Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Het algemene doel van deze procedure is om cardiaal myosin-bindend eiwit C en cardiaal troponine I gelijktijdig te kwantificeren in serummonsters. Dit wordt bereikt door eerst een 96-wells plaat te coaten met cardiaal myosin-bindend eiwit C-antilichamen voor een plex-assay, of door gebruik te maken van een vooraf gecodeerde threeplex-assay. In de tweede stap worden de gecoate platen geïncubeerd met calibratoren en serummonsters.

In de laatste stap worden vervolgens gelabelde detectie-antilichamen toegevoegd, waarna een chemiluminescentiesignaal wordt gegenereerd dat door de platreader wordt gedetecteerd. Uiteindelijk kunnen de concentraties van de cardiace eiwitten van belang in serummonsters worden bepaald via single- of multiplex-immunoassays. Pipetteer de dag vóór het experiment 30 µL gelatinevrij muis monoklonaal anti-cardiac myosin binding protein C antilichaam in de onderste hoek van elke well van een 96 Well Meso Scale Discovery bare standard plate.

Tik vervolgens tegen de zijkanten van de plaat om de antilichaamoplossing over de bodem van elke well te verspreiden. Incubeer de plaat na het afsluiten gedurende de nacht bij vier graden Celsius zonder te schudden. Tik de volgende ochtend de oplossing af in een gootsteen en vervolgens op een stapel papieren handdoeken.

Voeg vervolgens 150 µL van 1% blocker A in PBS toe aan elke put om aspecifieke binding te blokkeren. Incubeer de afgesloten plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 RPM tijdens de blokkeringsstap; verdun het recombinante fragment van cardiac myosin binding protein C tot een beginconcentratie van 2000 ng/mL in 1% blocker A in PBS. Voer vervolgens een seriële verdunning van deze oplossing uit met een factor vijf voor een totaal van zeven standaarden.

Verwijder nu de blokkeringsoplossing zoals zojuist gedemonstreerd en was de plaat vervolgens drie keer met 150 µL 0,05% Tween 20 in PBS. Schud de plaat na de derde wasbeurt krachtig boven een gootsteen en dep de plaat vervolgens stevig op een laag keukenpapier tot deze volledig droog is. Pipetteer daarna 25 µL van elke standaard en elk monster in de juiste wells.

Terwijl de afgesloten plaat een uur bij kamertemperatuur op de schudmachine incubeert, wordt het op maat gemaakte, met sul oag gelabelde detectieantilichaam tegen cardiaal myosin-bindend eiwit C verdund tot 1 µg/mL in 1% blocker A in PBS. Nadat de plaat zorgvuldig is gewassen zoals zojuist gedemonstreerd, worden 25 µL van de detectieantilichaamoplossing aan elke well toegevoegd; vervolgens wordt de afgesloten plaat een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd onder constant schudden. Voer tijdens deze incubatieperiode de demoplaat uit met LED-verlichting om de juiste werking van de sector imager en de software te controleren; verdun op dit moment ook de Reid Buffer. Nadat de plaat zorgvuldig is gewassen zoals eerder gedemonstreerd, wordt een meerkanaalpipet gebruikt om 150 µL Reid Buffer aan elke well toe te voegen, waarbij luchtbellen zorgvuldig worden vermeden. Scan de plaat daarna onmiddellijk in de sector imager voordat de threeplex-assay wordt gestart.

Laat de 96-wells threeplex-plaat en de verdunningsoplossingen acclimatiseren naar kamertemperatuur. Voeg vervolgens 25 µL 1% blocker A in PBS toe aan de plaat, waarbij u er zeker van bent dat de gehele well is bedekt met de oplossing, en incubeer de afgesloten plaat 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Verdun ondertussen recombinant cardiac myosin binding protein C, CK-MB en cardiac troponin I samen in 1% blocker A in PBS om een standaard te maken die 2000 ng/mL cardiac myosin binding protein C, 100 ng/mL CK-MB en 25 ng/mL cardiac troponin bevat.

Vervolgens verdun ik dit mengsel serieel met een factor vijf tot een eindvolume van ten minste 100 µL voor elke standaard; verdun de monsters twee keer met 1% blocker A in PBS. Voeg daarna 2 technische replica's van 25 µL van de standaarden en de monsters toe aan de 25 µL blokkeringsbuffer die al in de wells van de three plex plate aanwezig is, inclusief een blanco van enkel verdunningsvloeistof. Na incubatie van de afgesloten plaat onder schudcondities, verdun ik de drie SUL oag detectie-antilichamen samen tot een eindconcentratie van elk 1 µg/mL in een 1% oplossing van blocker A en PBS na twee uur. Was de plaat zoals zojuist gedemonstreerd, en gebruik vervolgens een multichannelpipet om 25 µL detectie-antilichaamoplossing aan elke well toe te voegen.

Incubeer de afgesloten plaat gedurende één uur onder schudden bij 700 RPM tijdens de incubatieperiode. Gebruik de demoplaat en verdun de Reid-buffer zoals zojuist gedemonstreerd. Was vervolgens de plaat met 0,05% Tween 20 in PBS en gebruik de multichannelpipet om 150 µL Reid-buffer aan elke well toe te voegen, waarbij luchtbellen worden vermeden, en scan de plaat onmiddellijk in de sector imager.

In deze figuur wordt de standaardcurve van cardiac myosin binding protein C in de plex-assay vergeleken met die van cardiac myosin binding protein C in de three-plex-assay. Beide assays vertonen een zeer hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Het detectiegebied van de assay is in grijs weergegeven, zowel voor de plex- als de three-plex-assay.

De standaardcurven voor cardiaal myosin binding protein C zijn vergelijkbaar. De onderste detectielimiet, de onderste kwantificatielimiet en de bovenste kwantificatielimiet zijn vergelijkbaar in zowel de plex- als de threeplex-assays. Deze grafieken tonen de standaardcurven van cardiaal troponine I en CKMB van de threeplex-plaat.

Beide kalibratoren vertoonden een hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Het detectiegebied van de assay is in het grijs weergegeven. De kruisreactiviteit van de detectie-antilichamen met de andere twee kalibratoren werd bestudeerd door de individuele standaardcurves van alle drie de kalibratoren te incuberen met enkelvoudige detectie-antilichamen; er werd slechts een geringe mate van kruisreactiviteit waargenomen tussen de CKMB-kalibrator en zowel de cardiac troponin I- als de cardiac myosin binding protein C-detectie-antilichamen.

Hoewel er geen kruisreactiviteit werd waargenomen tussen de andere kalibratoren en detectie-antilichamen, wat het bewijs levert voor de toepasbaarheid van de assay voor de detectie van cardiale beschadiging, werden de serumspiegels van 16 proefpersonen met een myocardinfarct vergeleken met een controlegroep met behulp van de three plex plate serumspiegels van cardiaal myosin binding protein C-C-K-M-B en cardiaal troponine I. Er werd vastgesteld dat alle drie de biomarkers verhoogd waren bij de patiënten met een myocardinfarct in vergelijking met de controlegroep.