Name: Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer een gestandaardiseerde muis embryonale stamceltest om cardiogene inductie-efficiëntie te kwantificeren via kloppende embryonale lichamen. Deze methode identificeert kritieke tijdsvensters voor signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Veterans Affairs en NIH beurzen 5U01HL100398 en 1R01HL104040.

1. Embryonale Body (EB) vorming met behulp van 96-ronde bodem goed microtiterplaten <ol><li> Grow muis ES-cellen in 10cm celkweek platen met de muis ES-cel medium aangevuld met LIF. </li><li> Wanneer ES-cellen zijn klaar voor gebruik (over het algemeen bij 50-70% confluentie), verwijder ES media en een keer spoelen cellen met 5 ml steriele PBS. </li><li> Voeg 2 ml 0,05% trypsine / EDTA op elk bord en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 3 ~ 5 minuten, Quench trypsine EDTA met 3 ml ES media. </li><li> Overdracht cellen tot 50 ml valk buizen en draaien op 1000 rpm gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer celpellet met de gewenste hoeveelheid EB media. </li><li> Tel het aantal cellen en verdun cellen om 5 x10 3 cellen / ml in EB media. </li><li> Gebruik multichannel pipet om 100μl van EB media toe te voegen met daarin cellen in elke well van de 96 - ronde goed microtiterplaten. </li><li> Plaats 96 - ronde goed microtiterplaten in een couveuse. </li></ol> 2. Identificatie van de kritische tijdvensters van de belangrijkste signaalweg (s) voor cardiogenese <ol><li> Voeg modulatoren van specifieke signaalwegen en controle over het voertuig in elke well van de 96-well microtiterplaten met ES-cellen op verschillende tijdstippen, zoals dag 0, dag 1, dag 2, dag 3 en dag 4, etc. De helft van de putten in elk 96 -wells plaat (48 wells) worden gebruikt voor elke uitgangspunt tijdstip van de behandeling. </li><li> Was de modulatoren door het veranderen van EB media voor elke 48 putten op verschillende stoptijd punten. Bijvoorbeeld, om twee dagen voor de behandeling van ES-cellen vanaf dag 0 te krijgen, was uit modulators op dag 2. Voor elke behandeling langer dan 48 uur, veranderen EB media aangevuld met verse modulatoren om de twee dagen tot de gewenste stoptijd punten. </li><li> Onderzoek EB samentrekking onder een microscoop na dag 7. Scoren de putten met de aanbestedende EBS als positieve aan percentages van de aanbestedende EBS voor elk verschillend behandelingstijd cursussen te volgen. </li><li> De kritische tijdstippen voor ES cardiogenese zijn de termijnen waarin die het hoogste percentage van de aanbestedende EBS behandeld door signalering modulatoren in vergelijking met het voertuig onder controle. </li></ol> 3. Verificatie van de tijdvensters in signalen voor cardiogenese in EBS uit opknoping druppeltjes <ol><li> Bereid Petrischalen door het toevoegen van met 3-4 ml PBS om verdamping te voorkomen. </li><li> Volg de stappen 1,1 ~ 1,5 tot ES-cellen te bereiden op 2.5x10 4 cellen / ml laatste cel dichtheid. </li><li> Giet het mengsel in cell bacteriële schaal voor gemakkelijke toegang. Met behulp van multichannel pipet, voeg 20 pl druppels (met ongeveer 500 cellen) op omgekeerde deksels. Sta niet toe dat de individuele druppeltjes aan te raken. Over het algemeen een deksel kan geschikt tot 80 druppels. Back flip het deksel op het schaaltje met PBS. Incubeer 24 uur of 48 uur aan EB-vorming in een incubator mogelijk te maken. </li><li> Spoelen EB gevormd uit opknoping druppeltjes uit elke deksel met 3 ml van EB media en zwembad twee deksels van EBS aan een nieuwe petrischaal. Voeg EB media om een ​​totaal volume van 10 ml. </li><li> Overdracht EBS in suspensie op 0,2% gelatine beklede 6-well platen op dag 4. In het algemeen 30 EBS worden overgedragen aan elke well. Voeg EB media om de 2 ml uiteindelijke volume voor elk putje te krijgen. </li><li> Incubeer signalering modulatoren in de periode geïdentificeerd van 96-well plaat experimenten. </li><li> Let op de EB samentrekking onder de microscoop na dag 7 en cardiogenese kan verder worden gekarakteriseerd door RT-PCR, immunokleuring en anderen, indien nodig. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

De opknoping druppel methode is de conventionele methode die wordt gebruikt voor EB vorming en in vitro differentiatie. Het is echter bewerkelijk en de grenzen experimentele flexibiliteit als gevolg van logistieke problemen. Op dezelfde wijze, resultaten zijn ook moeilijker te valideren als de vaardigheid van de onderzoeker is cruciaal voor een succesvolle EB vorming en manipulatie als opknoping daalt. Een eenvoudiger methode is om EBS vorm in een ronde bodem 96-well plaat als een single-step proces. Dit formaat kan in vitro differentiatie worden gestandaardiseerd en kan meer experimentele omstandigheden te wijten aan het gemak van EB vorming en stroomafwaarts manipulatie (bijv. modulator toevoegen of verwijderen). Bovendien kan de 96-well plaat formaat worden geoptimaliseerd om een ​​efficiënte screening tool in de muis ES-cellen.

<ul><li> Muis CGR8 cellen worden vooral gebruikt. </li><li> ES medium: GMEM media aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 2 mM L-glutamine, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, en 200 U / ml LIF muizen. </li><li> EB medium: Bereid IMDM media met 20% hitte-geïnactiveerd FBS, 1,6 mM L-glutamine, 0,08 mM 2-mercaptoethanol, en 1X MEM niet-essentieel aminozuur oplossing. </li></ul>

gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van cardiogene inductie efficiency

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiatie van pluripotente stamcellen wordt streng gecontroleerd door de temporele en ruimtelijke regulering van meerdere belangrijke signaalwegen. Een van de obstakels om haar te begrijpen is het gevarieerde methoden in correleren van veranderingen van belangrijke gebeurtenissen signalering tot differentiatie efficiency. We beschrijven hier het gebruik van een muis embryonale stamcellen (ES) cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. Door het scoren voor het oplopen van embryonale organen (EBS) in een 96-well plaat formaat, kunnen we snel kwantificeren cardiogene efficiency en identificeren van cruciaal moment ramen voor Wnt / β-catenine en BMP-signaal activering in een tijdsverloop volgende specifieke modulator behandelingen. De belangrijkste hier beschreven is niet beperkt tot cardiale inductie alleen, en kan worden toegepast op de studie van vele andere cellijnen. Daarnaast is de 96-well formaat heeft de potentie om verder te worden ontwikkeld als een high throughput, geautomatiseerde test om te zorgen voor het testen van meer geavanceerde experimentele hypothesen.

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

De differentiatie van pluripotente stamcellen wordt nauwgezet beheerst door temporele en spatiële regulatie van meerdere cruciale signaleringsroutes. Een van de hindernissen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van de cruciale temporele regulatie die vereist is voor de differentiatie van cardiomyocyten in embryonale stamcellen van muizen. Dit wordt bereikt door in eerste instantie embryonale lichamen (EB's) te vormen in een 96-well plaat met ronde bodem om de EB-vorming als tweede stap te standaardiseren. Eiwit- of chemische modulatoren worden volgens een vooraf bepaald tijdsschema aan de EB's toegevoegd, wat temporele controle over de onderzochte signaalpaden mogelijk maakt.Vervolgens worden kloppende EBS handmatig gekwantificeerd om de inductie-efficiëntie van diverse schema's voor signaalmodulatie te bepalen. De resultaten tonen de temporele vereisten van essentiële signaleringspaden voor cardiomyocyten-differentiatie, gebaseerd op het percentage gevormde kloppende EBS en bevestiging middels de hanging drop-methode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals hanging drops, is dat het een arbeidsintensieve procedure standaardiseert en vereenvoudigt, en een eenvoudige readout voor kwantificatie mogelijk maakt.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de stamcelbiologie, zoals het identificeren van essentiële signaleringsroutes die differentiatie naar het gewenste celtype sturen. Om deze procedure te starten, worden muizen embryonale stamcellen gekweekt in cellenkweekplaten van 10 centimeter met muizen ES-celmedium aangevuld met leukemia inhibitory factor. Wanneer de ES-cellen een confluentie van 50 tot 70% hebben bereikt, zijn ze klaar voor gebruik.Verwijder het ES-medium en spoel de cellen eenmaal met vijf milliliter steriele PBS. Voeg twee milliliter 0,05% tripsin-EDTA toe aan elke plaat en incubeer de platen bij 37 °C gedurende drie tot vijf minuten. Stop vervolgens de werking van de tripsin-EDTA met drie milliliter ES-medium per plaat en breng de cellen over naar een centrifugebuis van 50 milliliter.Centrifuge gedurende drie minuten bij 1000 omwentelingen per minuut. Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de celpellet in de gewenste hoeveelheid EB-medium. Tel het aantal cellen en verdun de cellen vervolgens tot vijf keer 10³ cellen per milliliter.Voeg met een meerkanaals pipet 100 µL EB-medium met cellen toe aan elke put van een 96-wells microtiterplaat met ronde bodem. Het aantal benodigde 96-wells platen is afhankelijk van het aantal condities en tijdspunten van het experiment. Plaats de 96-wells microtiterplaten met ronde bodem in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 om kritieke tijdvensters van belangrijke signaleringspaden voor cardiogenese te identificeren.Modulatoren van specifieke signaleringspaden worden aan de ES-cellen toegevoegd. Voeg in de 96-wellsplaten met ronde bodem de signaleringsmodulator, verdund in medium, op verschillende tijdstippen aan elke well toe. De helft van de wells in elke 96-wellsplaat wordt gebruikt voor elk starttijdstip van de behandeling.Een voertuigcontrole wordt toegevoegd aan de overige 48 wells voor elk tijdstip. Op verschillende stoppunten spoelen we de signaleringsmodulatoren uit elke well weg door het medium te vervangen; hierbij moet u uiterst voorzichtig te werk gaan om te voorkomen dat de embryonale lichamen worden verstoord. Op de verschillende stop-tijdstippen worden de modulatoren uitgespoeld door het EB-medium in de wells te vervangen. Kantel de 96-wellplaat onder een hoek van ongeveer 10 graden en verwijder voorzichtig het medium uit de well met een multichannelpipet.Voeg vervolgens EB-medium zonder modulator toe aan elke put voor behandelingen die langer duren dan 48 uur. Vervang het EB-medium, aangevuld met verse modulatoren, elke twee dagen tot de gewenste eindtijd. Onderzoek zeven dagen na de inductie van EBS, door de ES-cellen over te brengen naar 96-wellplaten, de EB-contractie onder een microscoop.Score de wells met samentrekkende EBS als positief om de percentages samentrekkende EBS voor elk verschillend behandelingsverloop te bepalen. De tijdvensters van signalering voor cardiogenese die door de experimenten met de 96-wellsplaat zijn geïdentificeerd, kunnen worden geverifieerd in EBS gemaakt van hangende druppels om hangende EB-druppels te vormen. Bereid eerst petrischalen voor door drie tot vier milliliter PBS toe te voegen om aberratie van de druppels later te voorkomen.Vervolgens wordt een ES-cel-suspensie, bereid met een uiteindelijke dichtheid van 2,5 x 10⁴ cellen per milliliter, in een petrischaal gegoten voor gemakkelijke toegang. Gebruik een meerkanaals pipet om druppels van 20 µL ES-cellen op de omgekeerde deksels van de petrischalen aan te brengen. Zorg ervoor dat de afzonderlijke druppels elkaar niet raken.Over het algemeen past één deksel tot 80 druppels. Plaats het deksel vervolgens terug op de Petrischaal met PBS en incubeer dit gedurende 48 uur in een incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide om de vorming van EB mogelijk te maken. Was na 48 uur de gevormde EBS uit de hangende druppels van elk deksel weg met drie milliliter EB-medium.Breng twee doppen EBS over in een nieuwe Petrischaal. Incubeer de Petrischaal gedurende vier dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Overbreng op dag vier de EBS in suspensie naar algemene zes-wells platen die gecoat zijn met 0,2% gelatine. Er worden 30 EBS naar elke well overgebracht. Incubeer signaleringsmodulatoren gedurende de tijdsperiode die is vastgesteld uit de experimenten met 96-wells platen, zeven dagen nadat de hangende druppels zijn gemaakt.Observeer de EBS onder de microscoop op EB-contractie. ES-cellen die zijn gekweekt in de ronde bodemwells van een 96-wells plaat zullen EBS vormen, zoals getoond in deze representatieve afbeelding van een EB gevormd op dag vier. De kritieke tijdspunten voor ES-cardiogenese zijn de tijdsvensters die het hoogste percentage samentrekkende EBS bevatten na behandeling met signaleringsmodulatoren in vergelijking met de voertuigcontrole. Hier wordt een spontaan samentrekkende focus van cardiomyocyten getoond, gevormd uit met dorsaal morfine behandelde ES-cellen op dag 10 van differentiatie op een 96-wells microtiterplaat.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u efficiënt de kritieke temporele regulatie en de tijdvensters van belangrijke signaleringspaden bij ES-cardiogenese kunt identificeren.

modified-mouse-embryonic-stem-cell-based-assay-for-quantifying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier presenteren we een robuuste methode om te herprogrammeren primaire embryonale fibroblasten in functionele cardiomyocytes via overexpressie van GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 en miR-133 (GHMT2m) naast remming van TGF-β signalering. Ons protocol genereert kloppend cardiomyocytes zo spoedig 7 dagen na transductie met korting tot 60% efficiëntie.

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

We beschrijven hier de oprichting en toepassing van een Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aangeduid als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) muisreporterlijn voor cardiale herprogrammeringsbeoordeling. Neonatale cardiale fibroblasten (NPF's) geïsoleerd uit de muizenstam worden omgezet in geïnduceerde cardiomyocyten (iCM's), waardoor een gemakkelijke en efficiënte evaluatie van de herprogrammeringsefficiëntie en functionele rijping van iCM's via calcium (Ca2 +) flux...

In vitro beoordeling van cardiale herprogrammering door het meten van cardiale specifieke calciumflux met een GCaMP3 Reporter

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

De combinatie van laserporosatie en micro-elektrode arrays (MEA) maakt actiepotentiaalachtige opnames van gecultiveerde primaire en stamcel-afgeleide cardiomyocyten mogelijk. De golfvorm biedt superieur inzicht in het werkingsmechanisme van teststoffen dan standaardopnamen. Het koppelt patch-clamp en MEA-uitlezing om cardioveiligheidsonderzoek in de toekomst verder te optimaliseren.

Laser-geïnduceerde actiepotentiaal-achtige metingen van cardiomyocyten op micro-elektrode arrays voor verhoogde voorspelbaarheid van veiligheidsfarmacologie

Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.

Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

Leer een gestandaardiseerde muis embryonale stamceltest om cardiogene inductie-efficiëntie te kwantificeren via kloppende embryonale lichamen. Deze methode identificeert kritieke tijdsvensters voor signalering.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

Meer video's verkennen