Name: Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer MALDI-TOF MS voor snelle bacteriële identificatie met behulp van massaspectrometrie en een aangepaste database. Deze methode ondersteunt microbiologisch onderzoek naar karakteristieke piekpatronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het New College of Interdisciplinary Arts and Sciences aan de Arizona State University, Applied Maths NV, en door de National Science Foundation (ROA Aanvulling op Award Nr. MCB0604300). Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteur(s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

Let op: Unidentified bacteriën uit elke omgeving kunnen pathogene zijn en moet met de nodige voorzichtigheid worden behandeld met behulp van geschikte bioveiligheid protocollen. Werken met levende culturen moet in een klasse II bioveiligheid kast worden uitgevoerd met behulp van Biologische Veiligheid Niveau 2 (BSL-2) procedures. Meer informatie over BSL-2 procedures is beschikbaar in de CDC / NIH handleiding getiteld, &quot;Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories&quot;, pagina&#39;s 33-38. Het document is online beschikbaar op <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a> . Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van witte jassen / jassen, veiligheidsbril, en nitril of latex handschoenen, moeten worden gedragen. Standaard microbiologische methoden en voorzorgsmaatregelen moeten worden gevolgd, en biologisch gevaarlijk afval moet op passende wijze worden weggegooid. Bacteriën die in deze demonstratie werden geïsoleerd uit Kartchner Caverns,AZ, USA, uit vier omgevingen, waaronder droge speleothem, stroom steen, vochtige speleothem en stalactieten druppelen (tabel 1). Alle isolaten werden geïdentificeerd door 16S rDNA sequentie en bij -80 ° C in 25% glycerol-R 2 B medium gehouden. Alle experimenten werden voltooid bij kamertemperatuur. Opmerking: Wij raden het gebruik van hetzelfde monster bereidingswijze massa spectra voor database-bouw en massa spectra van onbekenden te verwerven. Monstervoorbereiding methode is eerder aangetoond dat het invloed spectrum kwaliteit en reproduceerbaarheid 3. Met behulp van een andere steekproef bereidingswijze kan onjuiste identificatie van onbekenden, vooral wanneer hogere taxonomische resolutie (bv De stam van) veroorzaken gewenst is. 1. Afzetting op de MALDI Target Let op: Verschillende protocollen te verkrijgen eiwitextracten vereisen het gebruik van zuren en organische oplosmiddelen die moeten worden gebruikt in overeenstemming met de GUIDElines en informatie in hun respectieve Materials veiligheidsinformatiebladen (VIB). Geschikte beschermingsmiddelen moeten worden gedragen en zal variëren op basis van het type en het volume van de chemicaliën die worden gebruikt (bijvoorbeeld lab jassen / jassen, handschoenen, een veiligheidsbril, en ademhalingsbescherming moet gebruikt worden bij het ​​werken met grote hoeveelheden giftige, brandbare oplosmiddelen, zoals acetonitril, en bijtende zuren, zoals mierezuur en trifluorazijnzuur). <ol><li> Borg 1 pl proteïne-extract, die geen levensvatbare cellen (verkregen met behulp van passende, eerder beschreven protocollen 11-13) op een roestvrij stalen MALDI doel plaat en laat ze drogen. Overlay het gedroogde eiwit extract met 1 pi matrixoplossing (α-cyano-4-hydroxy-kaneelzuur oplossing) en laten drogen. </li><li> Voor elke biologische repliceren, spot een passend aantal technische herhalingen (5-20 technische replica). Hier, spot 10 technische replica voor elke biologische repliceren en 3 biologische herhalingen wEre voorbereid. Opmerking: Wij raden het gebruik van een gepolijste stalen MALDI richtplaat bij het gebruik van het eiwit extractie monstervoorbereiding methode. Met behulp van geslepen stalen doelwit platen kunnen veroorzaken verspreiden en onopzettelijke vermenging van de verschillende monsters buitenkant van individuele monsterputjes. </li><li> Borg 1 ui kalibrant standaard op de doelgroep bord en laat ze drogen. Overlay met 1 ui matrix-oplossing en laat ze drogen. </li><li> Breng 2 pi matrixoplossing op de trefplaat als een negatieve controle. </li></ol> 2. Mass Spectra Acquisitie <ol><li> Gebruik een MALDI-TOF massaspectrometer uitgerust met een stikstof laser (λ = 337 nm) en gebruikt Bruker FlexControl software. </li><li> Verzamel elk massaspectrum in positieve lineaire modus door ophoping van 500 laser schoten in stappen van 100 geschoten. Stel de ionenbron 1 spanning tot 20 kV; ionbron 2 spanning tot 18.15 kV; en de lens voltage tot 9,05 kV. Merk op dat deze parameters zijn instrument-specific en misschien aanpassing op andere instrumenten nodig om optimale resultaten te verkrijgen. </li><li> Stel de massa-tot-lading bereik voor automatische spectrum evaluatie van 2 tot 20 kDa per lading. Gebruik het zwaartepunt piekdetectie algoritme. Stel de minimale resolutie drempel bij 100 Da. Stel de signaal-ruisverhouding (S: N) drempel 2. Stel de minimale intensiteit drempel op 100. </li></ol> 3. Database Bouw <ol><li> Database-ontwerp <ol><li> Maak een nieuwe database in BioNumerics 7.1 met behulp van de &quot;Nieuwe database tovenaar&quot;. </li><li> Maak een spectrum soort experiment, bijvoorbeeld, Maldi, met behulp van commando&#39;s in het &quot;Experiment Types&quot; paneel. </li><li> Maak de niveaus met behulp van de &quot;Database ontwerp panel&quot;. Voeg nieuwe niveaus met behulp van de &#39;Level&gt; Voeg nieuwe level ... &quot;opdracht in het menu&quot; Database &quot;. Hier maken &quot;Soort&quot; niveau &quot;Biologische repliceren&quot; niveau &quot;en&quot; Technische repliceren &quot;niveau, respectieely. </li></ol></li><li> Importeren en voorbewerken ruwe massa spectra <ol><li> Exporteer de ruwe massa spectra als .txt-bestanden met behulp van FlexAnalysis door te klikken op de &quot;Exporteer&gt; Massa spectrum&quot; commando in het menu &quot;Bestand&quot;. </li><li> Importeren het ruwe massaspectra (.txt bestanden) in de database van het niveau van de technische duplo&#39;s. </li><li> Preprocess de ruwe massa spectra. <ol><li> Import en resamplen (met behulp van een kwadratische fitting algoritme). </li><li> Voer een basislijn aftrekken (met een rollende schijf met een grootte van 50 punten). </li><li> Berekenen ruis [Continue Wavelet Transformatie (CWT)], glad (Kaiser Venster met een venster grootte van 20 punten en bèta van 10 punten), en het uitvoeren van een tweede aftrekken van de basislijn (rollende schijf met een grootte van 200 punten). </li><li> Detect pieken [CWT minimaal signaal-ruisverhouding (S: N) 10]. </li></ol></li><li> Na de voorbewerking, sparen karakteristieke patronen van elk massaspectrum, zoals piek lijsten met peakformaten piekintensiteiten, S: N, etc. in de database. </li></ol></li><li> Het creëren van samengestelde massa spectra <ol><li> Maken composiet spectra van voorbewerkte spectra met behulp van de &quot;Vat ...&quot; opdracht in het menu &quot;Analyse&quot;. Kies de &quot;Biologische repliceren&quot; als streefwaarde. </li><li> Hier combineren massaspectra van 10 technische replicaten van dezelfde kolonie om een ​​samengesteld massaspectrum opleveren die kolonie, waardoor drie samengestelde massa spectra die isoleren in de &quot;Biologische repliceren&quot; niveau. </li><li> Hier, een samenvatting van de drie samengestelde spectra op één samengestelde spectrum voor dat isoleren op de &quot;Soort&quot; niveau te creëren. Opmerking: De samengestelde spectrum is het punt voor punt gemiddelde van de technische duplo&#39;s. Duplo&#39;s met gelijkenis (Pearson correlatie) met het gemiddelde van minder dan 95% (standaardinstelling) zijn uitgesloten van de composiet. Pieken op de samengestelde spectra worden alleen ingeschakeld wanneer zij aanwezig zijn in 75% (standaardinstelling) van de opgenomen herhalingen. Voor de biologische herhalingen, deze instellingen waren 90 en 60%, respectievelijk. </li></ol></li></ol> 4. Massa Spectrum Data Analyse <ol><li> Selecteer de gegevens in de database en maak een vergelijking door te klikken op de &quot;Create new vergelijking&quot; commando in de &quot;Vergelijkingen&quot; paneel. </li><li> Hier, gebruik maken van de massa spectra bij de &quot;Technische repliceren&quot; en / of &quot;biologische repliceren&quot; levels om vergelijkingen en analyses tonen. </li><li> Similarity-gebaseerde cluster analyse en multi-dimensionale scaling (MDS) <ol><li> Maak groepen met kleuren. Selecteer de drie biologische samengestelde massa spectra en klik op de &quot;nieuwe groep aanmaken van selectie&quot; opdracht in het menu &quot;Groepen&quot; om een ​​groep te maken voor de overeenkomstige isolaat. Wijst een kleur automatisch gebruikt voor deze drie massa spectra. </li><li> Als alternatief definiëren veld staten met bijbehorende kleuren met behulp van de commando&#39;s in de &quot;Databasevermeldingen &quot;paneel, dat elke groep op basis van dit gedefinieerd veld gebruikt dezelfde kleur gedefinieerd voor deze groep. </li><li> Voeren cluster analyse. Klik op de &quot;Bereken cluster analyse&quot; opdracht in het menu &quot;Clustering&quot;. Op de Vergelijking instellingen Page 1, selecteert u de &quot;Pearson correlatie&quot; en laat andere parameters als standaard. Op pagina 2, selecteert u &quot;UPGMA&quot;. Klik vervolgens op &quot;Finish&quot;. </li><li> Het verkrijgen van een MDS plot met behulp van de &quot;Multi-dimensionale scaling ...&quot; commando in het menu &quot;Statistieken&quot;. </li></ol></li><li> Peak matching <ol><li> Klik op het spectrum soort &quot;Maldi&quot; in de &quot;Experimenten&quot; paneel. Selecteer vervolgens &quot;Layout&gt; Show image&quot;. Spectra worden als gel bands. </li><li> Voeren piek matching met behulp van de &quot;Doe piek matching&quot; opdracht in het menu &quot;Spectra&quot;. </li></ol></li><li> Identificatie van piek klassen <ol><li> Voeren principale componenten analyse (PCA). Markeer de &quot;Maldi &quot;type experiment in het&quot; experimentele &quot;paneel en de&quot; Principal Components Analysis ... &quot;commando in het menu&quot; statistisch &quot;PCA voeren. </li><li> Voer twee-weg clustering. Klik op de &quot;Statistieken&gt; Matrix mining&quot; ... in het venster &quot;Vergelijking&quot;. De intensiteit van de pieken afgestemd op de top klassen vertegenwoordigd met verschillende kleuren (warmte kaart). </li></ol></li></ol> 5. Bacteriën Identificatie met een aangepaste database <ol><li> Gelijkenis-coëfficiënt gebaseerde methode <ol><li> Maak een vergelijking en het genereren van een dendrogram gebaseerd op massa spectra bij de &quot;Technische repliceren&quot; niveau, zoals beschreven in stap 4.3.3. Sla het dendrogram voor de vergelijking van de gelijkenis. </li><li> Selecteer een onbekende massa spectrum, en klik op de &quot;Analyse&gt; Identificeer geselecteerde items&quot;. Het dialoogvenster identificatie verschijnt. </li><li> Selecteer de &quot;Vergelijking op basis van&quot; classifier type (of een opgeslagen Classifier) en klik op &quot;volgende&quot;. Op de volgende pagina kiest u de opgeslagen dendrogram als referentie vergelijking en klik op &quot;volgende&quot;. </li><li> Kies de &quot;Basic gelijkenis&quot; als identificatiemethode en klik op &quot;volgende&quot;. </li><li> Kies de &quot;Maximum gelijkenis&quot; als scoringsmethode. Typ in passende drempelwaarden en minimaal verschil waarden voor elke parameter en klik op &quot;volgende&quot;. </li><li> Nadat de berekeningen zijn voltooid, wordt de identificatie venster. In de &quot;Resultaten&quot; paneel, worden de leden van de database die het beste passen bij het onbekende vermeld. </li><li> Sla het project identificatie en validatie van de identificatie met behulp van de &quot;cross-validatie analyse&quot; commando in de &quot;Identification project&quot; paneel. </li></ol></li><li> Potentiële-biomarker gebaseerde methode <ol><li> Definieer piek klassen. In het venster &quot;Matrix Mining&quot;, selecteer sets van pieken delen van gemeenschappelijke kenmerken en definieer deze pieken als specific piek klassen (potentiële biomarkers) met behulp van &quot;Spectra&gt; Beheer soorten piek klasse ...&quot; in het venster &quot;Vergelijking&quot;. </li><li> Hier definieert piek klassen specifiek voor elk isolaat van alle 15 isolaten. </li><li> Selecteer de massaspectra van onbekenden en overeenkomen met de toppen van deze spectra met de gedefinieerde piek klassen zoals eerder beschreven. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Siegrist, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+and+characterization+of+environmental+strains+of+Escherichia+coli+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).</a> J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).</li>
<li>Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+and+sample+preparation+methods+affect+spectrum+quality+and+reproducibility+during+profiling+of+Staphylococcus+aureus+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).</li>
<li>Benagli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+MS+identification+database+at+genospecies+level+for+clinical+and+environmental+Aeromonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Sauer, S., Kliem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+tools+for+the+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).</li>
<li>Bohme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpectraBank%3A+An+open+access+tool+for+rapid+microbial+identification+by+MALDI-TOF+MS+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting.</a> Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).</li>
<li>Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cell+mass+spectrometry+%28ICMS%29+used+to+type+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+media+effects+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.</a> J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).</li>
<li>Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+environmental+bacterial+strains+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).</li>
<li>Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+Methods+for+Maldi-MS+Profiling+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria.</a> Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).</li>
<li>Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+virus+using+residue-specific+chemical+cleavage+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+MALDI-TOF+MS+identification+of+highly+dangerous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).</li>
<li>Lasch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+compatible+inactivation+method+for+highly+pathogenic+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores.</a> Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).</li>
<li>Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+experimental+and+modelling+parameters+for+the+differentiation+of+beverage+spoiling+yeasts+by+Matrix-Assisted-Laser-Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+in+response+to+varying+growth+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).</li>
<li>Del Chierico, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+proteomic+phenotyping+of+filamentous+and+other+fungi+from+clinical+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin.</a> J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).</li>
<li>Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+fingerprints+of+intact+viruses+by+MALDI-TOF%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Mol+Cell+Biol+L%22%5BJournal%5D)">Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry.</a> Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+experiments+approach+to+optimization+of+automated+data+acquisition+during+characterization+of+bacteria+with+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Plos One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+ClinMicrobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
</ol>

Auteurs Vranckx en Janssens zijn werknemers van Applied Maths NV, de fabrikant van data-analysesoftware die in deze video wordt gebruikt. Applied Maths NV heeft selecte softwaremodules gehighlight in deze video en een deel van de publicatiekosten in verband met deze video verstrekt.

Deze demonstratie toonde gedetailleerde procedures van karakterisering en identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF MS en een aangepaste database. In vergelijking met traditionele moleculaire methoden, bijvoorbeeld 16S rDNA sequencing, MALDI-TOF MS basis vingerafdruk van methoden snellere identificatie van diverse bacteriën. Door zijn robuustheid, wordt deze techniek veel gebruikt om bacteriën, virussen, schimmels en gist kenmerken uit de omgeving en in klinische settings 1,14-16. Bovendien heeft M...

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) is een snel en betrouwbaar hulpmiddel gebleken voor de identificatie van bacteriën op het niveau van het geslacht, de soort en in sommige gevallen op stamniveau1-4. MALDI-TOF MS ioniseert biologische moleculen (meestal eiwitten) die afkomstig zijn van celoppervlakken, intracellulaire membranen en ribosomen van bacteriële hele cellen of eiwitextracten1,5. De resulterende pieken vormen karakteristieke patronen of “vingerafdrukken” van de geanalyseerde bacteriën1. Identificatie van bacteriën is gebaseerd op deze mass-to-charge “vingerafdrukken”. 
Twee van de meest gebruikte identificatiestrategieën zijn bibliotheekgebaseerde en bioinformaticagebaseerde strategieën1. Bibliotheekgebaseerde benaderingen vergelijken de massaspectra van onbekende monsters met eerder verzamelde massaspectra van bekende bacteriën in databases/bibliotheken voor identificatie. Commercieel verkrijgbare software, zoals BioNumerics, Biotyper en SARAMIS softwarepakketten, evenals open source softwaretools, zoals SpectraBank6, zijn beschikbaar om de vergelijking en kwantificering van gelijkenis tussen massaspectra van onbekende en referentiebacteriën te vergemakkelijken. Bioinformaticagebaseerde benaderingen zijn meestal gebaseerd op volledig gesequencede bacteriegenooms voor identificatie. In tegenstelling tot bibliotheekgebaseerde benaderingen, die geen identificatie van de biologische aard van specifieke pieken omvatten, omvatten bioinformaticagebaseerde benaderingen eiwitidentificatie1. 
De meeste recente MALDI-vingerafdrukgebaseerde studies hebben bibliotheekgebaseerde benaderingen gebruikt om bacteriën te identificeren1. Bibliotheekgebaseerde benaderingen vereisen de constructie van databases en vergelijking van de gelijkenis tussen massaspectra. Studies tonen aan dat veel experimentele procedures, zoals medium3,7, kweektijd8, monstervoorbereidingsmethode3 en gebruikte matrix9, de verkregen massaspectra beïnvloeden. Bovendien genereren sommige nauw verwante soorten en stammen spectra met slechts subtiele verschillen. Bibliotheekgebaseerde benaderingen vereisen daarom streng gestandaardiseerde procedures om zeer reproduceerbare massaspectra tussen replica's te genereren. Kleine variaties in protocollen kunnen de effectiviteit van identificatie compromitteren, vooral op het niveau van ondersoorten en stammen1,3,10. Nochtans bevatten de door de fabrikant verstrekte referentiedatabases noch gerapporteerde aangepaste databases visueel gedocumenteerde procedures voor databaseconstructie en/of toepassing van een data-analysepijplijn. Om deze reden was het doel van dit werk om een uitgebreide en gedetailleerde procedure voor bibliotheekgebaseerde bacteriële identificatie met behulp van MALDI-TOF MS te ontwikkelen, toe te passen en te demonstreren. 
In deze demonstratie werden massaspectra van 15 bacteriën, geïsoleerd uit een karst omgeving (Kartchner Cavern, AZ, VS), verzameld en geïmporteerd in software om een modeldatabase te construeren. Gegevensverwerking en de analysepijplijn werden gedetailleerd beschreven met behulp van de modeldatabase. Ten slotte werden massaspectra van blind gecodeerde bacteriën, willekeurig geselecteerd uit deze 15 bacteriën, opnieuw verzameld en vergeleken met de referentiespectra in de modeldatabase voor identificatie. De resultaten tonen aan dat bacteriën correct kunnen worden geïdentificeerd op basis van gelijkeniscoëfficiënten of potentiële biomarkers/piekklassen.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxy-cinnaminezuur</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&ge; 97%, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Bruker FlexControl software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>versie 3.0</td></tr><tr><td>Bruker FlexAnalysis software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>versie 3.0</td></tr><tr><td>Bionumerics software</td><td>Applied Maths</td><td></td><td>versie 7.1</td></tr></tbody></table>

het gebruik van maldi-tof-massaspectrometrie en een aangepaste database te bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke cave milieu (kartchner caverns, az, usa)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF-massaspectrometrie is aangetoond als een snel en betrouwbaar hulpmiddel voor de identificatie van bacteriën op het niveau van het geslacht en de soort, en in sommige gevallen, op het niveau van de stam. Er zijn commercieel verkrijgbare en open-source softwaretools ontwikkeld om identificatie te vergemakkelijken; er is echter geen universele/gestandaardiseerde data-analysepijplijn beschreven in de literatuur. Hier bieden we een uitgebreide en gedetailleerde demonstratie van procedures voor bacteriële identificatie met behulp van een MALDI-TOF-massaspectrometer. Massaspectra werden verzameld van 15 diverse bacteriën geïsoleerd uit Kartchner Caverns, AZ, USA, en geïdentificeerd door 16S rDNA-sequencing. Databases werden geconstrueerd in BioNumerics 7.1. Vervolganalyses van massaspectra werden uitgevoerd, inclusief clusteranalyses, piekmatching en statistische analyses. Identificatie werd uitgevoerd met behulp van blind-gecodeerde monsters die willekeurig werden geselecteerd uit deze 15 bacteriën. Er worden twee identificatiemethoden gepresenteerd: op gelijkeniscoëfficiënt gebaseerde methoden en op biomarkers gebaseerde methoden. De resultaten tonen aan dat beide identificatiemethoden de bacteriën tot op soortniveau kunnen identificeren.

De databases gebouwd in deze demonstratie had vier niveaus, van hoog naar laag niveau, met inbegrip van &quot;Alle niveaus&quot;, &quot;Species&quot;, &quot;Biologische repliceren&quot; en &quot;Technische repliceren&quot;, respectievelijk (Figuur 1A). De &quot;Technische repliceren&quot; niveau bevatte alle voorbewerkte spectra van technische replica. De &quot;Biologische repliceren&quot; en &quot;Species&quot; niveaus die de composiet (samenvatting) spectra. &quot;Alle niveaus&quot; bevat alle technis...

Dit werk beschrijft procedures voor snelle identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF MS. De identificatieprocedures omvatten spectrumverwerving, databaseconstructie en vervolganalyses. Er worden twee identificatiemethoden gepresenteerd, gebaseerd op gelijkeniscoëfficiënt en biomarker-gebaseerde methoden.

Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gedetailleerde procedure te ontwikkelen, toepassen en demonstreren voor bibliotheekgebaseerde bacterie-identificatie met behulp van MALDI tot massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst massaspectrums van bacteriën te verzamelen met behulp van een maloff massaspectrometer. In deze studie worden massaspectrums van 15 bacteriën die zijn geïsoleerd uit een corrosieve omgeving verzameld en de resulterende pieken vormen karakteristieke patronen of vingerafdrukken van de geanalyseerde bacteriën.Deze massaspectrums worden vervolgens geïmporteerd in software en een modeldatabase wordt geconstrueerd. Vervolgens worden de referentiemassaspectrums in de modeldatabase verwerkt en geanalyseerd met behulp van clusteranalyse, piekmatch en statistische analyse. Ten slotte worden massaspectrums van blind gecodeerde bacteriën, die willekeurig zijn geselecteerd uit deze 15 bacteriën, opnieuw verzameld en vergeleken met de referentiespectrums in de modeldatabase voor identificatie. De resultaten tonen aan dat bacteriën correct kunnen worden geïdentificeerd op basis van gelijkeniscoëfficiënten of potentiële biomarkers en piekklassen.Begin deze procedure met het deponeren van één microliter eiwitextract dat geen levensvatbare cellen bevat op een roestvrijstalen maldi-doelplaat en laat het drogen. Bedek vervolgens het gedroogde eiwitextract met één microliter matrixoplossing en laat het drogen. Deponeer vervolgens één microliter CBR-standaard op de doelplaat nadat deze is opgedroogd, bedek de CBR met één microliter matrixoplossing en laat het drogen.Storten ten slotte twee microliters matrixoplossing op de doelplaat als een negatieve controle. Gebruik de multi tot massaspectrometer die is uitgerust met de stikstoflaser en wordt bediend met behulp van Bruker flex control software. Verzamel elk massaspectrum in positieve lineaire modus door accumulatie van 500 laserschoten in stappen van 100 schoten.Stel de spanning van de ionenbron een op 20 kilovolt in, de ionenbron twee op 18,15 kilovolt en de lensspanning op 9,05 kilovolt. Deze parameters zijn apparaatspecifiek en kunnen optimalisatie vereisen. Stel het massa-ladingbereik voor geautomatiseerde spectrumevaluatie in van twee tot 20 kilodalton per lading.Stel vervolgens de minimale resolutiedrempel in op 100. Selecteer het OID-piekdetectiealgoritme. Stel de signaal-ruisverhoudingdrempel in op twee en de minimale intensiteitsdrempel op 100.Stel ten slotte de piekaccumulatie in op 500 voor databaseontwerp. Maak een nieuwe database in bio numerics 7.1 aan met behulp van de nieuwe databasewizard. Maak vervolgens een spectrumexperimenttype zoals maldi aan met behulp van opdrachten in het experimenttypespaneel.Maak vervolgens de niveaus aan met behulp van het databaseontwerppaneel, navigeer naar het databasemenu en voeg nieuwe niveaus toe met behulp van de opdracht nieuw niveau toevoegen hier. Maak een soortniveau, biologisch replicaatniveau en technisch niveau. Om de ruwe massaspectrums te importeren.Exporteer eerst de ruwe massaspectrums als tekstbestanden met behulp van flex-analyse door naar het bestandsmenu te navigeren en te klikken op de opdracht massaspectrum exporteren. Importeer vervolgens de ruwe massaspectrums in de database op het niveau van de technische replica's. Verwerk de ruwe massaspectrums vooraf door ze te importeren en opnieuw te bemonsteren met behulp van een kwadratisch aanpassingsalgoritme.Voer vervolgens een baseline-subtractie uit met behulp van een rollende schijf met een grootte van 50 punten en bereken het ruis met behulp van de continue golftransformatie of CWT. Maak de spectrums glad met behulp van een Kaiser-venster met een venstergrootte van 20 punten en een beta van 10 punten. Voer vervolgens een tweede baseline-subtractie uit met behulp van een rollende schijf met een grootte van 200 punten.Detecteer ten slotte de pieken met behulp van de CWT met een minimale signaal-ruisverhouding van 10 na voorverwerking en sla karakteristieke patronen van elk massaspectrum op, zoals pieklijsten, die piekgroottes, piekintensiteiten en signaal-ruisverhouding bevatten. Maak vervolgens samengestelde massaspectrums van de voorverwerkte spectrums met behulp van de opdracht samenvatten in het analysemenu. Kies biologisch replicaat als het doelniveau. Hier.Combineer massaspectrums van 10 technische replica's van dezelfde kolonie om een samengesteld massaspectrum voor die kolonie te verkrijgen, wat resulteert in drie samengestelde massaspectrums voor die isolaat op het biologisch replicaatniveau. Samenvoegen uiteindelijk de drie samengestelde spectrum om één samengesteld spectrum voor die isolaat op het soortniveau te creëren. Om op gelijkenis gebaseerde clusteranalyse en multidimensionale schaling uit te voeren, maak groepen met kleuren.Selecteer eerst de drie biologische samengestelde massaspectrums en klik op de opdracht nieuwe groep uit selectie maken in het groepsmenu om een groep voor de overeenkomstige isolaat te maken. Ontwerp vervolgens een kleur die automatisch wordt gebruikt voor deze drie massaspectrums. Voer clusteranalyse uit door te navigeren naar het clustermenu en op de opdracht clusteranalyse berekenen te klikken.Op de vergelijkingsinstellingen, pagina een, selecteer de Pearson-correlatie en laat andere parameters standaard. Op pagina twee, selecteer unweighted pair group method with arithmetic mean. Klik vervolgens op voltooien.Verkrijg een multidimensionale schaalplot met behulp van de opdracht multidimensionale schaal in het statistiekenmenu om piekmatch uit te voeren. Klik op het spectrumtype maldi in het experimentenpaneel. Selecteer vervolgens lay-out.Toon afbeelding, individuele pieken van spectrums worden getoond. Voer vervolgens piekmatch uit met behulp van de opdracht piek match doen in het spectrummenu om piekklassen te identificeren. Voer tweewegclustering uit door op de statistiekmatrix te klikken. Mining. De intensiteit van de pieken die zijn gekoppeld aan de piekklassen wordt weergegeven als een heatmap om bacteriën te identificeren met behulp van de op gelijkenis gebaseerde methode, maak een vergelijking en genereer een rogram op basis van massaspectrums op het niveau van technische replica's zoals uitgevoerd voor clusteranalyse, sla het rogram op voor vergelijking van gelijkenis.Selecteer een onbekend massaspectrum en klik op analyse. Identificeer geselecteerde items. Het identificatievenster verschijnt in het resultatenpaneel.Selecteer het vergelijking

use-maldi-tof-mass-spectrometry-custom-database-to-characterize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

Een massaspectrometrie-geleide genoom mijnbouw protocol is hier vastgesteld en beschreven. Het is gebaseerd op genoomsequentie-informatie en LC-MS/MS-analyse en heeft tot doel de identificatie van moleculen uit complexe microbiële en plantenextracten te vergemakkelijken.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining als een instrument om nieuwe natuurlijke producten te ontdekken

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Verminderd / afwezige uitdrukking van PMS2 en / of ERCC1 in hele crypten is een frequent geval binnen 10 cm aan elke kant van colon adenocarcinomen, waarschijnlijk de basis van een gezichtsveld met een hoge veranderlijkheid en de progressie van kanker. Deficiëntie in Ku86 of CcOI is veel minder frequent in deze veld gebreken.

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Leer MALDI-TOF MS voor snelle bacteriële identificatie met behulp van massaspectrometrie en een aangepaste database. Deze methode ondersteunt microbiologisch onderzoek naar karakteristieke piekpatronen.

Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA) (Video) | JoVE Journal

Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Meer video's verkennen