Name: Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer cel-gekoppelde capaciteitsmetingen in muizenbijnierchromaffiencellen. Deze methode detecteert enkelvoudige vesikel-exocytose en endocytose met patch-clamp-technieken voor inzicht in synaptische transmissie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een National Science Foundation award (1145581) aan LWG.

OPMERKING: De hele procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health, zoals goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Illinois in Chicago. 1 Solutions en cultuur Media Voorbereidingen <ol><li> Houd alle oplossingen bij -20 ° C gedurende maximaal zes maanden. Houd het kweekmedium bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden. </li><li> Bereiding van 100 ml van de cultuur media door het mengen van 1 ml van pen-strep-oplossing en 1 ml van ITSX (insuline-transferrine-Selenium-Suppletie) om met DMEM 100 ml. </li><li> Bereid enzymoplossing door het mengen van 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl2 en 2,5 ml van 50 mM EDTA. </li><li> Bereid inactivering oplossing door het mengen van 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albumine en 625 mg trypsine inhibitor. </li><li> Bereid een Locke&#39;s oplossing van 154 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5.6 mM glucose. Breng de pH op 7,3 met NaOH. </li><li>Bereid een poly-d-lysine (PDL) oplossing van 50 mg / ml. Gebruik een eindconcentratie van 1 mg / ml te bekleden dekglaasjes. </li><li> Bereid een extracellulaire oplossing van 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, en 10 mM glucose. Breng de pH op 7,3 met NaOH met een osmolariteit van ~ 310 nmol / kg. </li><li> Bereid een pipet oplossing van 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 10 mM HEPES. Breng de pH op 7,3 met NaOH met een osmolariteit van ~ 290 nmol / kg. </li></ol> 2 bijnier Isolatie <ol><li> Autoclaaf een paar grote en kleine dissectie schaar en twee paar pincetten. Draag handschoenen tijdens het hele proces en plaats de dissectie dienblad op een ijsemmer. </li><li> Gebruik muizen genomen op dag 0-3. Euthanaseren dieren met een onder druk CO 2 tank, gevolgd door onthoofding. </li><li> Gebruik maken van de kleinere set van schaar om naar aanleiding van de wervelkolom van cervi bezuinigen de achterkant van de pup<html> cal tot regio caudaal. Zorg ervoor dat u oppervlakkig snijden onder de huid en niet prikken in de lichaamsholte. </li><li> Vervolgens schil huid weg van de wervelkolom, zodat musculatuur wordt blootgesteld aan een duidelijk beeld van de wervelkolom hebben. Vanaf hier, maak een transectional cut bij het cervicale ruggenmerg en vervolgens twee parallelle sneden langs de zijden van de wervelkolom. </li><li> Met een pincet het vasthouden van de belangrijkste lichaam van het dier, gebruik de andere tang om de wervelkolom te grijpen en te pellen terug wervelkolom tot nieren worden blootgesteld. </li><li> Momenteel visualiseren bijnieren bovenop de nieren. Vervolgens voorzichtig plaats de twee klieren van elk dier in een conische buis gevuld met Locke&#39;s oplossing. OPMERKING: Soms zijn de klieren zal vasthouden aan de tang. In dat geval gebruikt voorzichtig een tang om te helpen bij de verwijdering van de klieren van de tang en in de Locke&#39;s oplossing. De klieren in deze toestand gehouden tot 2 uur. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Tissue Spijsvertering <ol><li> Ondertussen bel de enzymoplossing met 5% CO2 + 95% O2 gedurende 15 min vóór gebruik. Zorg ervoor dat het evenwicht gebracht oplossing verandert van een heldere roze kleur in roze / oranje kleur. </li><li> Voeg de papaïne op recent borrelde enzymoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 20-25 eenheden / ml. Incubeer elk paar klieren van elk dier voor 40-60 min bij 37 ° C in de enzymoplossing met papaïne. </li><li> Voeg 75% inactivering oplossing aan elke buis en incubeer bij 37 ° C gedurende nog 10 minuten. Deze incubatie inactiveert de enzymactiviteit van papaïne. </li><li> Na de 10 minuten incubatie met de inactivatie oplossing, voorzichtig overdracht van de klieren in een nieuw label buis en spoel daarna de klieren 3x met cultuur media. </li></ol> 4 Cel Dissociatie en Plating <ol><li> Na het wassen, plaats de twee klieren in 200 ul van de cultuur media en dan zachtjes titreer de klieren enbeneden door de pipetpunt met een 200 ul pipet totdat er niet langer een groot stuk weefsel in de oplossing. OPMERKING: Bij titreren, handhaven klieren aan de onderkant van de buis met een neerwaartse kracht van 200 ul pipetpunt en grijpen het weefsel voorzichtig en langzaam. Wees er zeker van te langzame, continue bewegingen te gebruiken, nooit pipetteren snel of abrupt. </li><li> Voeg een extra 250 ul cultuur media om het totale volume van de cultuur media tot 450 ul brengen. </li><li> Plaat 60 gl van deze cel-bevattende oplossing op elk van zeven 12 mm PDL-pre-beklede dekglaasjes, die in een 60 x 15 mm kweekschaal geplaatst. </li><li> Eenmaal geplateerd, zet de schaal in de incubator die op 37 ° C gehouden en met een constante stroom / toevoer van 5% CO2 gedurende 30 minuten om een omgeving voor cellevensvatbaarheid waarborgen. Na incubatie voorzichtig 5 ml voorverwarmde kweekmedium in de kweekschaal en keren de schaal terug in de incubator gedurende 24 uur voorafgaand aan cel-attached opnamen. OPMERKING: Gewoonlijk kunnen de cellen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames tot 4 dagen. </li></ol> 5 Cel Identificatie en Gigaohm Seal Vorming <ol><li> Plaats de 12 mm dekglaasje in extracellulaire oplossing. Aangezien de gehele bijnieren voor celbereiding, meng de chromaffine cellen (typisch zeer helder met een bruine / beige kleur en een bijna perfecte cirkelvorm (figuur 1) in kweek met corticale cellen (kleiner en zwakker dan chromaffinecellen). </li><li> Trek de patch pipetten in vier stappen met behulp van een programmeerbare P-97 trekker. Dompel de pipet in een gesmolten was, die zal helpen om de capaciteit van het glas te verminderen en vervolgens het vuur polish de tip om &quot;blow-away&quot; deze was van de binnenkant van de pipet tip. OPMERKING: Wanneer gevuld met patch pipetoplossing, patch pipetten hebben meestal een weerstand van ~ 2 MQ. </li><li> Nader de patch pipet dichtbij de cel binnen enkele microns. Een-cel aangesloten configuratie bereiken kijken voor een kleine cel vervorming tijdens de nadering van de patch pipet dichter bij de cel. Solliciteer zachte zuigkracht tot een GQ afdichting wordt bereikt. </li></ol> 6-Cell Attached Capaciteit Recordings <ol><li> Zodra een GQ afdichting wordt geopenbaard, maak-cel aangesloten opnamen door middel van een EPC-7 plus patch-clamp versterker en een tweefasen analoog invangversterker (zie bijgevoegde tabel apparatuur). Breng een sinus met een amplitude van 50 mV (rms) en de frequentie van 20 kHz van de lock-in versterker. </li><li> Stel het uitgangsfilter van de lock-in versterker 1 msec tijdconstante en 24 db. Stel de fase van de lock-in versterker zodanig dat voorbijgaande capaciteitsveranderingen door zachte zuigkracht pulsen alleen in de patch capaciteit (Im) trace zonder uitsteeksel in de patch geleiding (Re) trace weergegeven (figuur 2). OPMERKING: Zie de details voor de kalibratie van het systeem in reFerence 19. </li><li> Identificeer typische capaciteitsveranderingen door &quot;omlaag&quot; stappen (figuur 3). OPMERKING: Een stevige opname wordt gezien als een &quot;trap&quot; type gelijkenis met vele neerwaartse stappen, die aangeeft internaliserende enkele vesicles. De patching proces dient als een mechanische stimulatie sinds actie huidige doorgaans kan worden opgenomen van de meeste cellen. </li><li> Bestanden als afzonderlijke mappen inclusief datum: dd / mm / jaar en elke cel aangesloten opname als zijn eigen individuele nummering (xx) in dat bestand. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

-Cel bevestigd capacitieve metingen vereisen een aantal cruciale stappen om opnames met een hoge kwaliteit met succes te verkrijgen: 1) levensvatbare en gezonde cellen bereid uit bijnieren; 2) PDL coating van de dekglaasjes; 3) gigaohm afdichting formatie; 4) geluidsniveau van het systeem; en 5) fase correctie. Voor dierlijke chirurgie, wijzigingen kan men mogelijk te maken is om de chirurgische benadering van de beste pak behendigheid te passen en om schade tijdens dissectie te voorkomen. D...

Synaptische transmissie gemedieerd door exocytose van neurotransmitter bevattende synaptische blaasjes en deze vesicles moeten lokale endocytische recycling in het zenuwuiteinde ondergaan neuronale communicatie op lange termijn. Gezien de essentiële rol van synaptische transmissie in de hersenen, het begrijpen van de moleculaire machinerie die vormt het synaptische vesikel cyclus is een essentiële basis op weg naar een beter begrip van de cellulaire communicatie als geheel. Onder cel modelsystemen, heeft de adrenale chromaffine cel aantal van de meest definitieve inzichten in de moleculaire machinerie onderliggende synaptische vesikel recycling. Exocytose, de laatste stap in neurotransmitter afgifte, is enorm bestudeerd en door gebruikmaking van de adrenale chromaffine cel 1,2 onderzocht. In feite zijn de meeste van de moleculaire spelers die de vorming, targeting, docking, en fusie van secretoire korrels orkestreren geïdentificeerd als gevolg van toepassing van diverse technieken chromaffinecellen 1. Bovendien, door de mogelijkheid om voor eenmalig vesicle resolutie van het eiwit machine betrokken exocytose, de chromaffine cel nog altijd een model op de vragen van de vesikel fusie 3 pakken. Cel verbonden capaciteitsmetingen werden eerst gebruikt bij het ​​oplossen van enkele vesikel fusie gedurende exocytose 3. Exocytosis vesicles van slechts ~ 60 nm in diameter is aangetoond worden gedetecteerd door celmembraan toegang metingen met de patch clamp techniek in de cel bijgevoegde configuratie 4-7. Toegang wordt gedefinieerd als een maat voor hoe gemakkelijk een circuit of apparaat zal een stroom vloeien; is de inverse van impedantie. Aldus toelating metingen geven inzicht in de membraancapaciteit. Dit wordt bewerkstelligd door de opname van de vesiculaire membraan in de plasmamembraan; deze integratie blijkt dat er veranderingen in het oppervlakGebied 8. Elke fusing blaasje zorgt voor een stapsgewijze verhoging van de membraan capaciteit 9,10. Daarnaast biedt deze toegang meting geeft het membraan geleidbaarheid en het fusie porie geleiding tijdens een exocytotische event 3. Omdat deze techniek een uniek instrument op het identificeren van enkel-blaasje kinetiek tijdens exocytose heeft verstrekt, heeft ons lab onlangs toegepast dit concept tot endocytose van enkele blaasjes 11,12 detecteren. Onze specifieke belang clathrine gemedieerde endocytose (CME), die is beschouwd als een fundamenteel housekeeping component in vele cellen 13 en als een belangrijke route voor synaptische blaasjes endocytose in neuronale terminals 14,15. CME is bekend biologisch belangrijk te zijn, echter, zijn de kinetiek nog niet goed begrepen door technische beperkingen bij het toezicht enkelvoud endocytisch evenementen. Gezien de overeenkomsten in exocytische mechanismen tussen chromaffin cellen en neuronen 1, is het plausible dat de kernsplijting mechanismen in chromaffinecellen waarschijnlijk kan gelden voor synaptische blaasjes endocytose in neuronen. De cel bijgevoegde capaciteitsmetingen zijn gebruikt volgen individuele endocytische gebeurtenissen en de splitsing kinetiek, die de meeste methoden niet kunnen opgelost analyseren. In onze cel bevestigd opnames wordt een sinus bij 20 kHz weergegeven over het houden van potentieel, en de output stroom wordt gescheiden in membraan geleiding in het ene kanaal en membraan capaciteit in het andere kanaal van een twee-fase lock-in versterker 16- 18. Van de veranderingen in het membraan geleiding en capaciteit, kan men de kinetiek van de splitsing poriën, die waarschijnlijk overeenkomt met het buisvormige membraan hals dat de internaliserende blaasje verbinding met de plasmamembraan vóór vesikel pinch-off berekenen. Collectief, deze techniek geeft ons de gelegenheid om de regulerende mechanismen van blaasje kernsplijting onderzoeken tijdens CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Beschermen tegen UV</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Alleen ontdooien op IJS!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus patch amplifier</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 data acquisition board</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor data acquisition software</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Buitendiamter: 1,5 mm 
Binnendiameter: 1,10 mm 
Lengte: 10 cm</td></tr></tbody></table>

methoden voor-cell bevestigd capaciteitsmetingen in muis bijnier chromaffinecellen cell

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Neuronale transmissie is een integraal onderdeel van cellulaire communicatie in de hersenen. Depolarisatie van het presynaptische membraan leidt tot fusie van blaasjes, bekend als exocytose, die synaptische transmissie mediëren. Het vervolgens ophalen van synaptische blaasjes is noodzakelijk om nieuwe, met neurotransmitter gevulde blaasjes te genereren in een proces dat bekend staat als endocytose. Tijdens exocytose zal het fuseren van blaasmembranen resulteren in een toename van het oppervlak en de daaropvolgende endocytose resulteert in een afname van het oppervlak. Hier toont ons lab een basisintroductie van cel-gehechte capaciteitsopnames van enkele endocytische gebeurtenissen in de muizen bijnier chromaffine cel. Dit type elektrische opname is nuttig voor hoge resolutie opnames van exocytose en endocytose op het niveau van een enkele blaasjes. Hoewel deze techniek zowel blaasjes exocytose als endocytose kan detecteren, ligt de focus van ons lab op blaasjes endocytose. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de kinetiek van enkele endocytische gebeurtenissen te analyseren. Hier worden de methoden voor de dissectie van muisbijnierweefsel, chromaffine celcultuur, basis cel-gehechte technieken en daaropvolgende voorbeelden van individuele sporen die een enkele endocytische gebeurtenis meten, beschreven.

De cellevensvatbaarheid en de kwaliteit van gigaohm afdichting kritisch bij het bepalen van de kwaliteit van het cel aangesloten capaciteit opnamen. Daarom is het essentieel om een effectieve en efficiënte celkweek schaffen voor elektrofysiologische opnames, en typische levensvatbare cellen zijn geïllustreerd in figuur 1. Practice en tijd nuttig in het bereiken van een gigaohm zegel met hoge kwaliteit. Als men duidelijk kan zien celvervorming wanneer de patch pipet nadert de cel zoals beschreven in prot...

Na exocytose wordt het gefuseerde plasmamembraan teruggewonnen via een proces dat bekend staat als endocytose. Dit mechanisme vormt nieuwe synaptische blaasjes voor de volgende ronde van afgifte. Individuele endocytische gebeurtenissen worden vastgelegd en geanalyseerd door middel van cel-gebonden capacitieve opnames in muisbijnierchromaffinecellen.

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Het algemene doel van deze procedure is om enkele blaasjes, cytosis en endocytose te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst een schone en volledige vertering van muizenbijnierweefsel te verkrijgen. De tweede stap is om cellen van de bijnieren te dissociëren en te plateren.Vervolgens worden chromine cellen geïdentificeerd en patch geklemd om cel-gebonden capacitieve opnames te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen enkele blaasjes, cytosis en endocytose worden waargenomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals cel-gebonden opnames van enkele ionkanalen, is dat we in staat zijn om exocytose en endocytose van enkele blaasjes te detecteren.Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat het verkrijgen van een giga seal moeilijk te leren is. Ook kan het moeilijk zijn om cellen te identificeren tussen gemengde celtypen die in de plaat worden aangetroffen. Om je voor te bereiden op de operatie, begin met het autoclaven van een paar grote en kleine dissectiescheren en twee paar pincetten.Plaats vervolgens de dissectielade op een ijsemmer. Begin ook met het bellen van de enzymoplossing met 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof. De oplossing is helder roze voor het bellen. Vervolgens.Na het euthanaseren en onthoofden van een pasgeboren tot driejarige muis, gebruikt u de kleinere schaar om de rug van de pup te snijden volgens de wervelkolom van de cervicale tot de caudale regio. Zorg ervoor dat u oppervlakkig onder de huid snijdt om te voorkomen dat de lichaamsholte wordt doorboord. Vervolgens pelt u de huid van de wervelkolom zodat de musculatuur wordt blootgelegd en er een duidelijk zicht op de wervelkolom is.Maak nu een dwarsdoorsnede bij de cervicale wervelkolom en maak vervolgens twee parallelle sneden langs de zijkanten van de wervelkolom met één paar pincetten die het hoofdlichaam van het dier vasthouden. Gebruik het andere paar pincetten om de wervelkolom vast te grijpen en de wervelkolom terug te pellen tot de nieren worden blootgelegd. Nadat u de bijnieren bovenop de nieren hebt gelokaliseerd, gebruikt u pincetten om ze te verwijderen.Plaats vervolgens de bijnieren voorzichtig in een conische buis gevuld met lock-oplossing. Gebruik een tweede paar pincetten om de bijnieren los te maken. Als ze aan het eerste paar pincetten plakken, plaatst u de conische buis op ijs.De klieren kunnen maximaal twee uur in lock-oplossing worden bewaard. Controleer op dit punt de enzymoplossing om ervoor te zorgen dat de geëquilibreerde oplossing van helderroze kleur is veranderd in een roze-oranje kleur. Voeg vervolgens pape toe aan de vers geblonneerde enzymoplossing met een uiteindelijke concentratie van 20 tot 25 eenheden per milliliter.Voeg vervolgens de propaan-enzymoplossing toe aan een nieuwe conische buis en gebruik pincetten om de bijnieren over te brengen naar de propaan-enzymbuis. Incubeer de klieren gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 75% van de inactiveringsoplossing toe aan elke buis en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.Na 10 minuten, draagt u de klieren voorzichtig over in een nieuw gelabelde buis en wast u de klieren drie keer met kweekmedium. Na het wassen, plaatst u de klieren in 200 microliter van het kweekmedium, en titrateert u de klieren vervolgens voorzichtig op en neer door de pipettip van een 200 microliter pipet. Bij titratie, houdt u de klieren op de bodem van de buis met de neerwaartse kracht van de 200 microliter pipettip en betrokkenheid van het weefsel geleidelijk en langzaam. Zorg ervoor dat u langzame, continue streken gebruikt, nooit snel of abrupt pipet na titratie, voeg een extra 250 microliter kweekmedium toe om het totale volume van het kweekmedium op 450 microliter te brengen.Plaats vervolgens zeven 12 millimeter PDL voorgecoate deksels in een 60 bij 50 millimeter kweekschaalplaat. Plateer vervolgens 60 microliter van de celbevattende oplossing op elk van de zeven deksels. Eenmaal geplaatst, plaatst u de schaal in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Na incubatie, voegt u voorzichtig vijf milliliter voorverwarmd kweekmedium toe aan de kweekschaal, en incubeert u vervolgens gedurende 24 uur voordat u cel-gebonden opnames uitvoert. Na de incubatie plaatst u de 12 millimeter deksel met de bijniercellen in de extracellulaire oplossing. Aangezien de hele bijnieren werden gebruikt, is de volgende stap om te differentiëren tussen de chromine cellen en corticale cellen.In cultuur zijn de chromine cellen typisch zeer helder met een bruinige beige kleurstelling en een bijna perfecte ronde vorm. In tegenstelling tot de corticale cellen, die kleiner en dimmer zijn dan de CHRO-cellen. Nadat de patch pipetten zijn getrokken zoals beschreven in het tekstprotocol, dompelt u de pipettip in gesmolten was om de capaciteit van het glas te verminderen.Polijst vervolgens het tipje om het was van binnenuit de pipettip te blazen. Bouw vervolgens de pipet op met de patch pipetoplossing zodat de weerstand ongeveer twee mega ohm is. Bevestig de patch pipet aan zijn manipulator en breng deze binnen enkele micrometer van de cel.Ga door met het voortbrengen van de pipet op zoek naar enige lichte celdeformatie. Zodra de vervorming wordt opgemerkt, past u zachte zuiging toe totdat een giga om-seal is bereikt. Dit levert een cel-gebonden configuratie op.Zodra een giga om-seal is onthuld, maakt u cel-gebonden opnames door gebruik te maken van een EPC zeven plus patch clamp versterker, en een twee-fase analoge lock-in versterker zoals beschreven in het tekstprotocol, stel de fase van de lock-in versterker zo in dat transiente capacitieve veranderingen geproduceerd door zachte zuiging. Pulsen verschijnen alleen in de patch capacitieve, of Im-trace zonder projectie in de patch, geleidbaarheid of retrace de patch-procedure dient als mechanische stimulatie. Aangezien actie-stroom doorgaans kan worden opgenomen van de meeste cellen, identificeert u typische capacitieve veranderingen door

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Bijniermerg chromaffin celkweek systemen zijn uiterst nuttig voor de studie van de excitatie-secretie koppeling in een in vitro setting. Dit protocol geeft de methode die wordt gebruikt om de bijnieren ontleden en vervolgens de medullaire regio te isoleren door het strippen van weg de bijnierschors. De vertering van de medulla in enkele chroomaffiene cellen wordt dan aangetoond.

Muis bijnier Chromaffinecellen Cell Isolatie

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Hier presenteren we een methode om te isoleren van de bijnieren van muizen, repareren de weefsels, sectie hen en uitvoeren immunofluorescentie kleuring.

Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Het hormoon afgescheiden door de bijnierschors is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. Hier presenteren we een protocol bij de cultuur de primaire rat bijnier cellen. Het zou een goede in-vitro platform voor onderzoek naar de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier steroidogenesis en lipide biosynthese.

Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Een robuuste en reproduceerbare methode om 2D-primaire culturen van met zona glomerulosa- en zona-fasciculata-verrijkte cellen te vestigen werd ontwikkeld voor de bijnierschors van de muis. Dit systeem behoudt belangrijke moleculaire en functionele kenmerken van elke zone, waardoor gericht onderzoek mogelijk is naar signaalroutes, hormoonproductie en bijniercorticale celgedrag ex vivo.

Vestiging van zone-verrijkte primaire culturen uit de bijnierschors van de muis

Leer cel-gekoppelde capaciteitsmetingen in muizenbijnierchromaffiencellen. Deze methode detecteert enkelvoudige vesikel-exocytose en endocytose met patch-clamp-technieken voor inzicht in synaptische transmissie.

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Meer video's verkennen