Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cruciale temporele regulatie te identificeren die nodig is voor cardiomyocytedifferentiatie in muis embryonale stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst embryonale lichamen te vormen in een 96-wels ronde bodemplaat om de EB-vorming als tweede stap te standaardiseren. Eiwit- of chemische modulatoren worden toegevoegd aan EBS gedurende een vooraf bepaalde tijdsperiode, wat temporale controle van de onderzochte routes mogelijk maakt.

Vervolgens worden kloppende EBS handmatig gekwantificeerd om de inductie-efficiëntie van verschillende signaalmodulatieschema's te bepalen. Resultaten worden verkregen die temporele vereisten van essentiële signaalroutes voor cardiomyocytedifferentiatie laten zien op basis van het percentage gevormde kloppende EBS en bevestiging met behulp van de hangende druppelmethode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals hangende druppels, is dat het een arbeidsintensieve procedure standaardiseert en vereenvoudigt en een eenvoudige uitlezing voor kwantificering mogelijk maakt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van stamcelbiologie, zoals het identificeren van essentiële signaalcoagulatie die differentiatie richt naar het gewenste celtype. Om deze procedure te beginnen. Gro muis embryonale stamcellen in 10 centimeter celkweekplaten met muis ES-celmedium aangevuld met leukemie-remmend factor. Wanneer de ES-cellen 50 tot 70% confluëntie hebben, zijn ze klaar voor gebruik.

Verwijder de ES-media en spoel de cellen eenmaal af met vijf milliliter steriele PBS. Voeg twee milliliter 0,05% tripsine EDTA toe aan elke plaat en incubeer de platen gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Quench vervolgens de tripsine in EDTA met drie milliliter ES-medium per plaat en breng de cellen over in een 50 milliliter centrifugeerbuis.

Spin gedurende drie minuten bij 1000 omwentelingen per minuut. Na centrifugatie verwijdert u de supernatant en suspendeert u het cellenpellet met de gewenste hoeveelheid EB-medium. Tel het aantal cellen en verdun vervolgens de cellen tot vijf keer 10 tot de drie cellen per milliliter.

Voeg in EB-medium met behulp van een multikanaals pipet 100 microliter EB-medium met cellen toe aan elke put van een 96-ronde bodem microtiterplaat. Het aantal vereiste 96-wels platen hangt af van het aantal condities en tijdstippen van het experiment. Plaats de 96-ronde bodem microtiterplaten in een bevochtigde 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator om kritische tijdvensters van belangrijke signaalroutes voor cardiogenese te identificeren.

Modulators van specifieke signaalroutes worden toegevoegd aan de ES-cellen. In de 96-ronde bodem putten voegt u de signaalmodulator toe, die in media is verdund in elke put op verschillende tijdstippen. De helft van de putten in elke 96-wels plaat wordt gebruikt voor elk starttijdstip van de behandeling.

Een voertuigccontrole wordt toegevoegd aan de andere 48 putten voor elk tijdstip. Op verschillende stoppunten wassen we de signaalmodulatoren uit elke put door het medium te vervangen en er moet veel zorgvuldigheid in worden gestoken bij het doen hiervan om verstoring van de embryonale lichamen te voorkomen. Bij verschillende stoptijdstippen wassen de modulatoren uit door het EB-medium voor de putten te vervangen. Kantel de 96-wels plaat ongeveer 10 graden en verwijder voorzichtig het medium uit de put met een multikanaals pipet.

Voeg vervolgens EB-medium zonder modulator toe aan elke put voor elke behandeling langer dan 48 uur. Ververs het EB-medium aangevuld met verse modulatoren elke twee dagen tot het gewenste stoptijdstip. Zeven dagen nadat EBS werd geïnduceerd door ES-cellen over te brengen naar 96-wels platen, onderzoekt u EB-contractie onder een microscoop.

Score de putten met contracterende EBS als positieve om percentages van contracterende EBS voor elke verschillende behandelingstijdstip te krijgen. De tijdsvensters van signaal voor cardiogenese geïdentificeerd door de 96-wels plaatexperimenten kunnen worden geverifieerd in EBS gemaakt uit hangende druppels om hangende EB-druppels te maken. Bereid eerst petrischalen voor door drie tot vier milliliter PBS toe te voegen om latere aberratie van de druppels te voorkomen.

Vervolgens wordt een ES-celsuspensie bereid tot een eindconcentratie van 2,5 keer 10 tot de vier cellen per milliliter gegoten in een bacteriële schotel voor gemakkelijke toegang. Voeg met behulp van een multikanaals pipet 20 microliter druppels ES-cellen toe op de omgekeerde deksels van de petrischalen. Laat de afzonderlijke druppels elkaar niet raken.

Over het algemeen past er op één deksel tot 80 druppels. Draai vervolgens het deksel terug over de petrischaal met PBS en incubeer gedurende 48 uur in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator om EB-vorming mogelijk te maken. Na 48 uur wast u de EBS gevormd uit hangende druppels van elke deksel af met drie milliliter EB-medium.

Trek twee deksels van EBS in een nieuwe petrischaal. Incubeer de petrischaal gedurende vier dagen in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide incubator. Op dag vier brengt u EBS in suspensie over naar 0,2% Gelatine gecoate zeswels platen. In het algemeen worden 30 EBS overgebracht naar elke put. Incubeer signaalmodulatoren gedurende de tijdsperiode geïdentificeerd uit de 96-wels plaatexperimenten zeven dagen nadat de hangende druppels waren gemaakt.

Bekijk de EBS onder de microscoop voor EB-contractie. ES-cellen die in de ronde bodem putten van een 96-wels plaat worden gevormd als EBS, zoals getoond in deze representatieve afbeelding van een EB gevormd op dag vier. De kritische tijdstippen voor ES cardiogenese zijn de tijdsvensters die het hoogste percentage contracterende EBS bevatten die zijn behandeld met signaalmodulatoren in vergelijking met de voertuigccontrole. Hier wordt een spontaan samentrekkend focus van cardiomyocyten getoond, gevormd uit