Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse
February 26th, 2017
We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.
Hallo, mijn naam is Anael. Ik werk bij de Oswaldo Cruz Foundation in het Cellular Communication Laboratory. Hier bestuderen we P2 Receptoren en gap injectie in de context van het immuunsysteem en de lever.
Vandaag zal ik de micro-injectie van cellen aan je presenteren. Gap injecties spelen een fysiologische rol bij synapsoverdracht, hartcontracties en andere processen. Voor deze techniek kunnen we bestuderen of de gap injecties functioneel zijn of niet.
Oké, laten we de basiscomponenten van de micro-injectie opstelling bekijken. Hier hebben we de omgekeerde fluorescentiemicroscoop waar we de cellen zullen zien. Dit is een CCD-camera om de resultaten vast te leggen.
We hebben hier de stroomgenerator waarmee we de kleurstof in de cel zullen introduceren. Verder hebben we de houder waar de micro-elektrode is aangesloten. En de micro-manipulator die verbonden is met de houder en de beweging van de micro-elektrode in de drie assen, Z, Y en X mogelijk maakt. Voordat we met het experiment beginnen, moeten we de micro-elektrode maken.
We gebruiken deze boorsilicaat-glazen capillair en dit apparatuur genaamd polar. We bevestigen de boorsilicaat capillair hier. Deze wolfraamdraad zullen we verwarmen om twee micro-elektrodes te maken.
Nu verwarmt de wolfraamdraad en de golf hier zullen we naar beneden trekken om de twee micro-elektrodes te maken. Gemakkelijk. Onze eerste stap is om de micro-elektrode te vullen met de kleurstof. Een tip hier is dat je alleen de punt moet vullen met een paar microliters om het experiment te doen.
Het is niet nodig om alles te vullen. Let op met meer details. Vul alleen de punt.
Laten we een experiment beginnen. We hebben hier de cellen in het petrischaaltje, in een natriumoplossing. De zilverdraad is verbonden met de stroomgenerator.
We moeten nu de micro-elektrodes in de hoofdfase bevestigen. Hier in de hoofdfase hebben we ook een zilverdraad verbonden met de stroomgenerator. Zodra de micro-elektrode is bevestigd, kunnen we het in het bad plaatsen.
Let op dat de punt van de pipet voorzichtig het bad raakt. Deze procedure wordt heel voorzichtig uitgevoerd om te voorkomen dat de punt in de bodem van het petrischaaltje crasht. Eenmaal in het bad kunnen we naar de microscoop gaan om naar de schaduw van de micropipet te zoeken.
We raden aan dat we beginnen met kijken in de vergrotingslens. Als we de schaduw van de pipet vinden, kunnen we de micro-elektrode naar de cel bewegen met behulp van de micro-manipulator. Zodra het erg dicht bij de cel is, kunnen we een testpost doen om te controleren of de micro-elektrode niet geblokkeerd is.
Hoe we zullen zien volgende. Hier zien we de micropipet en we passen de micropipet heel dicht bij de cel aan. We kunnen celbeweging rechts en links zien.
Dan veranderen we naar het filter, het fluorescentiefilter. We kunnen een hyperpolariserende puls toepassen om te testen of de punt van de pipet niet geblokkeerd is. Omdat de micropipet in de cel is, kunnen we een hyperpolariserende puls toepassen om de cel met de kleurstof te laden.
We gebruiken hier de losse gele kleurstof. Nadat we de cel met de kleurstof hebben geladen, als de buurcellen zijn verbonden door gap injecties, wachten we enkele minuten en zullen we buurcellen zien oplichten door de diffusie van de kleurstof door deze gap injecties. In ons experiment kunnen we vijf cellen zien, gemarkeerd met sterren, die fluorescentie vertonen.
Hier is een goed voorbeeld van een experiment van micro-injectie in thymische epitheelcellen, in A en B. In de figuren C en D, toont een micro-injectie in een thymische inert cell met losse gele kleurstof en een andere kleurstof, niet permeabel voor gap injectie, getoond in de inzet. De figuur E en F toont een thymische epitheelcel met losse gele kleurstof geïnjecteerd en in de inzet losse gele kleurstof en een gap injectieblok. De resultaten laten zien dat de losse gele kleurstof zich niet heeft verspreid naar de buurcellen.
Vervolgens zien we een micro-injectie in thymische epitheelcellen, in aanwezigheid van dexamethason en de kwantificering in B. Dexamethason verhoogde de mate van koppeling, zoals getoond in de figuur B. Van 100 injecties was het aantal cellen dat drie of vier cellen verbond vaker in aanwezigheid van dit medicijn. Ik hoop dat ik beginners kan helpen om deze belangrijke techniek voor studie van cellulaire communicatie te doen. Bedankt en doei.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de techniek van microinjectie van Lucifer Yellow in een enkele cel om cellulaire communicatie via gap junctions in levende cellen te visualiseren. Het geeft praktische tips voor onderzoekers om cellulaire koppeling door functionele gap junctions te evalueren.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire Communicatie
- Neurowetenschap
- Immunologie
Achtergrond
- Gap junctions spelen een cruciale rol in fysiologische processen.
- Ze zijn betrokken bij synaptische transmissie en hartcontracties.
- Het begrijpen van hun functionaliteit is essentieel voor verschillende biologische studies.
- Lucifer Yellow is een fluorescente kleurstof die wordt gebruikt voor visualisatie.
Doel van Studie
- Om de microinjectietechniek voor het bestuderen van gap junctions te demonstreren.
- Om de mate van cellulaire koppeling in levende cellen te evalueren.
- Om inzichten te geven in de functionaliteit van gap junctions.
Gebruikte Methoden
- Microinjectie van Lucifer Yellow in een enkele cel.
- Visualisatie van cellulaire communicatie.
- Beoordeling van functionele gap junctions.
- Aanpassing van de techniek voor andere fluorescente kleurstoffen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van cellulaire communicatie via gap junctions.
- Evaluatie van cellulaire koppeling aangetoond.
- Techniek toepasbaar op verschillende fluorescente kleurstoffen onder 1.000 Daltons.
- Inzichten in de fysiologische rollen van gap junctions gegeven.
Conclusies
- De microinjectietechniek is effectief voor het bestuderen van gap junctions.
- Lucifer Yellow dient als een nuttig hulpmiddel voor visualisatie.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van cellulaire communicatie in levende systemen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell microinjection enables direct assessment of gap junction functionality, a key mechanism in cellular communication relevant to drug target validation in neuroscience, immunology, and tissue engineering. By visualizing real-time dye diffusion, researchers can evaluate compound effects on intercellular coupling, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, functional readouts that improve target confidence and inform go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a target modulates gap junction-mediated communication.
- Operational Value: Enables functional validation of connexin or hemichannel targets in live cells.
- Predictive Value: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct observation of dye transfer.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated cellular systems for compound screening by establishing baseline coupling.
- Quantitative Output: Measures diffusion kinetics as a functional readout for assay standardization.
- Scalability: Adaptable to high-content imaging platforms for multi-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological processes like synaptic transmission and heart contraction where gap junctions are implicated.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to preclinical models by confirming functional coupling in relevant cell types.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement based on evidence of target engagement in cellular networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess target effects on cellular communication before progressing to phenotypic screening or lead optimization.
- Discovery Biology: Tests hypothesis that a compound or genetic modulator alters intercellular signaling via gap junctions.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence data to compare treatment conditions.
- Analytics: Provides measurable diffusion metrics that enable statistical comparison of coupling efficiency.
- Translational Research: Uses epithelial and immune-relevant cell lines to model tissue-level communication.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating connexin-targeting compounds across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by confirming functional target modulation in a native cellular context.
- Operational Value: Standardizes microinjection and imaging protocols for reproducible results across labs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by identifying ineffective modulators of cellular coupling early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds demonstrating gap junction modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, fluorescence microscopy, and dye handling.
- Depends on micromanipulator stability, electrode preparation, and intracellular injection precision.
- Necessitates standardized cell preparation and bath conditions to ensure consistent results.
- Must account for cell type variability in connexin expression and baseline coupling.
- Limited to dyes under ~1,000 Da that can pass through gap junctions, as larger molecules remain cell-autonomous.
