유기 용매 기반 추출 및 침전법을 이용한 대 장균 에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)의 효율적 정제

이 연구의 범위는 용매 추출 침전이 융합 활성 기능을 유지하면서 ELP 융합 단백질을 빠르게 정제할 수 있는지 여부를 묻는다. 최근 개발로는 향상된 내독소 조절과 함께 빠른 용매 기반 ELP 정제가 포함되어 있으며, 이를 통해 표적 핵산 전달을 위한 능동 자기 조립 나노입자를 가능하게 합니다. 먼저, 대장균 세포 펠릿 1g을 저울질하세요.

신선하게 준비한 용해 완충액 4밀리리터를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 펠릿이 완전히 분산되어 버퍼와 섞일 때까지 부드럽게 소용돌이를 돌리세요. 세포벽 소화를 돕기 위해 재현유된 세포에 약 5밀리그램의 라이소자임을 첨가합니다.

그 다음 튜브를 얼음 위에 올려놓고 1시간 동안 배양하세요. 배양 후에는 마이크로 팁 프로브 소닉케이터를 사용해 5초 간격으로 샘플을 초음파 검사합니다. 샘플을 얼음에 보관한 후 보통 5분에서 8분 동안 눈에 띄는 입자가 없는 균일한 용해액을 얻을 때까지 초음파 검사를 계속합니다.

초음파 용해액을 10,000G에서 20도 섭씨에서 10분간 원심분리하여 정료를 명확히 하세요. 그 다음 용해성 분획이 포함된 상청액과 불용성 분획이 포함된 펠릿을 조심스럽게 분리합니다. 상청액 10에서 20마이크로리터 피펫을 추출한 후 동등한 질량의 펠릿을 용해 완충제에 재현탁합니다.

두 분획을 4x 라엠리 버퍼와 혼합하여 최종 농도는 1배로 만듭니다. 그 다음 현탁을 95도에서 5분간 가열합니다. ELP가 주로 용해성인 경우, 정액화된 상상액을 이용한 유기 용매 추출을 진행하세요.

용매 추출을 수행하려면 공기 건조 펠릿이나 상상액에 유기 용매 또는 용매 혼합물 4밀리리터를 첨가합니다. 이진 용매 혼합물의 경우, 1:1 조합에 대해 각각 2밀리리터씩 사용하는 등 정확한 부피 비율을 사용하세요. 용제가 펠릿에 적절히 침투하도록 1분간 현탁물을 격렬하게 소용돌이로 돌립니다.

이제 혼합물을 20도 섭씨에서 5분간 배양하여 세포외 단백질의 응집과 유기상 ELP의 용해화를 돕습니다. 샘플을 13,000g 온도에서 20도 섭씨에서 10분간 원심분리하여 용해성 단백질과 불용성 이물질을 분리합니다. 용해된 ELP가 들어 있으니 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 조심스럽게 수집하세요.

강전 준비를 위해 수집된 상정액의 부피를 정확히 측정하세요. 다음으로, 단백질 침전을 위해 상원액의 2.33배에 아세톤 또는 아세토니트릴을 첨가합니다. 혼합물을 20도 섭씨에서 5분에서 7분 정도 배양합니다.

샘플을 10,000G에서 20도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다. 그 후 상청액을 버리고 펠릿을 부드러운 질소 가스 흐름 아래에서 10분에서 15분 정도 자연 건조시키거나, 뚜껑이 없는 원심분리기 튜브를 보풀 없는 물티슈 위에 거꾸로 놓아 20도 후드에서 1시간 동안 건조시킵니다. 건조 단백질 펠릿을 50마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.

그 후 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 완전히 녹아내리도록 하세요. 재현탁된 단백질은 단기에서 중기 사용을 위해 영하 20도에 보관하세요. SDS-PAGE를 사용해 검증을 수행하려면 먼저 정제된 단백질과 4x SDS-PAGE 로딩 버퍼를 혼합합니다.

균질성에 대한 해법을 잠시 보여준다. ELP와 TEEN을 융합하여 콜리스메이트 뮤타아제와 융합한 10%SDS-PAGE 겔에 샘플을 적재합니다. 트래킹 다이빙이 바닥에 도달할 때까지 젤을 100에서 120볼트로 돌리세요.

이제 InstantBlue Coomassie 스테인이나 적절한 대체품으로 20도 섭씨에서 2시간 동안 젤을 염색하세요. 이온수가 깨끗해질 때까지 씻어내세요. 유기 추출 전 용해 단계 후 100킬로달톤에서 유기 추출 전 콜리스메이트 뮤타아제와 융합된 뚜렷한 ELP와 TEEN 밴드가 나타났다.

다양한 유기 용매 조합은 ELP와 TEEN이 융합된 유기 돌연변이효소의 추출 효율과 순도에 차이를 가져왔습니다. AG와 BG 1:1 혼합이 가장 높은 단백질 회수를 기록했습니다. AG 용매 추출 ELP와 TEEN이 융합된 콜리스메이트 뮤타아제는 ITC 정제 단백질에 비해 약 80%의 효소 활성을 유지했으며, BG는 약 50% 활성을 유지했고, V40 대조군은 거의 활성이 없었습니다.

주요 발견으로는 유기 용매 추출 침전이 낮은 내독소로 ELP 융합을 빠르게 정제하면서도 융합 단백질 활성을 보존한다는 점이 포함됩니다. 이 프로토콜은 다단계 ITC 없이 포함체가 있든 없든 대장균에서 ELP 융합을 신속히 정제할 수 없는 신속 세제 없는 방법을 해결합니다. 이 프로토콜은 E.coli 펠릿에서 직접 단일 단계로 신속 정제를 제공하여, 융합 단백질 기능을 보존하면서 고순도의 저내독소 ELP 융합을 가능하게 합니다.