Name: In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 학습하세요 MoClo를 사용한 다시스트론 전사 단위 조립 방법을 In-Cloning 툴킷으로 표준화된 분자 부품을 활용하여 유연한 유전자 배열을 구현하는 이 프로토콜은 연구자들에게 유용한 도구를 제공합니다.

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<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
<li>Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+design+of+synthetic+ribosome+binding+sites+to+control+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>암피실린</td><td>머크 생명과학</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>박테리아 한천</td><td>피셔 사이언티픽 &nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BBSI-HF</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coliDH5&alpha; 유능한 세포들</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에펜도르프와 nbsp; 마스터사이클러&nbsp; 넥서스 열 사이클러</td><td>에펜도르프</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>EzDrop 1000 마이크로 볼륨 분광광도계</td><td>블루레이 바이오텍</td><td>브레드-1000</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 플라스미드 미니프렙 키트</td><td>써모 사이언티픽</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>인- & 아웃- 클론 도구 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>리가제 버퍼</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>나클</td><td>피셔 사이언티픽 &nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>뉴브런즈윅 이노바 & 그리고 nbsp; 42/42R - 스택 가능한 인큐베이터 셰이커</td><td>에펜도르프</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>페노부스+</td><td>가수 악기</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>사프리</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신</td><td>머크 생명과학</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>표준 실험실 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리아제</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>서몰믹스 MM</td><td>B. 브라운 바이오테크 인터내셔널</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>피셔 사이언티픽 &nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>피셔 사이언티픽 &nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

in-cloning 툴킷을 사용한 moclo(polycistronic operons with modular cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

standardized-modular-assembly-polycistronic-operons-with-modular

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

맞춤형 플라스미드의 합성은 노동과 시간이 많이 소요됩니다. 이 프로토콜은 맞춤형 DNA 클로닝 절차의 작업과 기간을 줄이기 위해 Gibson 어셈블리 클로닝을 사용하는 방법을 설명합니다. 설명된 프로토콜은 또한 기존의 cut-and-paste DNA 클로닝과 유사한 비용으로 포유류 발현을 위한 신뢰할 수 있는 태그가 지정된 단백질 구조를 생성합니다.

플라스미드 벡터를 생성 깁슨 어셈블리를 사용하여 인간의 신장 요인-1α의 발기인의 규정에 따라 FLAG-태그 단백질을 표현

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

적응형 Gibson Assembly 분자 복제 모듈은 분자 생물학 실험실 과정 학생들을 위한 과정 기반 CURE(학부 연구 경험) 형식으로 사용되었습니다. 학생 학습 결과에 대한 평가는 CURE 완료 후 분자 복제에 대한 이해와 자신감이 향상되었음을 보여주었으며 천연물 생합성 연구를 위해 새로운 플라스미드를 복제했습니다.

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

학습하세요 MoClo를 사용한 다시스트론 전사 단위 조립 방법을 In-Cloning 툴킷으로 표준화된 분자 부품을 활용하여 유연한 유전자 배열을 구현하는 이 프로토콜은 연구자들에게 유용한 도구를 제공합니다.

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

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