Name: 핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 핵분열 효모 Schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리를 SDS-PAGE와 BN-PAGE, 면역블로팅으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 shy1 유전자가 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 규명하는 데 활용됩니다.

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<ol><li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+mitochondria+to+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Getting mitochondria to center stage.</a> Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).</li>
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<li>Mori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+fission+yeast%2C+65+non-essential+mitochondrial+proteins+related+to+respiration+and+stress+become+essential+in+low-glucose+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Rl+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">In fission yeast, 65 non-essential mitochondrial proteins related to respiration and stress become essential in low-glucose conditions.</a> Rl Soc Open Sci. 10 (10), 230404(2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Rich, P. R., Maréchal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain.</a> Essays Biochem. 47, 1-23 (2010).</li>
<li>Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%3A+Structures%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 76, 179-190 (2018).</li>
<li>Guan, S., Zhao, L., Peng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes%3A+From+Structure+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes: From Structure to Function.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 13880(2022).</li>
<li>Luttik, M. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+NDE1+and+NDE2+Genes+Encode+Separate+Mitochondrial+NADH+Dehydrogenases+Catalyzing+the+Oxidation+of+Cytosolic+NADH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae NDE1 and NDE2 Genes Encode Separate Mitochondrial NADH Dehydrogenases Catalyzing the Oxidation of Cytosolic NADH.</a> J Biol Chem. 273 (38), 24529-24534 (1998).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+AMID+Homologue+Ndi1p+Displays+Respiration-restricted+Apoptotic+Activity+and+Is+Involved+in+Chronological+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Yeast AMID Homologue Ndi1p Displays Respiration-restricted Apoptotic Activity and Is Involved in Chronological Aging.</a> Mol Biol Cell. 17 (4), 1802-1811 (2006).</li>
<li>Malecki, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+genes+required+for+respiratory+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Rese%22%5BJournal%5D)">Identifying genes required for respiratory growth of fission yeast.</a> Wellcome Open Rese. 1, 12(2016).</li>
<li>Luo, Y., Xu, Y., Ahmad, F., Feng, G., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Shy1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homolog+of+human+SURF1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of Shy1, the Schizosaccharomyces pombe homolog of human SURF1.</a> Sci Rep. 14 (1), 21678(2024).</li>
<li>Wang, Y., Feng, G., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Schizosaccharomyces+pombe+DEAD-box+protein+Mss116+is+required+for+mitoribosome+assembly+and+mitochondrial+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The Schizosaccharomyces pombe DEAD-box protein Mss116 is required for mitoribosome assembly and mitochondrial translation.</a> Mitochondrion. 76, 101881(2024).</li>
<li>Izawa, T., Unger, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Meth Mol Biol. 1567, 33-42 (2017).</li>
<li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mitochondria+from+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Mitochondria from Yeast Cells.</a> J Vis Exp. (30), e1417(2009).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Meth Enzymol. 260 (C), 190-202 (1995).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Meth Cell Biol. (65), 231-244 (2001).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Lemaire, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+respiratory+chain+complexes+from+Saccharomyces+cerevisiae+wild-type+and+mutant+mitochondria+activity+measurement+and+subunit+composition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis.</a> Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).</li>
<li>Konovalova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Complexes+in+Cultured+Human+Cells+using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+and+Immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting.</a> J Vis Exp. (144), e59269(2019).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+Analysis+of+Multiprotein+Complexes+from+Cellular+Lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Flor-Parra, I., Zhurinsky, J., Bernal, M., Gallardo, P., Daga, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lallzyme+MMX-based+rapid+method+for+fission+yeast+protoplast+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A Lallzyme MMX-based rapid method for fission yeast protoplast preparation.</a> Yeast. 31 (2), 61-66 (2014).</li>
<li>Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Between+the+oxa1+and+rmp1+Genes+Modulates+Respiratory+Complex+Assembly+and+Life+Span+in+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina.</a> Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>6-아미노카프로이스산</td><td>상곤</td><td>A430196</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스(37.5:1) 40%&nbsp;</td><td>Biolab</td><td>GS1374</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Sangon</td><td>A100486</td><td></td></tr><tr><td>항-Atp6 항체</td><td>Bioworld</td><td>사내</td><td>IB: 1:200</td></tr><tr><td>항-Cob1 항체</td><td>Bioworld</td><td>사내</td><td>IB: 1:1000</td></tr><tr><td>항-Cox1 항체</td><td>Bioworld</td><td>사내</td><td>IB: 1:2000</td></tr><tr><td>항-Cox2 항체</td><td>Bioworld</td><td>사내</td><td>IB: 1:1000</td></tr><tr><td>항콕스3 항체</td><td>바이오월드</td><td>사내</td><td>IB: 1:200</td></tr><tr><td>항-Hsp60 항체</td><td>바이오월드</td><td>사내</td><td>IB: 1:3000</td></tr><tr><td>BCA 단백질 정량 키트</td><td>LEAGENE</td><td>PT0001</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>YEASEN</td><td>60105ES25</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 브릴리언트 블루 G-250</td><td>SERVA</td><td>17524.01</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 Brilliant Blue R-250</td><td>Sangon</td><td>A100472</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sangon</td><td>A100691</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Solarbio</td><td>E8030</td><td></td></tr><tr><td>그라데이션 믹서</td><td>기장 과학</td><td>MGM-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Solarbio</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>고분자량 단백질 마커 </td><td></td> IgG-Alexa Fluor Plus 800(항토끼 2차 항체)RTD6142 <td></td>native PAGE <td>Real Times</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>A32735</td><td>IB: 1:10000</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 0.45 &mu; m PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPFL00005</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce 티슈 그라인더</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8853000015</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sangon</td><td>A610441</td><td></td></tr><tr><td>Lallzyme MMX</td><td>Lallemand</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>용해 효소</td><td>Sigma</td><td>L3768</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L4025</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sangon</td><td>A601336</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sangon</td><td>A421333</td><td></td></tr><tr><td>Native Bis-Tris 젤(프리캐스트)</td><td>Solarbio</td><td>PG41510-N</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sangon</td><td>A610425</td><td></td></tr><tr><td>프리캐스트 젤 러닝 효모 추출물용 Native-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>PG00020-N</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td>용 완충액 <td>Beyotime</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Sangon</td><td>A610498&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>시그마</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>트리신</td><td>시그마</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>솔라바이오</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>비노테이스트</td><td>노보자임스</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>320921</td><td></td></tr></tbody></table>

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

우리는 이전에 이 프로토콜을 사용하여 mtDNA로 인코딩된 호흡 사슬 단백질의 발현과 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 조립에 대한 인간 SURF1의 S. pombe 상동체인 shy1의 결실의 영향을 조사했습니다. 우리는 Δshy1 균주에서 Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 및 Atp6의 정상 상태 수준이 현저히 감소했음을 발견했으며(그림 3), 이는 Shy1이 mtDNA에 의해 암호화된 호흡 사슬 단백질의 발현에 필요함을 나타냅니다. 또한, BN-PAGE 분석은 DG 가용화 호흡 사슬 초복합체 III2IV2 및 III2IV의 풍부함이 shy1 결실에 의해 감소한 반면, 초복합체 III2 및 V/Vn의 풍부함은 Δshy1 세포에서 유의하게 변화되지 않았음을 보여주었습니다(그림 4A). 또한, DDM-가용...

The mitochondrial respiratory chain is crucial for cellular energy metabolism, serving as the core of oxidative phosphorylation. The mitochondrial ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

이 프로토콜에서는 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 복합물의 분석을 보여 줍니다. 여기 경작된 한 인간 세포에 적용 하는 방법을 설명 합니다.

경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

이 프로토콜은 Na+의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

베이커의 미토콘드리아 변환

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡은 세포 생물 에너지학의 중요한 지표입니다. 여기에서는 다양한 효모 종에 적용할 수 있는 이 표현형을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡 정량화

배우세요 핵분열 효모 Schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리를 SDS-PAGE와 BN-PAGE, 면역블로팅으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 shy1 유전자가 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 규명하는 데 활용됩니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

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