핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

우리의 연구 범위는 미토콘드리아 단백질 번역이며, 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 번역과 조립에 영향을 미치는 메커니즘을 해명하려고 합니다. 우리의 연구는 shy1이 복잡한 4가지 주입의 조립에 참여함으로써 미토콘드리아의 규칙적인 기능의 지속 가능성에 중요한 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 우리 연구실은 M=메토트렉세이트 주입의 메커니즘을 조사할 것입니다.

[해설자] 시작하려면 Schizosaccharomyces pombe 세포 펠릿의 습윤 중량을 측정합니다. 세포를 8밀리리터의 S 완충액에 다시 현탁합니다. 디티오스레이톨을 최종 농도 10밀리몰로, 페닐메틸설포닐플루오라이드를 1밀리몰에 첨가하여 두 시약 모두 신선하게 준비되도록 합니다. 세포 현탁액에 용해 효소를 첨가하여 Schizosaccharomyces pombe의 세포벽을 소화합니다. 특정 용해 효소에 권장되는 시간 동안 섭씨 30도에서 셰이커에서 튜브를 돌립니다. 현미경을 사용하여 Spheroplasts 형성을 관찰합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 1,000G에서 10분 동안 원심분리하여 스페로플라스트를 펠릿화합니다. 펠릿을 8밀리리터의 얼음처럼 차가운 S 완충액에 다시 현탁시킵니다. 두 번 세척한 후, 프로테아제 억제제를 함유한 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 8밀리리터에 스페로플라스트를 다시 현탁합니다. 혼합물을 유봉과 시험관이 들어 있는 미리 냉각된 유리 다운 균질화기로 옮깁니다. 꼭 맞는 유봉으로 위아래로 약 15회 스트로크를 수행하여 세포를 기계적으로 균질화합니다. 그런 다음 현미경으로 구형체를 검사하여 막 파손 여부를 확인합니다. 이제 균질화된 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 1,000G에서 5분 동안 원심분리하여 깨지지 않은 세포와 파편을 펠릿화합니다. 생성된 상청액을 섭씨 4도에서 3,000G에서 5분 동안 원심분리하여 핵을 펠릿화합니다. 그런 다음 상청액을 신선한 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 12,000G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리하여 미토콘드리아 및 기타 소기관을 펠릿화하고, 상청액을 디캔팅한 후 얼음처럼 차가운 소르비톨 EDTA 걸레 완충액 1밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 다시 섭씨 4도에서 12,000G에서 15분 동안 원심분리하여 미토콘드리아를 세척합니다. 얼음처럼 차가운 소르비톨 EDTA 걸레 완충액 1밀리리터에 최종 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 정제된 미토콘드리아를 향후 실험을 위해 저장 튜브에 분취합니다. SDS 페이지 로딩에서 완충액을 40마이크로리터의 미토콘드리아 총 단백질로 합니다. 적절한 온도에서 표시된 시간 동안 혼합물을 배양하여 단백질을 변성시킵니다. 면역 블로팅하기 전에 약 20마이크로그램 또는 4마이크로리터의 미토콘드리아 단백질을 12% SDS 페이지 겔에 로드합니다. BN 페이지용 샘플을 준비하려면 먼저 원심분리에 의해 이전 분취량에서 미토콘드리아를 펠릿화합니다. 미토콘드리아를 200마이크로리터의 3개의 XBN 페이지 겔 완충액에 재현탁합니다. 다음으로, 100 X 페닐메틸설포닐 플루오라이드 2마이크로리터와 1몰 염화마그네슘 1마이크로리터를 피펫팅합니다. 섭씨 4도에서 12,000G에서 15분 동안 다시 원심분리합니다. 미토콘드리아 펠릿을 부피 5% 중량의 160마이크로리터에 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 부드럽게 섞습니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 20,000G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 80마이크로리터의 3개의 XBN 페이지 샘플 완충액을 디지토럼 처리된 샘플에 추가합니다. 또는 DDM 처리 샘플에 32마이크로리터. 이제 프리캐스트 네이티브 Bis-Tris 젤을 3-12% 그라데이션으로 조립합니다. 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위해 고분자량 단백질 마커와 함께 처리된 단백질 샘플을 로드합니다. 0.02% Kumasi G250을 함유한 음극 완충액을 사용하여 80볼트의 정전압과 6밀리암페어의 전류에서 30분 동안 겔을 실행합니다. 완충액을 Kumasi가 없는 음극 완충액으로 교체하고 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 3시간 동안 10밀리암페어에서 계속 실행합니다. 단백질 마커가 포함된 젤 레인을 절단합니다. Kumasi R250 완충액으로 마커를 15분 동안 염색합니다. 그런 다음 밴드가 보일 때까지 얼룩을 제거합니다. 겔의 나머지 부분을 BN 페이지 전사 완충액에 30분 동안 담가 평형을 취합니다. 0.45마이크로미터 PVDF 블롯 멤브레인을 메탄올로 헹구고 전사 완충액에서 10분 동안 평형을 유지합니다. 2시간 동안 300밀리암페어의 정전류를 사용하여 겔에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 메탄올로 헹구어 Kumasi 염료를 제거합니다. 그런 다음 5% 탈지유를 함유한 TBS 차단 완충액에서 멤브레인을 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. PVDF 멤브레인을 Schizosaccharomyces pombe 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체에 대한 지정된 1차 항체와 함께 배양합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양한 후, TBST 완충액을 사용하여 멤브레인을 세척합니다. 그런 다음 2차 항체의 멤브레인을 섭씨 25도에서 1시간 동안 1 내지 10,000의 희석으로 배양합니다. TBST 완충액으로 멤브레인을 세척한 후 PVDF 멤브레인을 노출시키고 스캔하여 면역 블롯 결과를 시각화합니다. shy1 유전자의 결실은 미토콘드리아 DNA로 암호화되는 호흡 사슬 단백질인 Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 및 Atp6의 정상 상태 수준을 현저하게 감소시켰습니다. 파란색 네이티브 페이지 분석은 DG 가용화 호흡 사슬 슈퍼 복합체 3242 및 324의 풍부함이 Delta shy1 세포에서 감소한 것으로 나타났습니다. 슈퍼 복합체 32.= 및 55N의 수준은 영향을 받지 않았습니다. DDM 가용화 직경 복합체 3의 수준은 Delta shy1 균주에서 변경되지 않았습니다.