약용 식물에서 트로판 알칼로이드의 정량을 위한 효율적이고 빠른 HPLC-QQQ-MS 방법

우리는 Anisodus tanguticus에서 세 가지 주요 트로판 알칼로이드를 빠르게 정량하기 위해 HPLC-QQQ-MS 방법을 개발했습니다. 기존 HPLC는 트로판 알칼로이드에 대한 민감도가 부족합니다. 이 방법은 고감도 질량분석법을 사용하여 이 문제를 해결합니다.

우선, 히오시아민, 아니소다민 하이드로브롬마이드, 스코폴라민 하이드로브로마이드 기준 기준액 10.0밀리그램을 정확히 계량하세요. 별도의 10밀리리터 용량 플라스크에 넣으세요. 각 체적 플라스크의 표시된 선에 크로마토그래피 등급의 메탄올을 추가하세요.

스탠다드를 초음파 처리로 완전히 용해하여 1.0 밀리리터당 농도의 단일 표준 스톡 용액을 준비합니다. 그 후 기존 용액을 갈색 시약 병에 옮겨 어두운 곳에서 4도 섭씨 상태로 보관합니다. 10마이크로그램/밀리리터의 혼합 표준 중간 용액을 준비하려면, 미리 준비된 각 스톡 용액 100마이크로리터를 10밀리리터 부피 플라스크에 피펫으로 채웁니다.

그 후 표시된 선에 크로마토그래피 등급의 메탄올을 첨가하여 용액을 희석합니다. 다음으로, 신선한 Sophora flavescens 재료를 동결 건조합니다. 그 후 고속 분쇄기를 사용해 건조된 물질을 균질한 가루로 분쇄합니다.

분말을 0.25밀리미터 표준 시험용 체에 걸러. 체로 체로 걸린 가루 20밀리그램을 정확히 재세요. 100밀리리터 부피 플라스크에 옮기고, 표시된 선 바로 아래에 크로마토그래피 등급의 메탄올을 첨가합니다.

다음으로, 상온에서 30분간 초음파 추출을 수행합니다. 그 다음 부피 플라스크를 제거하고 실온에서 25도까지 식히세요. 100밀리리터 표시된 선에 크로마토그래피 등급의 메탄올을 넣고 2분간 혼합하는 소용돌이를 사용한다.

그 후 준비된 추출물을 1밀리리터 피펫으로 100밀리리터 부피메트용 플라스크에 넣습니다. 표시된 선에 메탄올을 추가하세요. 잘 흔들어 충분히 섞은 후 HPLC 주입용 모체 용액을 얻으세요.

샘플 여과를 위해 1밀리리터 일회용 바늘 없는 주사기와 0.22마이크로미터 유기상 미세다공성 멤브레인을 준비합니다. 주사기에 주입할 모체 용액 1.2밀리리터를 흡인하고, 천천히 막을 통해 용액을 여과합니다. 여과액을 내부 삽입물이 있는 2밀리리터 샘플 바이알에 모아 캡으로 단단히 밀봉합니다.

이동식 상 A를 준비하기 위해 초순수 1000밀리리터를 측정합니다. 크로마토그래피 등급의 개미산을 1.0밀리리터 첨가하고 자기 교반기로 10분간 균일하게 혼합합니다. 다음으로, 추가 처리 없이 크로마토그래피 등급의 메탄올을 직접 사용하여 이동형 B 상을 준비합니다.

각각 별도의 초음파 탈기 장치를 사용해 40킬로헤르츠 속도로 이동형 A와 B를 15분간 탈기합니다. 분리된 용매 병에 담긴 탈기된 이동상을 HPLC 시스템의 해당 A선과 B 라인에 연결합니다. 크로마토그래피 분리에는 C18 컬럼을 사용하세요.

80 대 20 비율로 30분 동안 분당 0.3밀리리터의 유량으로 메탄올과 물을 균형 맞춥니다. 컬럼 오븐 온도를 30도(섭씨)로 설정하고 10분 전에 예열하세요. 그 다음 유속을 분당 0.60밀리리터, 주입 부피를 2마이크로리터, 검출 파장을 210나노미터로 설정합니다.

그 다음, 제시된 조건으로 기울기 용출 프로그램을 설정하세요. 양 이온화 모드로 작동하는 전기분무원 장착된 삼중 쿼드러폴 질량분석기를 사용하여 질량분석법 검출을 수행합니다. 네뷸라이저 압력을 15파운드/제곱인치, 모세관 전압을 4,000볼트, 가스 온도를 300도, 가스 유량을 분당 11리터로 설정하세요.

그 다음 여러 반응 모니터링 이온 쌍의 매개변수를 설정합니다. 전구체 이온을 식별하기 위해 MS2 스캔 모드에서 개별 표준 용액을 직접 주입합니다. 방법 검증 후에는 다중 반응 모니터링 모드에서 데이터 수집을 수행합니다.

여기에 제시된 각 분석물에 대해 전구체 이온, 생성물 이온 전이온, 단편자 전압, 충돌 에너지 등 최적화된 매개변수를 사용하세요. 질적 분석 소프트웨어를 실행하세요. 파일을 선택하고 데이터를 가져오기로 선택하여 수집된 모든 데이터 파일을 불러오세요.

추출된 각 이온 크로마토그램에서 타겟 피크의 피크 대칭성과 유지 시간 일관성을 확인하세요. 정량화 모듈에서 MRM 전이를 선택하세요. 각 성분의 전구체 이온 및 생성 이온 쌍을 입력하고 해당 추출된 이온 크로마토그램을 추출합니다.

정량적 분석을 위해 피크 면적을 계산하세요. 최적화된 HPLC 조건 하에서 3개의 표적 트로판 알칼로이드 모두 20분 이내에 성공적으로 분리되었습니다. 스코폴라민과 아니소다민 간 용감도는 8.67이었습니다.

아니소다민과 하이오시아민 사이의 해상도는 11.58에 도달했으나, 모든 해상도는 기준선 분리 기준인 1.5를 상당히 초과했습니다. 모든 분석제는 0.014에서 0.320 마이크로그램/밀리리터 범위에서 우수한 선형성을 보였으며, 상관계수는 0.99를 초과하였습니다. 평균 회복률은 스코폴라민이 101.44%, 아니소다민이 100.25%, 히오스시아민이 99.56%였으며, 상대 표준편차는 각각 1.85%, 2.35%, 1.9%였습니다.

Anisodus tanguticus 10개 샘플에서 세 가지 트로판 알칼로이드를 정량한 결과, 스코폴라민 함량은 샘플 6에서 0.3667밀리그램/그램에서 샘플 7에서 1.0356밀리그램/그램 범위였다. 아니소다민 함량은 샘플 6에서 0.0269 mg/g에서 샘플 10에서 0.3590 mg/gram 사이였습니다. 하이오시아민 함량은 두 번째 샘플에서 0.2930 밀리그램/그램에서 샘플 10에서 1.4989 밀리그램 사이였으며, 샘플 4, 7, 9, 10에서 더 높은 수준이 관찰되었습니다.

이 프로토콜은 세 가지 주요 트로판 알칼로이드를 빠르고 정확하게 정량화할 수 있게 합니다. 핵심 과제는 정확한 측정을 위한 기기 절차와 표준화된 샘플 준비를 보장하는 것입니다. 이 방법은 Anisodus tanguticus의 다른 대사산물을 탐구하고 정량화하는 데도 확장될 수 있습니다.