Immunoblot 분석

종종 웨스턴 블로팅(Western blotting)이라고 하는 면역 블로팅(immuno blotting)은 단백질 샘플 내에서 다클론 또는 단클론 항체에 의해 인식되는 특정 항원을 식별하는 데 사용됩니다. 이 절차는 일반적으로 하나 또는 2D 겔 전기영동을 따르며 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달하는 것을 포함합니다. 이러한 막을 1차 및 2차 항체와 함께 배양하고, 효소에 직간접적으로 접합하고, 유색 또는 형광 기질 반응을 사용하여 이러한 막에서 단백질 항원을 시각화합니다.

이 동영상에서는 면역 블로팅 절차에 대한 단계별 시연을 제공합니다. 안녕하세요, 저는 KE 대학원 연구소의 단백질체학 센터와 협력하고 있는 UVPI의 Sean Gallagher입니다. 오늘은 면역 블로팅 분석을 보여드리려고 합니다.

여기에는 단백질 분리, 단백질을 멤브레인에 블로팅, 면역 프로빙 및 발색 및 김 발광 기질을 사용한 시각화를 포함한 여러 단계가 포함됩니다. 시작하겠습니다. 면역 블로팅 절차를 시작하기 전에 먼저 단백질 샘플을 작은 또는 표준 크기의 1차원 또는 2차원 겔을 사용하여 전기영동으로 분리해야 합니다.

항원 샘플을 준비하고 하나 이상의 겔 레인에 사전 염색 또는 비오틴화 단백질, 분자량 표준물을 포함하는 겔의 레인에 로드합니다. 이러한 단백질 마커는 멤브레인으로 전달되어 면역 염색 후 멤브레인 방향과 단백질의 크기를 편리하게 나타냅니다. 전기영동이 완료되면 면역 블롯을 조립할 준비가 된 것입니다.

면역 블롯을 조립하려면 먼저 젤 샌드위치를 분해하고 스태킹 젤을 제거하고 전사 버퍼의 실온에서 30분 동안 젤을 평형화하며, 이러한 평형은 젤이 평형을 이루는 동안 전사 중 겔 크기의 변화를 방지하기 위해 필요합니다. 플라스틱 전사 카세트를 담을 수 있을 만큼 큰 트레이에 전사 샌드위치를 조립하기 시작하고 카세트가 덮이도록 전사 버퍼를 채웁니다. 이제 플라스틱 전사 카세트의 아래쪽 절반에 스카치 브라이트 패드 또는 스폰지를 놓습니다.

그런 다음 젤과 같은 크기로 자른 여과지 한 장을 가져 가십시오. 전사 버퍼로 미리 적셔 스카치 브라이트 패드 위에 놓습니다. 30분 젤 평형이 완료되면 여과지 위에 젤을 놓습니다.

겔 표면 위에서 테스트 튜브 또는 유리 막대를 부드럽게 굴려 젤과 여과지 사이의 기포를 제거합니다. 또는 BioRad 키트와 함께 제공되는 BioRad 롤러를 사용할 수 있습니다. 여과지, 젤 및 멤브레인을 조작할 때 장갑을 사용하는 것을 잊지 마십시오.

손에 기름이 묻으면 전송이 차단됩니다. 다음으로 전사막을 준비합니다. 멤브레인을 젤과 같은 크기로 자르고 각 가장자리에 1-2mm를 더합니다.

그런 다음 멤브레인을 한쪽 가장자리를 45도 각도로 천천히 증류수에 넣으면 물이 멤브레인으로 흡수되어 결국 전체 표면이 젖습니다. 물에 두 번 빠르게 삽입하면 공기가 갇혀 멤브레인에 흰색 반점으로 나타납니다. 단백질은 이 부위로 전달되지 않습니다.

멤브레인이 완전히 젖으면 10-15분 동안 평형을 유지하고 완충액을 전달합니다. 이 습윤 절차는 니트로셀룰로오스 및 나일론 멤브레인에 적용됩니다. PVDF 멤브레인만이 소수성이며 증류수에 넣거나 옮겨도 젖지 않습니다. 완충기.

PVDF 멤브레인은 먼저 100% 메탄올에 1-2초 동안 담근 다음 10-15분 동안 평형을 유지해야 합니다. 전송 버퍼에서. 멤브레인이 건조되지 않도록 하십시오.

이것이 발생하면 메탄올로 다시 한 번 젖은 다음 전송 버퍼로 젖습니다. 멤브레인이 준비되면 미리 젖은 멤브레인을 겔의 윗면에 직접 놓습니다. 멤브레인 표면 위에서 시험관 유리 막대 또는 BioRad 롤러를 부드럽게 굴려 겔과 멤브레인 사이의 모든 기포를 제거하는 것을 잊지 마십시오.

다음으로 젖으면 또 다른 watman 3mm 여과지 조각이 있습니다. 그런 다음 멤브레인 위에 놓고 다시 모든 기포를 제거합니다. 그런 다음 이 여과지 위에 다른 스카치 브라이트 패드 또는 스폰지를 놓습니다.

전사 카세트의 위쪽 절반을 제자리에 고정하여 면역 블롯 샌드위치 조립을 완료합니다. 이제 면역 블롯 샌드위치가 조립되었으므로 단백질을 겔에서 멤브레인으로 전달할 준비가 되었습니다. 전사 절차를 시작하려면 전기 블로팅 탱크에 전사 버퍼를 채우고 샌드위치가 들어 있는 전사 카세트를 전기 블로팅 장치에 넣습니다.

멤브레인이 탱크의 양극 또는 양전하를 띤 쪽을 향하도록 샌드위치에 중요합니다. 전원 공급 장치의 리드를 전기 블로팅 장치의 해당 양극 및 음극 측에 연결합니다. 이 특정 기준 블로터는 냉각 얼음 블록과 함께 제공됩니다.

이제 전기영동은 냉각과 함께 50볼트에서 30분에서 60분 동안 또는 차가운 방에서 14볼트에서 밤새 단백질을 겔에서 멤브레인으로 전달합니다. 전송이 완료되면 전원을 끄고 기기를 분해하십시오. 그런 다음 블로팅 장치에서 멤브레인을 제거하고 모서리를 잘라 방향을 확인합니다.

이 시점에서 멤브레인을 건조시켜 섭씨 4도의 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 1년 동안 보관할 수 있습니다. 추가 처리 전에 건조된 PVDF 멤브레인을 소량의 100% 메탄올에 넣어 멤브레인을 적셔야 합니다. 그런 다음 증류수에서 메탄올을 제거합니다.

방향이 표시되면 젤을 염색하여 전달 효율을 확인합니다. 전달된 단백질을 시각화하기 위해 시프로 루비로 멤브레인을 가역적으로 염색하거나 카마시 블루 인디아 잉크, 나프톨 블루 또는 콜로이드 골드로 비가역적으로 염색할 수 있습니다. 이러한 비가역적 염색 절차는 나일론 멤브레인과 호환되지 않습니다.

이제 단백질이 멤브레인으로 전달되었으므로 단백질의 면역 프로빙 및 육안 검출을 진행합니다. 이 단계에서는 멤브레인의 고정된 단백질을 특정 항체로 조사하여 존재하는 항원을 식별하고 정량화합니다. 시작하려면 멤브레인을 20밀리리터 차단 버퍼가 있는 플라스틱 배양 트레이에 넣습니다.

어떤 사람들은 백을 사용하지만, 트레이는 서로 다른 1차 항체 용액에서 많은 수의 스트립을 처리할 때 특히 유용하기 때문에 대신 자주 사용됩니다. 다음으로, 밀봉된 멤브레인을 실온에서 30-60분 동안 오비탈 쉐이커 또는 흔들 플랫폼에서 교반하면서 배양합니다. 멤브레인이 배양하는 동안 1차 항체를 희석하고 완충액을 차단합니다.

희석량은 경험적으로 결정되지만 일반적으로 1 대 100 대 1 대 1000입니다. 다클론 항체의 경우, 하이브리드 상등액의 경우 100분의 1, 단클론 항체를 함유하는 쥐산 유체의 경우 1에서 1000 이상입니다. 배양이 완료되면 블로킹 버퍼를 붓습니다.

완충액을 희석된 1차 항체로 교체하고 다시 실온에서 30-60분 동안 지속적으로 교반하면서 배양합니다. 다음으로 100ml로 교반하여 멤브레인을 4번 세척합니다. 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 필터의 경우 TTBS 또는 나일론 필터의 경우 TBS.

멤브레인을 세척하는 동안 매번 10-15분 동안 세척하고 2차 항체를 차단 버퍼로 희석합니다. 2차 항체의 예로는 무 과산화효소 또는 알칼리성 인산가수분해효소, 항 IG 접합체, 상업적으로 이용 가능한 효소 접합체가 있습니다. 2차 항체는 보통 사용 전에 1 내지 200 내지 1 내지 25, 000 희석된다.

세척 단계가 완료되고 세척 물질이 폐기된 후 희석된 무 과산화효소 또는 알칼리성 포스파타아제, 항 IG 접합체를 첨가하고 실온에서 일정한 교반으로 30-60분 동안 배양합니다. 30-60분 후 쓰레기통에서 멤브레인을 제거하고 10-15분씩 총 4회 세척합니다. 앞에서 설명한 대로 TTBS에서.

세척이 완료되면 시각화 단계를 진행할 준비가 된 것입니다. 그러나 먼저 대체 면역 프로빙 절차를 시연할 것입니다. 이 대체 면역 프로빙 절차는 Vector Labs의 벡터 염색 A BC 키트를 기반으로 합니다.

아비단 비오틴 복합체를 사용하여 무 과산화효소 또는 HRPO 또는 알칼리성 포스파타제 A, A, P를 비오틴화된 2차 항체에 부착합니다. 오늘 우리는 HRPO 키트를 시연할 것입니다. TTBS는 아바돈 비오틴 시스템의 차단 완충액으로 매우 적합합니다.

그러나 나일론 필터의 경우 무지방 분유에는 면역 분석을 방해하는 잔류 비오틴이 포함되어 있기 때문에 단백질 결합 시약이 권장됩니다. 오비탈 쉐이커 또는 흔들리는 플랫폼을 사용하여 지속적인 교반으로 열린 트레이에서 차단 버퍼의 멤브레인을 평형화하기 시작하기 위해서만 차단 단계에서 사용해야 합니다. 멤브레인이 평형을 이루는 동안 실온에서 30-60분 동안 멤브레인을 배양합니다.

1차 항체 용액을 준비합니다. 고감도 Aden의 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인에 TTBS를 사용합니다. 비오틴 시스템.

1차 항체를 함유하는 cera의 희석은 일반적으로 1000분의 1에서 100, 000분의 1 범위입니다. 화학발광 화학을 사용하려면 더 높은 범위의 희석액이 필요합니다. 우리의 경우, 발색성을 보여줍니다.

우리는 1차 희석액을 5,000분의 1로 사용하고 있습니다. e 평형이 완료되면 블로킹 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 멤브레인을 덮을 수 있을 만큼 충분한 1차 항체 용액을 추가합니다.

멤브레인을 실온에서 30분 동안 배양하고 30분 후에 부드럽게 흔듭니다. 니트로셀룰로오스에 대한 TTBS에서 멤브레인을 5분 간격으로 3회 세척 세척 단계에서 비오틴화 항체 1방울을 TTBS 10ml로 희석하여 비오틴화된 2차 항체 용액을 준비합니다. 세척 단계가 완료되면 2차 항체 용액을 추가합니다.

멤브레인이 2차 항체로 배양되는 동안 천천히 흔들리면서 실온에서 30분 동안 멤브레인을 배양합니다. 이를 위해 아바돈 비오틴 HRPO를 준비합니다. vti 염색 시약 A 2방울과 시약 B 2방울을 10ml에 섞습니다.

니트로셀룰로오스에 대한 TTBS. 2차 항체 배양이 완료되면 실온에서 30분 동안 배양합니다. TTBS 또는 TBS로 15분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다.

다음으로, avidan 비오틴 효소 용액을 멤브레인에 추가하고 실온에서 30분 동안 천천히 배양합니다. 그런 다음 TTBS로 10분 간격으로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 이제 면역 프로빙(immuno probing) 절차가 완료되었으므로 멤브레인 결합 단백질을 발색 기질로 시각화할 준비가 되었습니다.

이 최종 시각화 단계에서 기판 4개, CN, dab, 슬래시, ICL 2 및 TMB는 일반적으로 말무, 과산화효소 기반 면역 검출 절차와 함께 사용됩니다. 면역 프로브 절차 중 최종 멤브레인 세척이 TTBS에서 수행된 경우, 실온에서 15분 동안 멤브레인을 50밀리리터로 세척했습니다. TBS는 이제 멤브레인을 발색 시각화 솔루션에 배치합니다.

단백질 띠는 10-30분 안에 나타납니다. 30분 배양 후 기질 반응 혼합물을 버리고 증류수를 첨가하여 반응을 종료합니다. 이뮤노 블로팅(Immuno blotting)은 1차원 또는 2차원 전기영동 후 특정 단백질의 존재를 검출하기 위해 수천 개의 실험실에서 사용하는 다단계 절차입니다.

방금 면역 혈액 분석을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 그게 다야. 실험에 행운을 빌며 시청해 주셔서 감사합니다.