Name: Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Leer celfusie via elektrofusie met fluorescerende kleurstoffen en microscopie. Dit protocol toont efficiënte fusie van muismelanoomcellen in vitro met kwantitatieve analyse van fusieopbrengst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Sloveense Research Agency (project J2-9764 en programma P2-0249). Deze video is aanvullend materiaal voor de &quot;Elektroporatie-based technologieën en behandelingen &#39;wetenschappelijke workshop en de postdoctorale opleiding, georganiseerd door de faculteit Elektrotechniek aan de Universiteit van Ljubljana, Slovenië.

I. Het laden van de cellen met Cell trackers CMFDA en CMRA <ol><li> Experimenten werden uitgevoerd op vooraf bereide cellen van muizen melanoom cellijn (B16-F1). Cellen worden gekweekt in twee gescheiden 25 cm 2 cultuur flessen (TPP, ZDA) tot 70-80% confluentie in DMEM kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 0,15 mg / ml L-glutamine, 16 mg / ml gentamicine (alle van Sigma-Aldrich, Duitsland), 200 eenheden / ml crystacillin (Pliva, Kroatië), en geïncubeerd in 5% CO 2 bij 37 ° C. </li><li> Bereid twee 10 mM voorraad oplossingen van Cell trackers (Invitrogen, USA) door het toevoegen van 10,76 pl en 9 ul (voor Groen CMFDA en voor Orange CMRA, respectievelijk) van DMSO (Sigma-Aldrich, Duitsland) tot 50 ug van de kleurstof in de oorspronkelijke Invitrogen flacon. De voorraad-oplossing kan worden opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C voor enkele maanden. Voordat u begint met de experimenten, warming-up van de oplossing tot de kristallen van DMSO op te lossen. </li><li> Bereid bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4). In twee 15 ml Eppendorf-buisjes apart mix 2,1 pi van elk bestand oplossing (10 mM CMFDA of CMRA, respectievelijk) in 3 ml bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer. Dit levert een "laad-oplossing" met ongeveer 7 uM CMFDA (of CMRA). </li><li> Twee keer Spoel cellen met bicarbonaat-free Krebs-Hepes buffer en steek laad-en lossystemen in de kolven. Incubeer cellen gedurende 30 minuten in 5% CO 2 bij 37 ° C. Tijdens deze eerste incubatie reagentia passeren vrij door celmembranen, maar eenmaal binnen de cel, worden de reagentia omgezet in cell-impermeant fluorescerende reactieproducten. </li><li> Na de eerste incubatie, spoelen en cellen met voedingsbodem voor nog eens twee uur in 5% CO 2 incuberen bij 37 ° C. </li><li> Trypsinize cellen in beide kolven (geladen met CMFDA en CMRA) en mengen rode en groene cellen in een verhouding 1:1 in een centrifugebuis van 50 ml (TPP, ZDA). Stel cel concentratie 5 x 10 6 cellen / ml door verdunning met DMEM medium of door concentratie met centrifuge. Plaats een 20 pl druppel celsuspensie in elk putje van 24 multiwell plaat (TPP, ZDA). Incubeer cellen in 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 20 minuten, zodat ze iets hechten aan het oppervlak van de put en cel contacten te leggen. </li></ol> II. Elektrolassen <ol><li> Bereid isoosomolar kaliumfosfaatbuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM sucrose) en hypoosmolar kaliumfosfaat buffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 75 mM sucrose) . </li><li> Plaats de meerdere venstertjes met cellen op de microscoop podium, plaatst de elektroden op de bodem van de put en sluit ze aan op de pulsgenerator. </li><li> Was de cellen met 1 ml van isoosomolar kaliumfosfaat buffer. Voeg 350 ul van hypoosmolar kaliumfosfaat buffer om de cel zwelling induceren. De buffer moet betrekking hebben op de elektroden. </li><li> Laat cellen in hypoosmolar buffer gedurende 2 minuten voor het aanbrengen van elektrische pulsen. Gedurende deze tijd toevloed van water moleculen in de cellen als gevolg van osmotische evenwicht tussen de binnenkant en de buitenkant van de cellen veroorzaken een toename van cell volume. Elektrische pulsen moeten worden toegepast wanneer de cellen dicht bij hun maximale volumes, voordat de regelgeving volume te verlagen starten. </li><li> Om een ​​optimale electrofusie bereiken en te handhaven levensvatbaarheid van de cellen zijn, moeten optimale parameters van elektrische pulsen worden gebruikt. Deze zijn afhankelijk van cellijn gebruikt [1]. In dit experiment een trein van 8 rechthoekige pulsen (elk met een duur van 100 microseconden bij 1 Hz) wordt toegepast op elk monster, met behulp van elektroporatie apparaat (in ons geval Cliniporator, IGEA, Italië). De pulsen worden geleverd aan twee parallelle Pt / Ir draadelektroden met 0,8 mm diameter en 5 mm afstand tussen hen, het creëren van een elektrisch veld van ongeveer 1200 V / cm tussen de elektroden in elk putje, behalve voor de controle goed. </li><li> Laat de cellen ongestoord gedurende 10 minuten na de puls levering. Bepaal de fusie opbrengst door middel van TL-en fase-contrast microscopie. </li></ol> III. Beeldacquisitie en bepaling van de fusie opbrengst <ol><li> De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentie microscoop (in ons geval Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Duitsland) zijn uitgerust met een objectief (x20) en een gekoelde CCD-camera (VisiCam 1280, Visitron, Duitsland). De beelden worden verkregen in Metamorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), maar ook andere soortgelijke acquisitie software kan ook worden gebruikt. CMFDA is opgewekt met een monochromator (Polychrome IV, Visitron, Duitsland) bij 492 nm en 548 nm CMRA op. De fluorescentie van CMFDA en CMRA wordt verkregen met behulp van twee emissie-filters, een gecentreerd op 535 nm (HQ535/30m voor CMFDA) en de andere gecentreerd op 510 nm (D605/55m, voor CMRA, beide Chroma, USA). Het gebruik van dichroïsche spiegel (Q515LP) voorkomen dat het kanaal overspraak. </li><li> Acquire drie foto's (fase contrast, rode en groene fluorescentie) voor vijf willekeurig gekozen velden in elk putje. Maak drie kanalen beelden van elke afbeelding triplet. In een dergelijke afbeelding fluorescerende cytoplasma kunnen samen gezien worden met de celmembranen. Gefuseerde cellen kan dus eenvoudig worden bepaald [Figuur 1]. </li><li> Tellen alle drie de typen cellen (rood, groen en duaal TL) in elk drie kanalen beeld. Bepaal het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen door het aantal van de tweevoudig fluorescerende cellen met het aantal van alle cellen in elk beeld. Fusion opbrengst is gedefinieerd als het percentage van de tweevoudig fluorescerende cellen vermenigvuldigd met twee, omdat de helft van de gefuseerde cellen worden niet gedetecteerd (als cellen van dezelfde kleur zekering). </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Drie kanaal microscopie beeld van B16F1 cellen na elektrolas:. Fase contrast, CMRA fluorescentie (excitatie bij 548 nm) en CMFDA fluorescentie (excitatie bij 492 nm), objectieve vergroting 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Het vermogen van celmembranen voor niet specifiek, bijvoorbeeld door externe elektrische velden, zekering is van belang voor de biotechnologie, geneeskunde en het onderzoek in de biologie. Dergelijke niet-specifieke fusie maakt de productie van zeer waardevolle hybride cellen en hun producten, zoals monoklonale antilichamen, en geeft informatie over de fundamentele mechanismen van fusie-[2]. Elektrolassen is een potentieel zeer effectieve methode, omdat het goed kan worden aangepast aan verschillende soorten cellen. Elektrolassen wordt bereikt wanneer de cellen in nauw lichamelijk contact worden gebracht in hun fusogenic staat (gevoelig voor fusie) door middel van hoogspanning elektrische pulsen. De efficiëntie van elektrolasmoffen hangt af van verschillende parameters die twee delen van de elektrolas proces beïnvloeden. Eerste deel van de elektrolasapparaat proces is het bereiken van de nauw lichamelijk contact tussen de cellen, die kunnen worden verkregen met verschillende methoden [3-8]. Adherence methode (groeiende cellen tot confluentie) kunnen efficiënt als gevolg van spontaan gevestigde cel contacten in de grote zones tussen de cellen worden gebruikt, maar het produceert zeer grote gefuseerde cellen met veel kernen. Wij maken gebruik van de gemodificeerde hechting methode, waar kleinere cellen (met 2 tot 5 kernen), die hebben meer kans om te overleven en zich vermenigvuldigen, worden verkregen (figuur 1). Contact tussen de cellen ook profiteren van osmotische zwelling van cellen, als gevolg van osmotische behandeling gebruikt in het experiment [9]. Tweede deel van het elektrolasapparaat proces is de verwezenlijking van de fusogenic toestand van de celmembranen. Fusogenic toestand correleert goed met electropermeabilized toestand van het membraan (cellen zijn niet-specifiek gepermeabiliseerde voor moleculen die normaal gesproken niet kan passeren intact membraan) en wordt beheerst door dezelfde parameters van de elektrische pulsen (amplitude, lengte, aantal en frequentie) [10] . De waarden van de elektrische parameters die nodig zijn voor een optimale elektroporatie [1] en elektrolassen verschillen tussen de verschillende cellen en zijn afhankelijk van cellen grootte en hun biologische eigenschappen. Elektrische parameters moeten dus worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen, die worden gebruikt als fusiepartners, om fusie te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Cytosolische fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Cytosolische fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td></tr><tr><td>Fetaal kalfserum</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>Reagens</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagens</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagens</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische pulsgenerator</td><td>Instrument</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Multiwellplaat</td><td>Instrument</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifugebuis</td><td>Instrument</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugebuis</td><td>Instrument</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kweekfles</td><td>Instrument</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Elektroden</td><td>Instrument</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

cel electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cel elektrolasverbinding is een veilige, niet-virale en niet-chemische methode die kan worden gebruikt voor het bereiden hybride cellen voor de menselijke therapie. Electrofusie gaat om de toepassing van korte high-voltage elektrische pulsen om cellen die in nauw contact. Toepassing van de korte, hoge-voltage elektrische pulsen veroorzaakt destabilisatie van de cel plasma membranen. Gedestabiliseerd membranen zijn meer doorlaatbaar voor verschillende moleculen en ook gevoelig voor fusie met naburige gedestabiliseerd membranen. Elektrolassen is dus een handige methode om een ​​niet-specifieke fusie van zeer verschillende cellen te bereiken<em&gt; In vitro</em&gt;. Om de fusie, celmembranen, gedestabiliseerd door elektrisch veld te verkrijgen, moet in een nauw contact te laten samengaan van hun lipidendubbellagen en dus hun cytoplasma. In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van cellen<em&gt; In vitro</em&gt; Door middel van aangepaste naleving methode. Bij deze methode cellen mogen slechts in geringe mate hechten aan het oppervlak van de put, zodat medium kan worden uitgewisseld en cellen nog behouden hun bolvorm. Fusion visualisatie wordt beoordeeld door pre-etikettering van het cytoplasma van cellen met verschillende fluorescente kleurstoffen cel tracker, de helft van de cellen zijn voorzien van oranje CMRA en de andere helft met groene CMFDA. Fusion rendement wordt bepaald als het aantal tweevoudig fluorescerende cellen gedeeld met het aantal van alle cellen vermenigvuldigd met twee.

In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van cellen<em&gt; In vitro</em&gt; Door middel van aangepaste naleving methode met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende detectie van gefuseerde cellen visualisatie met fluorescentie microscopie.

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Cel-electrofusie is een veilige, niet-virale en niet-chemische methode die kan worden gebruikt voor het prepareren van hybride cellen voor menselijke therapie. Electrofusie behelst ...

Elektrofusie houdt in dat korte elektrische pulsen met een hoog voltage worden toegepast op cellen in nauw contact. In deze video demonstreren we in vitro elektrofusie van cellen via een aangepaste adherentiemethode. De experimenten werden uitgevoerd op muis-melanoomcellen, BF one.Volg deze stappen voor het experiment. Kweek cellen in twee afzonderlijke kweekflessen tot 80% confluentie. Voeg vervolgens van elke stamoplossing 2.1 µL toe.Voeg respectievelijk 10 millimolair C-M-F-D-A of CMRA toe aan drie milliliter Krebs Hess-buffer in een centrifugebuis. Spoel de cellen twee keer met Krebs Hess-buffer en voeg vervolgens de laadoplossingen toe aan de kolven. De laadoplossingen bevatten respectievelijk ongeveer zeven Micromolair C-M-F-D-A of CMRA.Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in een gecontroleerde atmosfeer. Tijdens deze eerste incubatie passeren reagentia vrijelijk door de celmembranen naar het cytosol, waar ze worden omgezet in membraan-IMP-permeante reactieproducten. Spoel de cellen na deze eerste incubatie af en incubeer ze vervolgens nog twee uur in kweekmedium.De cellen worden geobserveerd met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een gekoelde CCD-camera in de acquisitiesoftware. Stel de excitatiegolflengte in op 548 nanometer en kies een passend banddoorlaatfilter voor de fluorescentiebeelden van de cellen die zijn geladen met CMRA. Stel de excitatiegolflengte in op 492 nanometer en kies een banddoorlaatfilter voor de groene fluorescentiebeelden van de cellen die zijn geladen met C-M-F-D-A. Tel de cellen in beide kolven en meng de rode en groene cellen in een verhouding van één op één; stel de celconcentratie in op 5 miljoen cellen per milliliter.Plaats een druppel van 20 µL cel-suspensie in het midden van elke well. Incubeer de cellen in een 24-wellplaat in een gecontroleerde atmosfeer gedurende 20 minuten, zodat de cellen zich licht kunnen hechten aan het oppervlak van de well in een monolaag en celcontacten tussen hen kunnen vormen. Plaats de multi-wellplaat met cellen op de microscooptafel.Plaats de elektroden op de bodem van de put en sluit deze aan op de pulsgenerator. Om een optimale elektrofusie te bereiken en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, moeten adequate parameters voor de elektrische pulsen worden gebruikt. Deze parameters zijn afhankelijk van de cellijn en moeten in preliminaire experimenten worden bepaald. Verwijder het cultuurmedium en was de cellen met één milliliter ISO omu kaliumfosfaatbuffer bij 350 microliters hypos Miller kaliumfosfaatbuffer om celzwelling te induceren.Laat de cellen twee minuten in de hyperosmale buffer rusten voordat de elektrische pulsen worden toegediend. De elektrische pulsen moeten worden toegediend wanneer de cellen dicht bij hun maximale volume zijn. Dat wil zeggen: voordat ze beginnen met het reguleren van hun volume.Afname in ons experiment. Een reeks van acht rechthoekige pulsen met een duur van 100 microseconden bij één hertz werd toegepast. Na toediening van de pulsen.Laat de cellen gedurende 10 minuten ongestoord rusten. Bepaal de diffusieopbrengst met behulp van fasecontrast- en fluorescentiemicroscopie. Neem drie beelden op: fasecontrast, rode fluorescentie en groene fluorescentie in vijf willekeurig gekozen gezichtsvelden.In elk geval worden in de ImageJ-software drie kanaalbeelden gemaakt van elk beeldtriplet om de visuele kwaliteit van de beelden te verbeteren, waarna voorbewerkingsstappen zoals achtergrondsubtractie en contrastverbetering met standaardparameters op de oorspronkelijke beelden kunnen worden toegepast. Tot slot worden de drie kanaalbeelden samengevoegd met behulp van de RGB naar grijs-plugin van ImageJ. In een dergelijk beeld is het rustend cytoplasma samen met de celmembranen zichtbaar.Op deze manier kunnen weinig cellen eenvoudig worden bepaald in de drie-kanaals afbeelding; tel alle drie de celtypen: rood, groen en dubbel fluorescent. Bepaal het percentage dubbel fluorescente cellen door het aantal dubbel fluorescente cellen te delen door het totaal aantal cellen in elke afbeelding. De fusieopbrengst wordt vervolgens gedefinieerd als het percentage dubbel fluorescente cellen vermenigvuldigd met twee.Aangezien de helft van de view-cellen niet wordt gedetecteerd wanneer cellen van dezelfde kleur worden bekeken.

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

Source: Aigrain, L., et al. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the delivery of fluorescent biomolecules into electrocompetent microbial cells using electroporation. The process begins with the introduction of fluorophore-tagged DNA or proteins into a chilled cell suspension. A high-voltage pulse is then applied to create temporary membrane pores, enabling biomolecule entry into the...

Electroporation-Based Delivery of Fluorescent Biomolecules into Bacterial Cells

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Leer celfusie via elektrofusie met fluorescerende kleurstoffen en microscopie. Dit protocol toont efficiënte fusie van muismelanoomcellen in vitro met kwantitatieve analyse van fusieopbrengst.

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen