibody-based imaging panel을 설계하려면 상당한 시간, 노력 및 자원이 필요합니다12. 이러한 문제는 여기에 설명된 대로 고자가형광 조직에서 보관된 FFPE 샘플에 대한 패널을 설계할 때 특히 두드러집니다(그림 1). 이러한 문제를 극복하기 위해 먼저 dye inactivation 프로토콜과 호환되는 가장 밝은 형광단을 식별했습니다(표 1). 예를 들어, Alexa Fluor Plus 2차 항체는 Alexa Fluor 항체에 비해 면역형광 분석에서 신호 대 잡음비가 4배 더 높은 것으로 보고되었습니다(출처: AF Plus 제품 데이터 시트). 둘째, 밝은 형광단을 발현이 낮은 마커와 짝을 이루고, 가능할 때마다 1차 및 2차 항체 또는 스트렙타비딘-비오틴을 사용한 간접 면역 표지를 사용하여 신호를 증폭했습니다(표 1). 셋째, 자...

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

자세한 프로토콜 6-마커 멀티플렉스 면역 형광 패널 최적화 수행 위한 더 일관 된 결과를 짧은 절차 시간 자동된 염색기를 사용. 이 방법은 종양 면역 연구에 대 한 모든 실험실에 의해 직접 적응 될 수 있다.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.

수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

여기에서는 상업적으로 이용 가능한 자동 조직 염색기를 활용하는 IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplicity) 방법의 적용과 티라마이드 신호 증폭 기반 시약 사용에 대한 최적화 고려 사항을 설명합니다.

반복적 표백은 핵심 시설에 염색 자동화를 사용하여 다양성을 확장합니다.

이 논문에서는 복막 전이의 3차원 구조를 특성화하기 위해 최적화된 다중 면역형광 프로토콜에 대해 설명합니다.

Iterative Bleaching Extends Multiplexity 접근법을 사용한 종양 함유 조직의 3차원 이미징

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

학습하세요 광조사 기법을 활용한 임상 샘플의 자가형광 감소 및 면역세포 공간 분석 방법을. 이 프로토콜은 폐 조직의 결핵균 및 다양한 병리에서 면역세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

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