In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

저는 작은 개별 분자 조각부터 염색체 크기의 구조체까지 모듈식 DNA 조립을 가능하게 하고, 이러한 인공 염색체로 세포를 재프로그래밍하는 방법을 개발했습니다. 이 분야의 중요한 혁신 중 하나는 표준화된 분자 부품 라이브러리에서 다중 유전자 구조물을 모듈화하여 조립할 수 있는 모듈식 클로닝 툴킷의 개발입니다. 모듈식 클로닝 툴킷은 일반적으로 모노시스트로닉 전사 단위를 복제하도록 설계되었습니다.

이 프로토콜은 인클로닝 툴킷과 함께 폴리시스트로닉 전사 단위를 조립하는 일반화 방법을 보여줍니다. 폴리시스트로닉 전사 유닛을 복제하는 이 전략은 코딩 서열이 개별 전사 단위나 폴리시스트로닉 배열에서 유연하게 사용될 수 있게 합니다. 시작하려면, 전사 단위로 조립할 레벨 0 부품을 선택합니다.

이 조건에는 최소한 RBS, 코딩 시퀀스, 그리고 종말기가 포함되어야 합니다. 전사 단위가 오페론에서 조립될 위치를 선택하세요. 선택한 위치에 따라 해당 수용체 플라스미드를 선택하고 SnapGene에서 골든 게이트 조립을 시뮬레이션합니다.

골든 게이트 반응에서는 효소 SAP1을 사용해 각각의 플라스미드에서 리보솜 결합 부위, 코딩 서열, 종단자를 방출하고 수용체 플라스미드를 절단합니다. 리보솜 결합 부위, 코딩 서열, 그리고 종단자를 절단된 수용체 플라스미드에 조립합니다. 다음으로 골든 게이트 반응에서는 피펫을 사용해 원하는 삽입물별 펨토몰 50개와 수용체 플라스미드 50개의 펨톨몰을 추가합니다.

반응관에 각각 10개의 T4 DNA 리가아제 버퍼, T4 리가아제, SAP1을 각각 1마이크로리터씩 투여합니다. 그 다음 핵효소 없는 물을 넣어 최종 부피를 10마이크로리터로 만듭니다. 튜브를 열사이클러에 넣으세요.

37도에서 3분, 16도에서 4분, 50도에서 20분간 25주기 반복하세요. 그 후 효소를 80도에서 20분간 가열해 비활성화합니다. 선택적으로 SAP1 0.5마이크로리터를 GG 반응에 피펫팅하고 37도 섭씨에서 1시간 배큐하는 방법도 있습니다.

반응 혼합물 5마이크로리터를 화학적으로 적합한 대장균 세포 50마이크로리터에 피펫팅합니다. 튜브를 42도 섭씨의 물에 30초간 담근 후 2분간 얼음 위에 올려놓는 열충격 변환을 수행합니다. 다음으로, 세포를 1밀리리터 배지에 1시간 동안 배양하여 회복을 돕습니다.

100마이크로리터의 변형 성장 물질을 100마이크로리터 암피실린이 들어 있는 LB 오거 플레이트에 플레이트링합니다. 플레이트를 37도 섭씨에서 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 접종 루프나 피펫 팁을 사용해 흰색 군락 두 개를 뽑으세요.

각 1밀리리터당 100마이크로그램의 암피실린이 포함된 LB 배지 5밀리리터에 접종하세요. 분당 250회전으로 진동하는 인큐베이터에서 37도 섭씨에서 하룻밤 배양하세요. 제조사의 지침에 따라 격자무늬 추출을 하세요.

추출한 혈장 DNA 1마이크로그램을 10배 소화 완충제 1마이크로리터와 BBS1 1마이크로리터를 첨가하여 소화합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 총 부피 10마이크로리터로 만들고 배큐합니다. 이제 소화된 플라스미드를 1% 아가로스 젤에 적재하고 100볼트로 35분간 전기영동을 합니다.

그 후 젤을 영상화하여 플라스미드의 올바른 조립 방식을 확인합니다. 레벨 M 구성 요소를 조립하려면 조립할 레벨 1 전사 단위를 선택하세요. BBS1 효소를 사용해 1, 2차 전사 단위와 엔드 링커를 방출하여 골든 게이트 조립을 시뮬레이션합니다.

동시에 수용체 플라스미드를 절단한 후 세 부분을 모두 조립하여 폴리시스트로닉 전사 단위를 만듭니다. 종료 부품이 없는 1단계 플라스미드 조립의 음성 대조에서는 군락이 없었으나, 완전한 반응에서는 292개의 흰색 군락과 적색 군락이 없었다. 37도 섭씨에서 두 번째 카세트 없이 다중 유전자 구조물을 조립했을 때는 두 개의 흰색 군락만 나왔으나, 완전한 조립에서는 큰 군락 9개와 작은 군집 435개가 나왔다.

섭씨 30도에서 다유전자 조립에 대한 음성 대조군에서는 4개의 백색 군락이 나타났고, 완전한 반응에서는 1,500개 이상의 군락이 나타났다. 수용체 플라스미드 PMA60의 BSA1 소화는 5,500염기쌍의 예상 단일 밴드를 제공합니다. 24개 군락의 플라스미드를 BSA1 분해한 결과, 24개 중 23개 군락에서 약 4,300 염기쌍과 1,700염기쌍에서 두 개의 밴드가 올바른 제한 패턴을 보였음을 밝혀냈습니다.

형광 영상에서는 OC6 유도제가 포함된 판에서 집락에서 강한 녹색과 청록색 형광이 나타났으나, 유도제가 없는 판에서는 형광이 거의 없거나 전혀 나타났습니다.