반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

[해설자] Nature Methods의 2024년 올해의 방법으로 선정된 공간 단백질체학을 사용하여 세포-세포 상호 작용과 함께 면역 세포의 정확한 위치를 조직 내에서 매핑할 수 있습니다. 이는 임상 결과와 관련된 공간적 패턴을 보여줍니다. 내인성 형광이 높은 복잡한 항체 패널과 이미징 조직을 구축하는 것은 IBEX 및 기타 형광 현미경 기술에 상당한 시간, 자원 및 전문 지식 과제를 제시합니다. IBEX를 사용하여 고위험 여포성 림프종 환자와 Human Cell Atlas 동료들과 함께 종양 특이적 특징을 확인했습니다. 인간 흉선의 포괄적인 공간 지도가 만들어졌습니다. 다양한 마이코박테리아 폐 병리에 걸친 면역 세포 구성, 공간적 상호 작용 및 사이토카인 생산 차이에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이 프로토콜은 이러한 격차를 해소합니다. 이 프로토콜은 공간 분석을 위한 항체 신호를 보존하면서 특히 어려운 FFPE 샘플에서 광범위한 스펙트럼 조직 자가형광을 크게 줄이기 위해 저비용의 적응형 광조사 방법을 제공합니다. 시작하려면 항원 회수를 완료한 후 PBS에 조직이 있는 슬라이드를 담그십시오. PBS에서 슬라이드 하나를 제거하고 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 조직을 건드리지 않고 여분의 완충액을 모두 조심스럽게 건조시킵니다. 소수성 펜으로 슬라이드의 조직 섹션 주위에 테두리를 그립니다. 나머지 슬라이드에 대해 이 과정을 반복한 후 소수성 장벽을 10분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 조직을 직접 건드리지 않고 조직 절편에서 PBS를 흡수합니다. 이제 슬라이드에 200마이크로리터의 차단 완충액을 추가하고 수분 챔버를 닫습니다. 온도 조절 메커니즘이 있는 비가열 과학 전자레인지에 챔버를 넣고 이전에 설정된 프로그램을 5주기 실행합니다. 블로킹 인큐베이션 동안 후크가 있는 1차 항체 염색 용액 1과 Fc 블록을 포함하는 블로킹 완충액을 준비합니다. 항체를 결합하고 칵테일을 부드럽게 섞습니다. 전자레인지 사이클이 완료되면 슬라이드 챔버를 제거하고 열고 조직에 닿지 않고 슬라이드에서 차단 완충액을 흡수합니다. 다음으로, 200마이크로리터의 1차 항체 염색 용액 1을 슬라이드에 추가합니다. 챔버를 전자레인지로 되돌리고 약 30분 동안 1차 항체 프로그램을 다시 실행합니다. 1차 항체 라벨링이 완료되면 슬라이드를 수직으로 잡습니다. 슬라이드를 세척하려면 1,000마이크로리터의 PBS를 조직에 피펫팅하여 흘러내립니다. 여분의 PBS를 흡수하고 습도 챔버에서 실온에서 10분 동안 1% 파라포름알데히드로 슬라이드를 고정합니다. 고정 후 슬라이드를 1,000마이크로리터의 PBS로 3-5회 철저히 세척하고 광조사 단계까지 조직에 PBS 층을 남겨둡니다. 광조사 상자를 준비하려면 150와트 LED 램프, 40와트 RGBW 투광 LED 램프, 75.71리터 이상의 대형 플라스틱 용기, 신선한 PBS, 페트리 접시를 준비합니다. 이제 페트리 접시에 1x PBS를 채워 슬라이드를 완전히 잠깁니다. 램프의 열을 최소화하기 위해 차가운 방에서 광조사 절차를 수행하십시오. 그런 다음 슬라이드를 페트리 접시에 놓고 PBS에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 그런 다음 40와트 램프 페트리 접시 바로 위에 광원이 슬라이드 쪽을 향하도록 하고 램프를 빨간색 조명 모드로 설정합니다. 마지막으로 150와트와 40와트 램프를 모두 켜고 플라스틱 용기 뚜껑으로 전체 설정을 덮습니다. 2시간 후 램프를 녹색 조명으로 전환하고 16시간 동안 배양합니다. 염료 비활성화 프로토콜과 호환되는 가장 밝은 형광단을 식별하고 신호 검출을 향상시키기 위해 저발현 마커와 짝을 이뤘습니다. 자가형광은 광조사 후 더 긴 이미징 파장에서 크게 감소했습니다. 고도로 발현된 구조 마커인 알파-평활근 액틴 및 범 사이토케라틴을 표적으로 하는 직접 접합 항체는 750나노미터의 근적외선 채널에서 대체되었습니다. 배경 신호는 염색되지 않은 참조 이미지와 SimpleITK 산술을 사용하여 계산적으로 뺄 수 있으며 실제 신호는 임계값을 통해 향상되었습니다. IBEX 염색 절편의 전체 슬라이드 영상에서 괴사성 코어와 CD15 양성 호중구가 있는 육아종이 나타났습니다. 결핵균 또는 비결핵성 마이코박테리아는 항항원 85B 항체를 사용하여 육아종 괴사 코어 근처에서 검출되었습니다. 육아종 관련 림프 조직에는 폐의 모든 면역 세포에 대한 CD20 양성 B 세포, CD4 양성 T 세포, 소수의 CD8 양성 T 세포 및 CD45 표지가 포함되어 있습니다. IBEX 이미징은 또한 기관지 상피 세포, 동맥 평활근 및 CD68 양성 대식세포를 포함한 폐 해부학적 특징을 시각화할 수 있게 했습니다.