Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Het algemene doel van deze procedure is om cardiaal myosine binding eiwit C en cardiaal troponine I tegelijkertijd te kwantificeren in serum monsters. Dit wordt bereikt door eerst een 96-wells plaat te coaten met cardiaal myosine binding eiwit C antilichaam voor een plex test, of door een vooraf gecodeerde threeplex test te gebruiken. In de tweede stap worden de gecoate platen geïncubeerd met calibrators en serum monsters.

Vervolgens worden in de laatste stap gelabelde detectie-antilichamen toegevoegd, waarbij een chemiluminescentie signaal ontstaat dat wordt gedetecteerd door de plate reader. Uiteindelijk kunnen de niveaus van de cardiale eiwitten van belang in serum monsters worden bepaald door enkele of multiplex immunoassays. De dag voor het experiment pipetteer 30 microliters gelatinevrije muis monoklonaal anti cardiaal myosine binding eiwit C antilichaam in de onderhoek van elke well van een 96 Well miso scale discovery bare standaard plaat.

Tik vervolgens op de zijden van de plaat om de antilichaamoplossing over de bodem van elke well te verspreiden. Na het afdichten, incubeer de plaat een nacht bij vier graden Celsius zonder te schudden. De volgende ochtend tik je de oplossing uit over een gootsteen en vervolgens op een stapel papieren handdoeken.

Voeg vervolgens 150 microliters van 1% blocker A in PBS toe aan elke well om nonspecifieke binding te blokkeren. Incubeer de plaat afgesloten gedurende een uur op kamertemperatuur terwijl geschud wordt bij 700 RPM tijdens de blokkeer stap, verdun de recombinante cardiale myosine binding eiwit C fragment tot een startconcentratie van 2000 nanogram per milliliter in 1%blocker A in PBS. Verdun vervolgens deze oplossing serieel met een factor vijf voor een totaal van zeven standaarden.

Verwijder nu de blokkeeroplossing zoals zojuist is aangetoond, en was de plaat vervolgens drie keer met 150 microliters van 0,05% tween 20 in PBS. Na de derde wasbeurt, sla de plaat krachtig over een gootsteen en deplaat vervolgens stevig op een laag papieren handdoeken totdat deze volledig droog is. Pipetteer vervolgens 25 microliters van elke standaard en monster in de juiste wells.

Vervolgens, terwijl de afgesloten plaat incubeert op de shaker gedurende een uur bij kamertemperatuur, verdunt u het op maat gemaakte cardiale myosine binding eiwit C detectie-antilichaam, gelabeld met sul oag, tot één microgram per milliliter in 1%blocker A in PBS. Na het zorgvuldig wassen van de plaat zoals zojuist is aangetoond, voeg je 25 microliters detectie-antilichaamoplossing toe aan elke well en incubeer vervolgens de afgesloten plaat gedurende een uur bij kamertemperatuur terwijl geschud wordt gedurende de incubatie periode, voer de demo plaat uit met LED lichten om de juiste werking van de sector imager en software te verzekeren, verdun de Reid Buffer op dit moment ook. Na het zorgvuldig wassen van de plaat zoals eerder is aangetoond, gebruik je een meerkanaals pipet om 150 microliters Reid Buffer toe te voegen aan elke well, zorg ervoor geen luchtbellen te maken, en scan vervolgens onmiddellijk de plaat in de sector imager voordat je begint met de threeplex test.

Laat de 96 well threeplex plaat en verdunningsoplossingen gelijkmatig worden naar kamertemperatuur. Voeg vervolgens 25 microliters van 1%blocker A in PBS toe aan de plaat, zorg ervoor dat de hele well bedekt is met oplossing en incubeer de afgesloten plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl geschud wordt. Ondertussen verdun je recombinant cardiaal myosine binding eiwit C-C-K-M-B en cardiaal troponine I samen in 1%blocker A in PBS om een standaard te creëren met 2000 nanogram per milliliter van cardiaal myosine binding eiwit C, 100 nanogram per milliliter van CKMB en 25 nanogram per milliliter van cardiaal troponine.

Ik verdun vervolgens deze mix serieel met een factor vijf tot een eindvolume van minimaal 100 microliters voor elke standaard, verdun monsters twee keer met 1%blocker A in PBS. Vervolgens, voeg je 2 25 microliter technische replicaten van de standaarden evenals de monsters toe aan de 25 microliters blokkeerbuffer die al aanwezig zijn in de wells van de drie plex plaat, inclusief een blanco van alleen verdunning na incubatie van de afgesloten plaat terwijl geschud wordt, verdun de drie SUL oag detectie-antilichamen samen tot een eindconcentratie van één microgram per milliliter elk in 1% oplossing blocker A en PBS na twee uur. Was de plaat zoals zojuist is aangetoond, en gebruik vervolgens een meerkanaals pipet om 25 microliters detectie-antilichaamoplossing toe te voegen aan elke.

Incubeer de afgesloten plaat goed gedurende een uur terwijl geschud wordt bij 700 RPM gedurende de incubatie periode. Voer de demo plaat uit en verdun de Reid buffer zoals zojuist is aangetoond. Vervolgens, na het wassen van de plaat met 0,05% tween 20 in PBS, gebruik je de meerkanaals pipet om 150 microliters Reid Buffer toe te voegen aan elke well terwijl luchtbellen worden vermeden, en scan vervolgens onmiddellijk de plaat in de sector imager.

In deze figuur wordt de standaardcurve van cardiaal myosine binding eiwit C in de plex test vergeleken met die van cardiaal myosine binding eiwit C in de three plex test. Beide tests laten een zeer hoge gevoeligheid en een hoge dynamische bereik zien. Het detectiebereik van de test wordt weergegeven in grijs, zowel plex als three plex.

Standaardcurven van cardiaal myosine binding eiwit C zijn vergelijkbaar. De onderste detectielimiet, onderste kwantificeringslimiet en bovenste kwantificeringslimiet zijn vergelijkbaar in zowel de plex als threeplex tests. Deze grafieken tonen cardiale troponine I en CKMB standaardcurven van de threeplex plaat.

Beide calibrators vertoonden een hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Het detectiebereik van de test wordt weergegeven in grijs. De kruisreactiviteit van de detectie-antilichamen met de andere twee calibrators werd onderzocht door de individuele standaardcurven van alle drie de calibrators te incuberen met enkele detectie-antilichamen, waarbij slechts een lage hoeveelheid kruisreactivite