Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van de cruciale temporele regulatie die vereist is voor de differentiatie van cardiomyocyten in embryonale stamcellen van muizen. Dit wordt bereikt door in eerste instantie embryonale lichamen (EB's) te vormen in een 96-well plaat met ronde bodem om de EB-vorming als tweede stap te standaardiseren. Eiwit- of chemische modulatoren worden volgens een vooraf bepaald tijdsschema aan de EB's toegevoegd, wat temporele controle over de onderzochte signaalpaden mogelijk maakt.

Vervolgens worden kloppende EBS handmatig gekwantificeerd om de inductie-efficiëntie van diverse schema's voor signaalmodulatie te bepalen. De resultaten tonen de temporele vereisten van essentiële signaleringspaden voor cardiomyocyten-differentiatie, gebaseerd op het percentage gevormde kloppende EBS en bevestiging middels de hanging drop-methode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals hanging drops, is dat het een arbeidsintensieve procedure standaardiseert en vereenvoudigt, en een eenvoudige readout voor kwantificatie mogelijk maakt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de stamcelbiologie, zoals het identificeren van essentiële signaleringsroutes die differentiatie naar het gewenste celtype sturen. Om deze procedure te starten, worden muizen embryonale stamcellen gekweekt in cellenkweekplaten van 10 centimeter met muizen ES-celmedium aangevuld met leukemia inhibitory factor. Wanneer de ES-cellen een confluentie van 50 tot 70% hebben bereikt, zijn ze klaar voor gebruik.

Verwijder het ES-medium en spoel de cellen eenmaal met vijf milliliter steriele PBS. Voeg twee milliliter 0,05% tripsin-EDTA toe aan elke plaat en incubeer de platen bij 37 °C gedurende drie tot vijf minuten. Stop vervolgens de werking van de tripsin-EDTA met drie milliliter ES-medium per plaat en breng de cellen over naar een centrifugebuis van 50 milliliter.

Centrifuge gedurende drie minuten bij 1000 omwentelingen per minuut. Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de celpellet in de gewenste hoeveelheid EB-medium. Tel het aantal cellen en verdun de cellen vervolgens tot vijf keer 10³ cellen per milliliter.

Voeg met een meerkanaals pipet 100 µL EB-medium met cellen toe aan elke put van een 96-wells microtiterplaat met ronde bodem. Het aantal benodigde 96-wells platen is afhankelijk van het aantal condities en tijdspunten van het experiment. Plaats de 96-wells microtiterplaten met ronde bodem in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 om kritieke tijdvensters van belangrijke signaleringspaden voor cardiogenese te identificeren.

Modulatoren van specifieke signaleringspaden worden aan de ES-cellen toegevoegd. Voeg in de 96-wellsplaten met ronde bodem de signaleringsmodulator, verdund in medium, op verschillende tijdstippen aan elke well toe. De helft van de wells in elke 96-wellsplaat wordt gebruikt voor elk starttijdstip van de behandeling.

Een voertuigcontrole wordt toegevoegd aan de overige 48 wells voor elk tijdstip. Op verschillende stoppunten spoelen we de signaleringsmodulatoren uit elke well weg door het medium te vervangen; hierbij moet u uiterst voorzichtig te werk gaan om te voorkomen dat de embryonale lichamen worden verstoord. Op de verschillende stop-tijdstippen worden de modulatoren uitgespoeld door het EB-medium in de wells te vervangen. Kantel de 96-wellplaat onder een hoek van ongeveer 10 graden en verwijder voorzichtig het medium uit de well met een multichannelpipet.

Voeg vervolgens EB-medium zonder modulator toe aan elke put voor behandelingen die langer duren dan 48 uur. Vervang het EB-medium, aangevuld met verse modulatoren, elke twee dagen tot de gewenste eindtijd. Onderzoek zeven dagen na de inductie van EBS, door de ES-cellen over te brengen naar 96-wellplaten, de EB-contractie onder een microscoop.

Score de wells met samentrekkende EBS als positief om de percentages samentrekkende EBS voor elk verschillend behandelingsverloop te bepalen. De tijdvensters van signalering voor cardiogenese die door de experimenten met de 96-wellsplaat zijn geïdentificeerd, kunnen worden geverifieerd in EBS gemaakt van hangende druppels om hangende EB-druppels te vormen. Bereid eerst petrischalen voor door drie tot vier milliliter PBS toe te voegen om aberratie van de druppels later te voorkomen.

Vervolgens wordt een ES-cel-suspensie, bereid met een uiteindelijke dichtheid van 2,5 x 10⁴ cellen per milliliter, in een petrischaal gegoten voor gemakkelijke toegang. Gebruik een meerkanaals pipet om druppels van 20 µL ES-cellen op de omgekeerde deksels van de petrischalen aan te brengen. Zorg ervoor dat de afzonderlijke druppels elkaar niet raken.

Over het algemeen past één deksel tot 80 druppels. Plaats het deksel vervolgens terug op de Petrischaal met PBS en incubeer dit gedurende 48 uur in een incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide om de vorming van EB mogelijk te maken. Was na 48 uur de gevormde EBS uit de hangende druppels van elk deksel weg met drie milliliter EB-medium.

Breng twee doppen EBS over in een nieuwe Petrischaal. Incubeer de Petrischaal gedurende vier dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Overbreng op dag vier de EBS in suspensie naar algemene zes-wells platen die gecoat zijn met 0,2% gelatine. Er worden 30 EBS naar elke well overgebracht. Incubeer signaleringsmodulatoren gedurende de tijdsperiode die is vastgesteld uit de experimenten met 96-wells platen, zeven dagen nadat de hangende druppels zijn gemaakt.

Observeer de EBS onder de microscoop op EB-contractie. ES-cellen die zijn gekweekt in de ronde bodemwells van een 96-wells plaat zullen EBS vormen, zoals getoond in deze representatieve afbeelding van een EB gevormd op dag vier. De kritieke tijdspunten voor ES-cardiogenese zijn de tijdsvensters die het hoogste percentage samentrekkende EBS bevatten na behandeling met signaleringsmodulatoren in vergelijking met de voertuigcontrole. Hier wordt een spontaan samentrekkende focus van cardiomyocyten getoond, gevormd uit met dorsaal morfine behandelde ES-cellen op dag 10 van differentiatie op een 96-wells microtiterplaat.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u efficiënt de kritieke temporele regulatie en de tijdvensters van belangrijke signaleringspaden bij ES-cardiogenese kunt identificeren.