Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Het algemene doel van deze procedure is om een gedetailleerde procedure te ontwikkelen, toepassen en demonstreren voor bibliotheekgebaseerde bacterie-identificatie met behulp van MALDI tot massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst massaspectrums van bacteriën te verzamelen met behulp van een maloff massaspectrometer. In deze studie worden massaspectrums van 15 bacteriën die zijn geïsoleerd uit een corrosieve omgeving verzameld en de resulterende pieken vormen karakteristieke patronen of vingerafdrukken van de geanalyseerde bacteriën.

Deze massaspectrums worden vervolgens geïmporteerd in software en een modeldatabase wordt geconstrueerd. Vervolgens worden de referentiemassaspectrums in de modeldatabase verwerkt en geanalyseerd met behulp van clusteranalyse, piekmatch en statistische analyse. Ten slotte worden massaspectrums van blind gecodeerde bacteriën, die willekeurig zijn geselecteerd uit deze 15 bacteriën, opnieuw verzameld en vergeleken met de referentiespectrums in de modeldatabase voor identificatie. De resultaten tonen aan dat bacteriën correct kunnen worden geïdentificeerd op basis van gelijkeniscoëfficiënten of potentiële biomarkers en piekklassen.

Begin deze procedure met het deponeren van één microliter eiwitextract dat geen levensvatbare cellen bevat op een roestvrijstalen maldi-doelplaat en laat het drogen. Bedek vervolgens het gedroogde eiwitextract met één microliter matrixoplossing en laat het drogen. Deponeer vervolgens één microliter CBR-standaard op de doelplaat nadat deze is opgedroogd, bedek de CBR met één microliter matrixoplossing en laat het drogen.

Storten ten slotte twee microliters matrixoplossing op de doelplaat als een negatieve controle. Gebruik de multi tot massaspectrometer die is uitgerust met de stikstoflaser en wordt bediend met behulp van Bruker flex control software. Verzamel elk massaspectrum in positieve lineaire modus door accumulatie van 500 laserschoten in stappen van 100 schoten.

Stel de spanning van de ionenbron een op 20 kilovolt in, de ionenbron twee op 18,15 kilovolt en de lensspanning op 9,05 kilovolt. Deze parameters zijn apparaatspecifiek en kunnen optimalisatie vereisen. Stel het massa-ladingbereik voor geautomatiseerde spectrumevaluatie in van twee tot 20 kilodalton per lading.

Stel vervolgens de minimale resolutiedrempel in op 100. Selecteer het OID-piekdetectiealgoritme. Stel de signaal-ruisverhoudingdrempel in op twee en de minimale intensiteitsdrempel op 100.

Stel ten slotte de piekaccumulatie in op 500 voor databaseontwerp. Maak een nieuwe database in bio numerics 7.1 aan met behulp van de nieuwe databasewizard. Maak vervolgens een spectrumexperimenttype zoals maldi aan met behulp van opdrachten in het experimenttypespaneel.

Maak vervolgens de niveaus aan met behulp van het databaseontwerppaneel, navigeer naar het databasemenu en voeg nieuwe niveaus toe met behulp van de opdracht nieuw niveau toevoegen hier. Maak een soortniveau, biologisch replicaatniveau en technisch niveau. Om de ruwe massaspectrums te importeren.

Exporteer eerst de ruwe massaspectrums als tekstbestanden met behulp van flex-analyse door naar het bestandsmenu te navigeren en te klikken op de opdracht massaspectrum exporteren. Importeer vervolgens de ruwe massaspectrums in de database op het niveau van de technische replica's. Verwerk de ruwe massaspectrums vooraf door ze te importeren en opnieuw te bemonsteren met behulp van een kwadratisch aanpassingsalgoritme.

Voer vervolgens een baseline-subtractie uit met behulp van een rollende schijf met een grootte van 50 punten en bereken het ruis met behulp van de continue golftransformatie of CWT. Maak de spectrums glad met behulp van een Kaiser-venster met een venstergrootte van 20 punten en een beta van 10 punten. Voer vervolgens een tweede baseline-subtractie uit met behulp van een rollende schijf met een grootte van 200 punten.

Detecteer ten slotte de pieken met behulp van de CWT met een minimale signaal-ruisverhouding van 10 na voorverwerking en sla karakteristieke patronen van elk massaspectrum op, zoals pieklijsten, die piekgroottes, piekintensiteiten en signaal-ruisverhouding bevatten. Maak vervolgens samengestelde massaspectrums van de voorverwerkte spectrums met behulp van de opdracht samenvatten in het analysemenu. Kies biologisch replicaat als het doelniveau. Hier.

Combineer massaspectrums van 10 technische replica's van dezelfde kolonie om een samengesteld massaspectrum voor die kolonie te verkrijgen, wat resulteert in drie samengestelde massaspectrums voor die isolaat op het biologisch replicaatniveau. Samenvoegen uiteindelijk de drie samengestelde spectrum om één samengesteld spectrum voor die isolaat op het soortniveau te creëren. Om op gelijkenis gebaseerde clusteranalyse en multidimensionale schaling uit te voeren, maak groepen met kleuren.

Selecteer eerst de drie biologische samengestelde massaspectrums en klik op de opdracht nieuwe groep uit selectie maken in het groepsmenu om een groep voor de overeenkomstige isolaat te maken. Ontwerp vervolgens een kleur die automatisch wordt gebruikt voor deze drie massaspectrums. Voer clusteranalyse uit door te navigeren naar het clustermenu en op de opdracht clusteranalyse berekenen te klikken.

Op de vergelijkingsinstellingen, pagina een, selecteer de Pearson-correlatie en laat andere parameters standaard. Op pagina twee, selecteer unweighted pair group method with arithmetic mean. Klik vervolgens op voltooien.

Verkrijg een multidimensionale schaalplot met behulp van de opdracht multidimensionale schaal in het statistiekenmenu om piekmatch uit te voeren. Klik op het spectrumtype maldi in het experimentenpaneel. Selecteer vervolgens lay-out.

Toon afbeelding, individuele pieken van spectrums worden getoond. Voer vervolgens piekmatch uit met behulp van de opdracht piek match doen in het spectrummenu om piekklassen te identificeren. Voer tweewegclustering uit door op de statistiekmatrix te klikken. Mining. De intensiteit van de pieken die zijn gekoppeld aan de piekklassen wordt weergegeven als een heatmap om bacteriën te identificeren met behulp van de op gelijkenis gebaseerde methode, maak een vergelijking en genereer een rogram op basis van massaspectrums op het niveau van technische replica's zoals uitgevoerd voor clusteranalyse, sla het rogram op voor vergelijking van gelijkenis.

Selecteer een onbekend massaspectrum en klik op analyse. Identificeer geselecteerde items. Het identificatievenster verschijnt in het resultatenpaneel.

Selecteer het vergelijking