Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Het algemene doel van deze procedure is om enkele blaasjes, cytosis en endocytose te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst een schone en volledige vertering van muizenbijnierweefsel te verkrijgen. De tweede stap is om cellen van de bijnieren te dissociëren en te plateren.

Vervolgens worden chromine cellen geïdentificeerd en patch geklemd om cel-gebonden capacitieve opnames te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen enkele blaasjes, cytosis en endocytose worden waargenomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals cel-gebonden opnames van enkele ionkanalen, is dat we in staat zijn om exocytose en endocytose van enkele blaasjes te detecteren.

Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat het verkrijgen van een giga seal moeilijk te leren is. Ook kan het moeilijk zijn om cellen te identificeren tussen gemengde celtypen die in de plaat worden aangetroffen. Om je voor te bereiden op de operatie, begin met het autoclaven van een paar grote en kleine dissectiescheren en twee paar pincetten.

Plaats vervolgens de dissectielade op een ijsemmer. Begin ook met het bellen van de enzymoplossing met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof. De oplossing is helder roze voor het bellen. Vervolgens.

Na het euthanaseren en onthoofden van een pasgeboren tot driejarige muis, gebruikt u de kleinere schaar om de rug van de pup te snijden volgens de wervelkolom van de cervicale tot de caudale regio. Zorg ervoor dat u oppervlakkig onder de huid snijdt om te voorkomen dat de lichaamsholte wordt doorboord. Vervolgens pelt u de huid van de wervelkolom zodat de musculatuur wordt blootgelegd en er een duidelijk zicht op de wervelkolom is.

Maak nu een dwarsdoorsnede bij de cervicale wervelkolom en maak vervolgens twee parallelle sneden langs de zijkanten van de wervelkolom met één paar pincetten die het hoofdlichaam van het dier vasthouden. Gebruik het andere paar pincetten om de wervelkolom vast te grijpen en de wervelkolom terug te pellen tot de nieren worden blootgelegd. Nadat u de bijnieren bovenop de nieren hebt gelokaliseerd, gebruikt u pincetten om ze te verwijderen.

Plaats vervolgens de bijnieren voorzichtig in een conische buis gevuld met lock-oplossing. Gebruik een tweede paar pincetten om de bijnieren los te maken. Als ze aan het eerste paar pincetten plakken, plaatst u de conische buis op ijs.

De klieren kunnen maximaal twee uur in lock-oplossing worden bewaard. Controleer op dit punt de enzymoplossing om ervoor te zorgen dat de geëquilibreerde oplossing van helderroze kleur is veranderd in een roze-oranje kleur. Voeg vervolgens pape toe aan de vers geblonneerde enzymoplossing met een uiteindelijke concentratie van 20 tot 25 eenheden per milliliter.

Voeg vervolgens de propaan-enzymoplossing toe aan een nieuwe conische buis en gebruik pincetten om de bijnieren over te brengen naar de propaan-enzymbuis. Incubeer de klieren gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 75% van de inactiveringsoplossing toe aan elke buis en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.

Na 10 minuten, draagt u de klieren voorzichtig over in een nieuw gelabelde buis en wast u de klieren drie keer met kweekmedium. Na het wassen, plaatst u de klieren in 200 microliter van het kweekmedium, en titrateert u de klieren vervolgens voorzichtig op en neer door de pipettip van een 200 microliter pipet. Bij titratie, houdt u de klieren op de bodem van de buis met de neerwaartse kracht van de 200 microliter pipettip en betrokkenheid van het weefsel geleidelijk en langzaam. Zorg ervoor dat u langzame, continue streken gebruikt, nooit snel of abrupt pipet na titratie, voeg een extra 250 microliter kweekmedium toe om het totale volume van het kweekmedium op 450 microliter te brengen.

Plaats vervolgens zeven 12 millimeter PDL voorgecoate deksels in een 60 bij 50 millimeter kweekschaalplaat. Plateer vervolgens 60 microliter van de celbevattende oplossing op elk van de zeven deksels. Eenmaal geplaatst, plaatst u de schaal in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na incubatie, voegt u voorzichtig vijf milliliter voorverwarmd kweekmedium toe aan de kweekschaal, en incubeert u vervolgens gedurende 24 uur voordat u cel-gebonden opnames uitvoert. Na de incubatie plaatst u de 12 millimeter deksel met de bijniercellen in de extracellulaire oplossing. Aangezien de hele bijnieren werden gebruikt, is de volgende stap om te differentiëren tussen de chromine cellen en corticale cellen.

In cultuur zijn de chromine cellen typisch zeer helder met een bruinige beige kleurstelling en een bijna perfecte ronde vorm. In tegenstelling tot de corticale cellen, die kleiner en dimmer zijn dan de CHRO-cellen. Nadat de patch pipetten zijn getrokken zoals beschreven in het tekstprotocol, dompelt u de pipettip in gesmolten was om de capaciteit van het glas te verminderen.

Polijst vervolgens het tipje om het was van binnenuit de pipettip te blazen. Bouw vervolgens de pipet op met de patch pipetoplossing zodat de weerstand ongeveer twee mega ohm is. Bevestig de patch pipet aan zijn manipulator en breng deze binnen enkele micrometer van de cel.

Ga door met het voortbrengen van de pipet op zoek naar enige lichte celdeformatie. Zodra de vervorming wordt opgemerkt, past u zachte zuiging toe totdat een giga om-seal is bereikt. Dit levert een cel-gebonden configuratie op.

Zodra een giga om-seal is onthuld, maakt u cel-gebonden opnames door gebruik te maken van een EPC zeven plus patch clamp versterker, en een twee-fase analoge lock-in versterker zoals beschreven in het tekstprotocol, stel de fase van de lock-in versterker zo in dat transiente capacitieve veranderingen geproduceerd door zachte zuiging. Pulsen verschijnen alleen in de patch capacitieve, of Im-trace zonder projectie in de patch, geleidbaarheid of retrace de patch-procedure dient als mechanische stimulatie. Aangezien actie-stroom doorgaans kan worden opgenomen van de meeste cellen, identificeert u typische capacitieve veranderingen door