Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie
1 juli 2010
In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van cellen In vitro Door middel van aangepaste naleving methode met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende detectie van gefuseerde cellen visualisatie met fluorescentie microscopie.
Elektrofusie omvat het toepassen van korte hoge voltage elektrische pulsen op cellen in een nauwe context. In deze video demonstreren we elektrofusie van cellen in vitro door middel van gemodificeerde Adherence.Method. Experimenten werden uitgevoerd op muis Melanoom cellen, BF een.
Volg voor het experiment deze stappen. Laat cellen groeien in twee afzonderlijke kweekkolven tot 80% confluëntie. Voeg afzonderlijk 2,1 microliters van elke stamoplossing toe.
10 millimolar C-M-F-D-A of CMRA respectievelijk tot drie milliliters van Krebs Hess Buffer in een centrifugeerbuisje. Spoel cellen twee keer met Krebs Hess buffer en breng vervolgens de laadoplossing in de kolven aan. Laadoplossingen bevatten ongeveer zeven Micromolar C-M-F-D-A of CMRA respectievelijk.
Incubeer cellen gedurende 30 minuten in een gecontroleerde atmosfeer. Tijdens deze eerste incubatie passeren de regio's vrij door celmembranen in het cytosol waar ze worden omgezet in membraan IMP doorlaatbare reactieproducten. Na deze eerste incubatie, spoel en incubeer de cellen vervolgens gedurende nog twee uur met kweekmedium.
De cellen worden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde CCD-camera in de acquisitiesoftware. Stel de excitatiegolflengte in op 548 nanometer en kies een geschikte bandpass-filter voor de fluorescentieafbeelding van de cellen geladen met CMRA voor de cellen geladen met C-M-F-D-A. Stel de excitatiegolflengte in op 492 nanometer en kies een bandpass-filter voor de groene fluorescentieafbeelding van trypsineogenen en tel de cellen in beide kolven en meng rode en groene cellen samen in een verhouding van een op een, pas de celconcentratie aan op 5 miljoen cellen per milliliter.
Plaats een druppel van 20 microliter celsuspensie in het midden van elk putje. In een 24 multi-well plaat incubeer cellen in een gecontroleerde atmosfeer gedurende 20 minuten om cellen lichtjes aan het oppervlak van het putje in een monolaag te laten hechten en celcontacten tussen henzelf te laten vestigen. Plaats de multi-well met cellen op het microscoopplatform.
Plaats de elektroden op de bodem van het putje en verbind ze met de pulsgenerator Om optimale elektrofusie te bereiken en celviabiliteit te behouden, moeten adequate parameters van elektrische pulsen worden gebruikt. Deze parameters zijn afhankelijk van de cellijn en moeten worden bepaald in voorlopige experimenten. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen met een milliliter ISO omu kaliumfosfaatbuffer bij 350 microliter hypos Miller kaliumfosfaatbuffer om celzwelling te induceren.
Laat cellen gedurende twee minuten in hyperosmal buffer staan voordat elektrische pulsen worden toegepast. Elektrische pulsen moeten worden toegepast wanneer cellen dicht bij hun maximale volumes zijn. Dat is voordat ze beginnen met regulerend volume.
Verminder in ons experiment. Een trein van acht rechthoekige pulsen met een duur van 100 microseconden bij één hertz werd toegepast. Na pulslevering.
Laat de cellen gedurende 10 minuten ongestoord staan na 10 minuten. Bepaal de diffusieopbrengst door middel van gezichtscontrast en fluorescentiemicroscoop. Verzamel drie beelden, gezichtscontrast, rood en groen fluorescentie op vijf willekeurig gekozen gezichtsvelden.
In elk, creëer in Image J-software drie kanaalbeelden van elk beeldtripeltje om de visuele kwaliteit van afbeeldingen te verbeteren, kan pre-verwerkingsstappen op de originele afbeeldingen worden toegepast, achtergrondsubtractie en contrastverbeteringen met standaardparametersets. Ten slotte worden drie kanaalbeelden samengesteld met behulp van RGB naar grijs Image J-plugin. In zo'n afbeelding kan het rustende cytoplasma samen met celmembranen worden gezien.
Dus kunnen een paar cellen gemakkelijk worden bepaald in het driekanaalsbeeld tel alle drie de soorten cellen, rood, groen en dubbelfluorescent. Bepaal het percentage dubbelfluorescente cellen door het aantal dubbelfluorescente cellen te delen door een aantal van alle cellen in elk beeld. Fusievermogen wordt vervolgens gedefinieerd als het percentage dubbelfluorescente cellen vermenigvuldigd met twee.
Aangezien de helft van de weergavecellen niet wordt gedetecteerd wanneer cellen van dezelfde kleur worden weergegeven.
Overzicht
Deze video toont de efficiënte elektrofusie van cellen in vitro met behulp van een gemodificeerde adhesiemethode gecombineerd met elektroporatie. Het proces omvat de detectie van gefuseerde cellen door middel van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celfusietechnieken
- Elektroporatiemmethoden
- Toepassingen van fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Elektrofusie is een techniek die elektrische pulsen toepast om celfusie te vergemakkelijken.
- De methode kan de efficiëntie van het creëren van hybride cellen verbeteren.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van gefuseerde cellen mogelijk.
- Het begrijpen van celfusie is cruciaal voor verschillende biologische toepassingen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode voor elektrofusie van cellen te demonstreren.
- Om de efficiëntie van celfusie te visualiseren en te kwantificeren.
- Om een protocol te bieden dat in andere laboratoria kan worden gerepliceerd.
Gebruikte methoden
- Muismelanoomcellen werden gekweekt en voorbereid voor fusie.
- Fluorescente kleurstoffen werden gebruikt om de cellen voorafgaand aan de fusie te labelen.
- Er werden elektrische pulsen toegepast om celfusie te induceren.
- Fluorescentiemicroscopie werd gebruikt om de fusieresultaten te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Er werd succesvolle celfusie bereikt, zoals aangegeven door fluorescentie.
- Het percentage dubbel fluorescente cellen werd berekend om de fusieopbrengst te bepalen.
- Optimale elektrische pulsparameters werden geïdentificeerd voor celviabiliteit.
- De visuele kwaliteit van afbeeldingen werd verbeterd door middel van beeldverwerkingstechnieken.
Conclusies
- De gemodificeerde adhesiemethode is effectief voor celelektrofusie.
- Fluorescentiemicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van fusie-efficiëntie.
- Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende celtypen in onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
