Name: Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een elektronische tong construeren voor eiwitanalyse met behulp van een combinatorische aanpak en oppervlakteplasmonresonantiebeeldvorming. Deze methode genereert continue 3D-evolutielandschappen voor efficiënte eiwitdiscriminatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Ph.D.-beurs van LANEF in Grenoble bedanken voor de ondersteuning van Laurie-Amandine Garçon. Dit werk werd financieel ondersteund door de Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR-subsidie 06-NANO-045).

1 Voorbereiding van de verschillende oplossingen en Eiwitmonsters <ol><li> Bereid 100 ml fosfaatbufferoplossing (PBS-G) bevattende 50 mM NaH 2PO 4, 50 mM NaCl en 10% glycerol bij pH 6.8. </li><li> Bereid 250 ml HEPES bufferoplossing met 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 bij pH 7,4. </li><li> Bereid voorraadoplossing bouwsteen 1 (BB1) lactose en bouwsteen 2 (BB2) gesulfateerde lactose (figuur 1) 0.2 mM in PBS-G. </li><li> Bereid 1 ml eiwitoplossingen in HEPES: A spil hypogaea lectine (AHL) 500 nM, 1 uM myoglobine, lysozym en 500 nM. </li><li> Bereid 20 ml van 1% SDS in ultrapuur water. </li></ol> 2 Voorbereiding van de CoCRR Array <ol><li> Reinig het goud oppervlak van het prisma 48 uur voorafgaand aan het gebruik van een plasma reiniger voor 3 min onder deze omstandigheden: 75% zuurstof, 25% Argon, 0,6 mbar, vermogen 40 W. </li><li> Bereid elf zuivere en gemengde solutions BB1 BB2 en met [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhoudingen tussen 0 en 100% in stappen van 10% bij een totale BB concentratie van 0,1 mM in PBS-G. </li><li> Deposit 8 nl druppels van deze zuivere en gemengde oplossingen op het prisma oppervlak met een contactloos spotter in viervoud voor elke verhouding met 44 plekken in totaal (figuur 2). OPMERKING: 10% glycerol toegevoegd in PBS-G is zeer belangrijk solvent evaporatie en de verandering BB concentratie na afzetting te verminderen. </li><li> Plaats het prisma in een petrischaal met 1 ml ultrapuur water en laat het O / N bij RT voor zelf-assemblage van BB1 en BB2 op de gouden oppervlak. Hierbij wordt aangenomen dat de gemiddelde samenstelling van het oppervlak in de gemengde monolagen weerspiegelt de samenstelling van de depositie gemengde oplossing (figuur 3) 11. </li><li> Grondig wassen het prisma met ultrapuur water en droog hem vervolgens onder een stroom van argon. </li></ol> 3 Eiwit Sensing door spri <ol><li> Stel de incubator waarin het de l inrichting wordt geplaatst op 25 ° C tot brekingsindex veranderingen bij temperatuurvariatie tijdens eiwit detectie vermijden. </li><li> Plaats een niet-gefunctionaliseerd spoelen prisma in de 10 ul polyether ether ketone (PEEK) stroom cel aangesloten op een computer gestuurde spuitpomp, een ontgasser en een 6-port middeldruk injectieventiel (figuur 4). Vul de stroom systeem met vers gefilterd en ontgast lopende buffer HEPES. </li><li> Verwijder de spoelen prisma en steek het prisma met de CoCRR array in de stroom cel. Run HEPES bij 100 pl / min stroomsnelheid. Met de hulp van de CCD-camera verwijder eventuele luchtbelletjes aanwezig zijn op het prisma oppervlak door het passeren van lopende buffer snel. </li><li> Definieer studiegebied voor elke plek door het tekenen van een cirkel met dezelfde diameter voor het gebied van belang op basis van een goed contrast beeld van de reeks en met de hulp van de geïntegreerde software in spri systeem. </li><li> Trace plasmon curves, die bestrijkenivity krommen in functie van de invalshoek voor alle spots. </li><li> Kies de werkhoek (positie waarop kinetische curves zullen worden opgenomen) op de hoogste helling van de reflectiviteit rondingen. Draai het scannen spiegel om de geselecteerde werken hoek voor kinetische metingen op te lossen. </li><li> Blijven HEPES lopen door de stroom-systeem tot reflectie signaal voor alle plekken is stabiel en constant. </li><li> Injecteer 1 ml AHL-oplossing met een injectiespuit in de sample loop (500 pl) met de injectie klep op stand &quot;load&quot;. Dan zet de injectie klep naar &quot;injectie&quot; te positioneren. De stroomsnelheid voor alle eiwit injectie was 100 ul / min. </li><li> Begin kinetische metingen door het monitoren van de reflectiviteit variaties tegen de tijd gelijktijdig op alle plekken. </li><li> Eind eiwit injectie spoel de array met loopbuffer gedurende 8 minuten. Tenslotte Injecteer 1 ml 1% SDS te regenereren. </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor de andere proteins. </li></ol> 4 Data Processing and Analysis <ol><li> Na binnenkomst eiwitoplossing in de stroomcel, moleculaire binding optreedt en induceert een verschuiving van de plasmon bochten en een variatie van reflectiviteit. De beeldacquisitie software zet de gemeten lichtintensiteit waarden schaalniveaus grijs, waardoor SPR afbeeldingen Figuur 5A, en genereert de variatie van reflectiviteit versus tijd, die sensorgrammen (Figuur 5B). </li><li> Gebruik een wiskundige computerprogrammatuur om de reflectiecoëfficiënt (R%) plot eind van elk eiwit injectie versus [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhouding 2D voortdurende ontwikkeling (LMP) voor elk monster genereren (Figuur 5C). </li><li> Voeg de [BB1] / ([BB1] + [BB2]) verhouding in sensorgrammen (figuur 5B) naar 3D continue evolutie landschap (CEL) voor elk eiwit (Figuur 5D) te genereren. </li></ol>

<ol><li>Margulies, D., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+protein+recognition+as+an+alternative+approach+to+antibody-mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).</li>
<li>Umali, A. P., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+to+differential+sensing+using+synthetic+molecular+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).</li>
<li>Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-based+detection+of+different+proteins+using+an+array+of+fluorescent+protein+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).</li>
<li>Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+of+proteins+based+on+an+array+of+functionalized+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).</li>
<li>Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptors+create+patterns+that+distinguish+various+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differential receptors create patterns that distinguish various proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).</li>
<li>Wright, A. T., Anslyn, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+receptor+arrays+and+assays+for+solution-based+molecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition.</a> Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle%E2%80%93fluorescent+polymer+%E2%80%98chemical+nose%E2%80%99+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).</li>
<li>De, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+proteins+in+human+serum+using+conjugates+of+nanoparticles+and+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein.</a> Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+evolution+profiles+for+electronic-tongue-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).</li>
<li>Campbell, C. T., Kim, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPR+microscopy+and+its+applications+to+high-throughput+analyses+of+biomolecular+binding+events+and+their+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics.</a> Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).</li>
<li>Stranick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-scale+phase+separation+in+mixed+composition+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers.</a> Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

<html> De meest kritische stappen voor de constructie van deze eT zijn toegewijd aan een goede reproduceerbaarheid van het systeem. Bijvoorbeeld, het reinigen van de gouden oppervlak van het prisma met een gestandaardiseerde procedure voor gebruik, toevoegen van 10% glycerol in de elf zuivere en gemengde oplossingen BB1 en BB2 om oplosmiddelverdamping te elimineren tijdens BBs zelfassemblerende op het goud oppervlak van het prisma, deponeren van meerdere herhalingen voor elke [BB1] / ([BB1] + [BB2]) ratio, etc. ...

Precieze en snelle eiwit detectie methoden zijn zeer belangrijk in de medische diagnostiek en proteomics. Klassieke-eiwit detecteren arrays, zoals biochips, zijn gebaseerd op het &quot;lock-and-key&quot; opnameprincipe en vereisen specifieke receptoren zoals aptameren, antilichamen of mimetica. In de afgelopen jaren, heeft differentiële detectie geïnspireerd door de menselijke reukzin en gustation voren als alternatief 1. Deze elektronische neus / veer (eN / eT) benadering is gebaseerd op differentiële binding van analyten een array kruisreactieve receptoren (CRRs), die niet nodig zeer specifiek of selectief voor de doelmoleculen te laten dan het moeizame overwinnen ontwikkelingsproces zeer selectief receptoren. Het is de gecombineerde respons van de receptoren die zorgt voor een duidelijk patroon voor elk monster, zoals een vingerafdruk, identificatiemiddel. De twee belangrijkste uitdagingen voor de ontwikkeling van elektronic neus / tong doeltreffende eiwit sensing zijn de productie van sensorelementen die het vermogen om onderscheid te maken tussen structureel vergelijkbare analyten en passende transductie stelsel binding evenement. Tot nu toe hebben studies over verschillende benaderingen matrix ontwikkeling 2. Bijvoorbeeld in een studie een array-gebaseerde identificatie van eiwitten werd ontwikkeld met CRRs bereid uit tetra-carboxyphenylporphyrin derivaten door het koppelen van de carboxylgroepen van verschillende aminozuren of dipeptiden differentiële receptoren bezitten een hydrofobe kern voor affiniteit voor eiwitten en onderscheiden gebracht periferieën voor zorgen meegeven differentieel bindend. Met dit systeem werden verschillende eiwitten en mengsels geïdentificeerd door het meten van fluorescentie uitdoving van de receptoren na interactie met de analyten 3,4. In een andere studie werd een bibliotheek van 29 CRRs bevattende tripeptide en boronzuur groepen gesynthetiseerd op een combinatorische wijze op een hexasubstistitueerde benzeen steiger is ontwikkeld voor het meten van eiwitten met een indicator-opname colorimetrische detectie 5,6. Met een dergelijk ontwerp, elke receptor toonde differentieel bindingscapaciteit eiwitten op basis van de variantie in de peptide armen, en boorzuren geholpen bij differentiatie van eiwitten uit glycoproteïnen. Meer recent heeft een serie samengesteld uit verschillende kationische gefunctionaliseerde goud nanodeeltjes geconjugeerd met een anionische fluorescerende polymeer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) werd om te detecteren en identificeren eiwitten 7. De competitieve binding tussen eiwitten te analyseren en geblust PPE / goud nanodeeltjes complexen geregenereerd fluorescentie, het produceren van verschillende patronen erkenning voor eiwitten. In dit onderzoek werden de gefunctionaliseerde nanodeeltjes-eiwitinteracties afgestemd door het variëren van fysicochemische eigenschappen van nanodeeltjes eindgroepen. Verder werd aangetoond dat deze benadering effectief voor eiwit analyse complex en eiwit-rijk medium zoalszoals humaan serum bij fysiologisch relevante concentraties, daarmee aangevend het potentieel van eT profileren echte steekproeven voor de diagnose ziektetoestanden 8. Hoewel veelbelovend, deze systemen hebben een aantal inherente beperkingen. Ze vereisen het ontwerpen en synthetiseren 5-29 CRRs met vrij ingewikkeld structuren. In tegenstelling tot het olfactorische systeem wordt gereset na elke meting proteïne detectie vereist het bereiden van een matrix per monster. Tenslotte monitoren real-time bindinggebeurtenissen bijzonder moeilijk. In dit verband werd een combinatoriële benadering voorgesteld door een klein aantal eenvoudige en gemakkelijk toegankelijk moleculen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen (hydrofiel, hydrofoob, positief geladen, negatief geladen, neutrale, etc.) Als bouwstenen (BBs) 9. Door het mengen BBs in variërende verhoudingen en gecontroleerd en waarbij de mengsels zelf-assembleren op het goud oppervlak van eenprisma, een reeks van combinatorische oppervlakken met de juiste eigenschappen voor het bindende eiwit is gemaakt. Met name de zelf-geassembleerde monolagen op dit systeem toe gemakkelijk afstemmen van verschillende oppervlakte-eigenschappen op zeer uiteenlopende wijze, waardoor diverse combinatorische kruisreactief receptoren (CoCRRs) om snel en efficiënt geproduceerd. Eiwit sensing werd uitgevoerd met behulp van een optisch detectiesysteem, surface plasmon resonance imaging (SPRI). Kortom, een brede bundel monochromatisch gepolariseerd licht van een LED verlicht de gehele matrix CoCRR gebied op het oppervlak van het prisma. Een hoge resolutie CCD-videocamera biedt real-time verschil van beelden over alle plekken van de CoCRR array. Het vangt alle lokale veranderingen op het oppervlak van de CoCRR scala verstrekken van gedetailleerde informatie over de binding evenementen en kinetische processen 10. Ondertussen, met de hulp van imaging software, SPR beelden die overeenkomen met plekken worden automatisch omgezet naar variaties van reflectiviteit versus tijd, het genereren van een reeks van kinetische bindingscurven genoemd sensorgrammen. Aldus kan een spri labelvrije, synchroon, parallel en real-time waargenomen bindingsgebeurtenissen. Bovendien, de verkregen CoCRR array regenereerbaar en herbruikbaar eiwitanalyse. Dit protocol beschrijft de bouw van de elektronische tong met behulp van slechts twee kleine moleculen als bouwstenen en illustreert de toepassing ervan voor de analyse van algemene eiwitten gebaseerd op continue patronen erkenning verkregen met SPRI.

<table><tbody><tr><td>SPRi-apparaat&nbsp;</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td></td><td>SPRi-apparaat wordt geplaatst in een temperatuurgeregelde incubator bij 25 &deg;C.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp&nbsp;</td><td>Cavro scientific instruments</td><td>Cavro XLP 6000</td><td></td></tr><tr><td>Micro Elite Ontgasser&nbsp;</td><td>Alltech</td><td>AT590507</td><td></td></tr><tr><td>6-poorts middeldruk injectieklep</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Het volume van de gebruikte injectielus is 500 &micro;l.</td></tr><tr><td>Femto plasma cleaner (versie 7)</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td>Online ontgassingssysteem met 2 kanalen.</td></tr><tr><td>Spotter</td><td>Siliflow</td><td></td><td>Het is een contactloze piëzo-elektrische spotter.</td></tr><tr><td>SPRi-Biochip</td><td>Horiba Scientific-GenOptics</td><td>36000067</td><td>De prisma is gemaakt van een glas prisma met hoge brekingsindex bedekt met een dunne goudfilm (45 nm) en speciaal ontwikkeld voor beeldvormingsdoeleinden.</td></tr><tr><td>Erythrina cristagalli lectine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5390</td><td></td></tr><tr><td>Arachis hypogaea lectine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881</td><td></td></tr><tr><td>Myoglobine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>CXCL12&alpha;</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Dr. Hugues Lortat-Jacob; voor bereidingsdetails, zie ondersteunende informatie in referentie 9</td></tr><tr><td>CXCL12&gamma;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Dr. Hugues Lortat-Jacob; voor bereidingsdetails, zie ondersteunende informatie in referentie 9</td></tr><tr><td>Lactose</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Prof. David Bonnaff&eacute;; voor bereidingsdetails, zie ondersteunende informatie in referentie 9</td></tr><tr><td>Gesulfateerd lactose</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Prof. David Bonnaff&eacute;; voor bereidingsdetails, zie ondersteunende informatie in referentie 9</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr></tbody></table>

elektronische tong genereren continuous erkenning patronen voor protein analysis

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In het huidige protocol is een combinatorische aanpak ontwikkeld om de ontwerp- en productie van sensormaterialen voor de constructie van elektronische tongen (eT) voor eiwitanalyse te vereenvoudigen. Door een klein aantal eenvoudige en gemakkelijk toegankelijke moleculen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen, gebruikt als bouwstenen (BB's), in verschillende en gecontroleerde verhoudingen te mengen en de mengsels toe te staan zichzelf te ordenen op het gouden oppervlak van een prisma, werd een reeks van combinatorische oppervlakken met geschikte eigenschappen voor eiwitdetectie gecreëerd. Op deze manier kan een groot aantal kruis-reactieve receptoren snel en efficiënt worden verkregen. Door een dergelijke reeks van combinatorische kruis-reactieve receptoren (CoCRR's) te combineren met een optisch detectiesysteem zoals surface plasmon resonantie beeldvorming (SPRi), kan de verkregen eT de bindingsgebeurtenissen in real-time volgen en continue herkenningspatronen genereren, inclusief 2D continu evolutieprofiel (CEP) en 3D continu evolutielandschap (CEL) voor monsters in vloeistof. Een dergelijk eT-systeem is efficiënt voor de discriminatie van veelvoorkomende gezuiverde eiwitten.

<html> Om het vermogen van de elektronische tong gemeenschappelijke eiwitanalyse onderzoeken, werden drie eiwitten gebruikt: AHL, myoglobine en lysozym. Voor elk eiwit, een afzonderlijke 2D continue evolutie profiel CEP, werd gegenereerd door de eT, zie figuur 6. Verder dankzij de l, die kunnen volgen de real-time adsorptie en desorptie, voor elk eiwit een tijdsafhankelijke patroon continue herkenningsmachine, genaamd 3D continue evolutie landscape (CEL), werd gegenereerd. In...

Een nieuwe aanpak wordt beschreven voor de constructie van een elektronische tong (eT), die het ontwerp en de productie van sensormaterialen aanzienlijk vereenvoudigt en het mogelijk maakt voor de eT om continue evolutieprofielen en landschappen voor monsters in vloeibare vorm te genereren. De verkregen eT is efficiënt voor gebruikelijke eiwitanalyse, zoals onderscheiding.

Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een elektronische tong te construeren op basis van een combinatorische benadering en oppervlakteplasma- en resonantiebeeldvorming uit te voeren voor eiwitanalyse. Dit wordt bereikt door lactose en sulfateerd lactose als bouwstenen te gebruiken en hun mengsels op het gouden oppervlak van een prisma af te zetten voor zelfassemblage om een reeks van combinatorische kruisreactieve receptoren te creëren. Als tweede stap worden oppervlakteplasma en resonantiebeeldvorming toegepast, die bindingsgebeurtenissen in realtime volgen en SPR-beelden en een reeks kinetische bindingscurven genaamd sensorgrammen produceren.Vervolgens wordt gegevensverwerking uitgevoerd op basis van de sensorgrammen met behulp van een wiskundesoftware om een 2D continu evolutieprofiel en een 3D continu evolutielandschap voor elk monster te creëren. De resultaten tonen aan dat de elektronische tong in staat is om verschillende 3D continue evolutielandschappen voor veel voorkomende gezuiverde eiwitten te genereren en efficiënt is voor hun onderscheiding op basis van patroonherkenning. Deze techniek heeft verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals klassieke, elektronische gnosis en tongen. Ten eerste wordt de voorbereiding van enkele receptoren aanzienlijk vereenvoudigd.Een grote diversiteit aan kruisreactieve receptoren kan worden verkregen door een klein aantal moleculen te mengen. Ten tweede, dankzij de combinatorische benadering, kunnen de herkenningspatronen die door onze elektronische tong worden gegenereerd, worden beschouwd als continu, zodat abnormale signalen gemakkelijker kunnen worden geïdentificeerd. Daarom kan een betrouwbaardere analyse worden verkregen om de combinatorische kruisreactieve receptorarray voor te bereiden.Maak eerst het gouden oppervlak van het prisma 48 uur voor gebruik schoon met een plasmareiniger gedurende drie minuten onder 75% zuurstof, 25% argon, 0,6 millibar en 40 watt vermogen. Bereid vervolgens 100 milliliter fosfaatbufferoplossing met 10% glycerol of PBSG. Het toevoegen van glycerol aan PBS is erg belangrijk om de verdamping van het oplosmiddel te verminderen en veranderingen in de bouwstenen of BBB-concentratie na afzetting.Bereid vervolgens stamoplossingen van lactose of bouwsteen één en sulfateerd lactose of bouwsteen twee uit de stamoplossingen. Bereid 11 zuivere en gemengde oplossingen met verhoudingen tussen nul en 100% in stappen van 10% en een totale bouwstenenconcentratie van 0,1 millimolair in PBSG. Plaats acht nanoliter druppels van deze zuivere en gemengde oplossingen op het prismaoppervlak met behulp van een non-contact spotter in viervoudige duplicaat voor elke verhouding met in totaal 44 punten. Plaats het prisma in een petrischaal met één milliliter ultrapuur water en laat het een nacht staan op kamertemperatuur voor zelfassemblage van BB een en BB twee op het gouden oppervlak. Er wordt aangenomen dat de gemiddelde oppervlaktesamenstelling in de gemengde zelfsamengestelde monolagen de samenstelling van de gemengde afzetoplossing weerspiegelt.De volgende dag, was het prisma grondig met ultrapuur water voordat u het droogt onder een stroom van Argonne. Zet de incubator waarin de apparaten voor oppervlakteplasma en resonantiebeeldvorming op 25 graden Celsius staat om brekingsindexveranderingen te voorkomen die worden veroorzaakt door temperatuurvariaties tijdens eiwitdetectie. Plaats een niet-gefunctionaliseerd spoelprisma in de 10 microliter polyether ether ketone stroomcel die is aangesloten op een computergestuurde spuitpomp, een desser en een zespoorts mediumdruk injectieklep.Vul het stroomsysteem met vers gefilterde en degasseerde lopende buffer. Verwijder het spoelprisma en plaats het prisma met de combinatorische kruisreactieve receptorarray in de stroomcel. Laat de lopende buffer met een stroomsnelheid van 100 microliter per minuut lopen. Verwijder eventuele luchtbellen op het prismaoppervlak met behulp van de CCD-camera door lopende buffer te laten passeren.Definieer snel het onderzoeksgebied voor elke plek door een cirkel te tekenen met dezelfde diameter voor het gebied van belang op basis van een goed gecontrasteerde afbeelding van de array en met behulp van geïntegreerde software in het oppervlakteplasma- en resonantiebeeldvormingssysteem, traceer plasmacurven, die reflectiviteitscurven voorstellen als functie van de invalshoeken voor alle plekken. Kies de werkhoek, die de positie is waarop kinetische curven worden opgenomen bij de hoogste helling van de reflectiviteitscurven. Draai de scanspiegel om de geselecteerde werkhoek vast te stellen voor kinetische metingen.Laat de lopende buffer door het stroomsysteem lopen totdat het reflectiviteitssignaal voor alle plekken stabiel en constant is. Injecteer vervolgens een milliliter pindalectine of een HL-oplossing met een spuit in de 500 microliter steekloop met de injectieklep op de laadpositie met een stroomsnelheid ingesteld op 100 microliter per minuut. Zet de injectieklep op de injectiepositie. Begin met kinetische metingen door reflectiviteitsvariaties tegen de tijd gelijktijdig op alle plekken te volgen aan het einde van de eiwitinjectie.Spoel de array acht minuten met lopende buffer. Injecteer ten slotte een milliliter 1%DS om de array te regenereren. Herhaal dezelfde procedure voor de andere eiwitten na het invoeren van eiwitoplossing in de stroomcel.Moleculair binding vindt plaats en induceert een verschuiving van de plasmacurven en een variatie van reflectiviteit. De beeldacquisitiesoftware zet de gemeten lichtintensiteitswaarden om in grijstintenniveaus, waardoor SPR-beelden worden verkregen en de variatie van reflectiviteit versus tijd wordt weergegeven om sensorgrammen te genereren. Gebruik vervolgens een wiskundesoftware om de reflectiviteit aan het einde van elke eiwitinjectie te plotten tegen de bouwstenenverhouding om een 2D continu evolutieprofiel voor elk monster te genereren.Ten slotte voegt u de bouwstenenverhouding toe aan de sensorgrammen om een tijdsafhankelijk continu herkenningspatroon te genereren, genaamd een 3D continu evolutielandschap voor elk eiwit om het vermogen van de elektronische tong voor algemene eiwitanalyse te testen. Er werden drie eiwitten gebruikt, HL, myoglobine en lysozym voor elk eiwit. Een duidelijk 2D continu evolutieprofiel werd gegenereerd door de elektronische tong, zoals getoond in 3D. Continue evolutielandschappen werden ook gegenereerd

electronic-tongue-generating-continuous-recognition-patterns-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.

Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Een snel protocol voor proteolytische vertering met een zelfgebouwde flow-through tryptische microreactor gekoppeld aan een elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometer wordt gepresenteerd. De fabricage van de microreactor, de experimentele opstelling en het proces voor gegevensverzameling worden beschreven.

Fast enzymatische verwerking van eiwitten voor MS Detection met een Flow-through Microreactor

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

In dit werk is het protocol besproken voor het ontwerpen en ontwikkelen van een E-Eye-Enable POCT-apparaat om Fe, Cr, As en F te detecteren in milieumonsters, biologische monsters en voedsel en dranken. Er zijn bijna 2000 monsters getest en de resultaten komen overeen met de gouden standaardtechniek.

TD-DFT Geleide geavanceerde E-Eye Sensing-techniek voor kwantificering ter plaatse van Fe, Cr, F en As in de milieu-, biologische en voedselmonsters

Leer een elektronische tong construeren voor eiwitanalyse met behulp van een combinatorische aanpak en oppervlakteplasmonresonantiebeeldvorming. Deze methode genereert continue 3D-evolutielandschappen voor efficiënte eiwitdiscriminatie.

Elektronische tong genereren Continuous Erkenning Patronen voor Protein Analysis

Meer video's verkennen