Name: Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer laser-capture microdissectie van prostaatepitheelcellen uit bevroren weefsel voor RNA-analyse. Deze methode is essentieel voor onderzoek naar prostaatkanker en genexpressieprofielen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco en Avani Vaishnav voor hun hulp bij het optimaliseren van deze methodologie door de jaren heen en Yang Zhang en Dr. Jian Ma aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign voor de RNA seq-analyse. Dit werk werd ondersteund door NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) en een Prevent Cancer Foundation-beurs (Zhou).

Alle menselijke weefsels worden gebruikt voor deze experimenten werden verkregen via een Institutional Review Board goedgekeurd protocol en / of ontheffing aan de Universiteit van Illinois in Chicago. 1. Afdeling Fresh Frozen Prostaat op PEN-glijbaan en op Charged Glasplaatje <ol><li> De dag voor of een paar uur voor het snijden van het monster, schoon gereedschap (dat wil zeggen, kwast, tang, coplins, messen, PEN-omlijst dia&#39;s (indien nog niet RNase gratis), een ETOH veilige markering en een potlood) en de binnenkant van een RT cryostaat met RNase-ontsmetten oplossing met behulp van een spuitfles en lab-doekjes. <ol><li> Sta-RNase decontaminatie oplossing te zitten voor 5 minuten voor weg te vegen, spoelen met depcH 2 0 te verwijderen overgebleven RNase-ontsmetten oplossing en een laatste spoeling met 70% EtOH (bereid met depcH 2 0). Opmerking: Het is essentieel om een ​​RNase-free werkplek te handhaven. Alle coplins, gereedschappen, bevroren montage medium, bladen en slides gebruikt mag alleen worden gebruikt voor RNase vrij werken nooit in een standaard niet-RNase-vrije omgeving. Alle instrumenten moeten worden behandeld met RNase decontaminatie oplossing vóór elk experiment. </li></ol></li><li> Koel cryostaat tot -24 ° C. </li><li> Plaats de volgende gereinigd RNase-free instrumenten binnen cryostaat minstens 30 minuten afkoelen voordat snijden: slide Coplin gevuld met 100% ethanol, gereedschappen, kleine bevroren weefselcassettes en montage klem. </li><li> Ophalen bevroren prostaatweefsel van cryo en plaats in een droge-ijs gevulde schuim emmer voor transport. Plaats weefsel in cryostaat in evenwicht temperatuur cryostaat gedurende tenminste 30 min. Opmerking: menselijke prostaat weefsels voor laser-capture micro-dissectie kan zowel vers bevroren of zijn formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE). De tijdsdruk en voorbereiding glijbaan zijn iets anders tussen weefsel bronnen. Hier beschrijven we de stappen voor ingevroren secties. </li><li> Werken met een tissue tegelijk en spuit bevroren fixeermiddel in de bottom van de cassette en snel te monteren de bevroren prostaatweefsel in de bevroren montage medium met behulp van de gekoelde pincet. </li><li> Plaats de cassette met weefsel op chiller in cryostaat 5 min op bevroren montage medium in te stellen. </li><li> Squirt een kleine hoeveelheid bevroren montage medium op de boorkop en zorgvuldig druk gemonteerd weefsel onderkant naar boven op de bevroren montage medium. Laat in de cryostaat gedurende 5 min om de bevroren fixeermiddel volledig stollen. </li><li> Plaats de klem in de houder en draai. </li><li> Vergrendelen de hendel in de vergrendelde stand en plaats een nieuw blad op de cryostaat. Voor stroomafwaartse moleculaire eindpunten dat een amplificatiestap omvatten (dwz qPCR) is het raadzaam om een nieuw blad gebruiken voor elke patiënt om contaminatie te voorkomen (of beweegt het blad naar oppervlakte van het blad te gebruiken voor het volgende monster). </li><li> Ontgrendelen van de handgreep en het weefsel voorzichtig vooruit met de hand of met een voetpedaal om zelfs en het weefsel bloot te leggen met 50 μm gedeelten totdat de gewenste belichting weefsel bereikt. </li><li> Pas cryostaat tot 5 urn, gesneden één of twee gedeelten en plaats ze op glasplaatje gebracht voor hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring (zie stap 2). </li><li> Plaats onmiddellijk de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de geladen glasplaatje uit ethanol en laat het drogen op kamertemperatuur alvorens tot H &amp; E kleuring (stap 2). </li><li> Plaats RT PEN frame dia op een frame supporter. </li><li> Pas cryostaat tot 10 pm en plaats delen op het RT PEN kader dia&#39;s. Een tot vier secties kan plaatsvinden op elke dia afhankelijk weefselgrootte. </li><li> Onmiddellijk duik de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de PEN frame dia&#39;s uit ethanol en bewaar de dia in een dia doos in een exsiccator doos in een -80 ° C vriezer tot klaar voor LCM. Drie dagen is de maximale bewaartermijn voor een optimale RNA herstel. </li><li> Ga verder met Stap 2 voor alleen de geladen glas gleede. Ga verder met stap 3 voor PEN frame glijbaan. </li></ol> 2. hematoxyline en eosine-Y (H &amp; E) Stain voor histologisch Mark-up Opmerking: Dit als om het weefsel op de geladen glasplaatje en NIET de PEN-kader glijbaan voor LCM. <ol><li> Hydrateren secties in de geladen glasplaatje dompelen van de schuif door gegradeerde ethanol als volgt: dompel de dia tweemaal in 100% ethanol gedurende 3 min, tweemaal in 95% ethanol gedurende 3 minuten, eenmaal in 70% ethanol gedurende 3 min en twee keer in gedestilleerd H 2 O 3 min. <ol><li> Bereid zure alcoholoplossing: 99 ml 70% ethanol + 1 ml 1% HCl en 0,1% natriumbicarbonaatoplossing: 0,1 g natriumbicarbonaat in 100 ml gedestilleerd H2 O </li></ol></li><li> Dompel de dia in Hematoxyline Gill II (0,4%) gedurende 5 minuten. </li><li> Afwassen overtollige vlek in stabiele lopende kraan H 2 O 3 min. </li><li> Dompel de dia 10 keer in zuur alcohol </li><li> Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min. </li><li> Dompel de diain 0,1% natriumbicarbonaat oplossing 30-60 seconden de paarsachtige kleur blauw. </li><li> Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min. </li><li> Spoel de dia in 95% ethanol met 10 dips. </li><li> Dompel de dia in Eosine-Y 2-3 keer gedurende 15 sec totaal. </li><li> Dehydrateer de schuif door gesorteerde ethanol als volgt: dompel de dia twee keer in 95% ethanol, twee keer in 100% ethanol, en twee keer in xyleen (zorg ervoor dat het weefsel wordt duidelijk welke grondige uitdroging aangeeft). </li><li> Monteer de dia met niet-waterige permanente harde montage medium en dekglas. </li><li> Laat de dia drogen 30 min. </li><li> Grote afbeelding van een hoge-resolutie scan dia met elke hele dia scanner en printen op 8 &quot;x 11&quot; papier. </li><li> Schets aandachtsgebieden (meestal gedaan door een bevoegd patholoog) met een marker. Deze opmaak is de gids voor de LCM procedure. </li></ol> 3. toluïdineblauw kleuring van PEN-kader Slides Opmerking: Thwordt gedaan op dezelfde dag als het LCM. Gebruik depcH 2 O water voor alle oplossingen. Voltooi alle stappen in RNase-vrij gebied. Alle coplins moeten worden gereinigd met RNase-ontsmetten oplossing. <ol><li> De dag van LCM verwijder de PEN-kader slides van -80 ° C vriezer en hydrateren door zachtjes dompelen dia&#39;s in 90% EtOH gedurende 2 minuten dan 75% EtOH gedurende 2 minuten. <ol><li> Bereid 0,5% toluïdineblauw door oplossen in de moleculaire biologie kwaliteit water vervolgens filteren steriliseren door een 0,2 um filter en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor maximaal 6 maanden. NB: Het wordt sterk aangeraden om de oplossing te bereiden voorafgaand aan de filtratie een paar uur kan duren. </li></ol></li><li> Vlekken op de prostaat weefsel door voorzichtig te dompelen dia&#39;s in 0,5% toluïdineblauw voor 5-30 sec. Destain het weefsel door wassen glijdt 2 keer depcH 2 O 15 seconden gevolgd door 75% EtOH gedurende 30 sec tot 3 min. Opmerking: vlek en destain tijd worden ingesteld om een ​​goede kleuring te garanderen. Prostate neiging heeft om te vlek. </li><li&gt; Transfer PEN frame dia&#39;s RNAase-vrij droog container op ijs. </li></ol> 4. Laser-capture Micro-dissectie (LCM) <ol><li> Onmiddellijk voorafgaand aan LCM, droge dia een dia warmer bij 42 ° C gedurende 15 min. Droog alleen de dia die zal worden verwerkt en bewaar de rust op het ijs totdat klaar voor hen. </li><li> Schakelen LCM en de computer in deze volgorde, microscoop macht, de laser-toets, de laser schakelaar en start de computer. Start de Laser Microdissection software. </li><li> Gebruik de software om de microscoop om de dia&#39;s en het verzamelen buizen Load Control. Klik op &quot;unload monsterhouder&quot;, laadt de dia met de secties op de microscoop diahouder met het weefsel naar beneden en plaats de houder dia in de juiste sleuf in de microscoop, klik op &quot;doorgaan&quot;. <ol><li> Klik op &quot;unload collectie buizen&quot;, label en laad 0,5 ml buizen op de buis houder en plaats deze in de juiste sleuf in het instrument. Eenscaps zijn beveiligd, voeg 35 ul van Lysis buffer om de collectie caps en proberen te bellen te voorkomen. Klik vervolgens op &quot;OK&quot;. Opmerking: als verdamping is een probleem, verdunnen als volgt de buffer: 25 ul lysisbuffer met 10 ul depcH2O. </li></ol></li><li> In de software, selecteer de positie waar de dia heeft in de diahouder geplaatst. Selecteer de collectie dop om de LCM specimen verzamelen. </li><li> Visualiseren en de focus van de dia via de computer op 10X. Gebruik de software om de laser te kalibreren door het selecteren van &quot;Laser&quot; en vervolgens &quot;kalibreren&quot;. Pas de macht, diafragma en de snelheid van de laser, het selecteren van &quot;laser&quot; dan &quot;control&quot; zodat de laserbundel met de complete en efficiënte geselecteerde gebied snijden. Herhaal aanpassingen totdat de laser snijdt volledig door het weefsel. </li><li> Met behulp van de 8 &quot;x 11&quot; patholoog mark-up als een gids, de &quot;tekenen vorm&quot; instrument om de gewenste gebieden van epithe omschrijvenlium in het uitzicht en vermijd verzamelen elke stroma. Opmerking: meerdere gebieden kunnen worden gekozen binnen een uitzicht, maar niet verplaatsen naar een andere weergave zonder eerst te snijden door te klikken op de &quot;cut vorm&quot; tool. <ol><li> Als een gebied niet volledig te snijden door de laser de &quot;bewegen en snijd&quot; tool om handmatig te gaan over. Verplaats de doelstelling nieuwe inzichten en herhaal lasersnijden tot slede volledig ontleed of de gewenste hoeveelheid weefsel is verzameld (typisch 100 benigne klieren op 150-500 ng RNA). (zie voorbeeld in figuur 1A). </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig buizen uit de collectie houder en sluit de doppen, die bewust van de lysisbuffer en weefsel in de doppen. Kort centrifugeer 30 sec vloeistof en weefsel te verzamelen op de bodem van de buis. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 30 min en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor RNA-isolatie. </li></ol> 5. Totaal RNA isolatie met Fil-ter gebaseerde Kit en Kwaliteit Analyse <ol><li> Ontdooi de buizen op ijs en breng het volume van de oplossing tot 100 ul. </li><li> Pre-nat het microfilter van de RNA isolatie kit door toepassing 30 ul ofLysis oplossing naar het midden van de filter en laat het inwerken whileperforming de volgende twee stappen (minimaal 5 min). </li><li> Voeg 3 ul van LCM Bewaarvloeistof (verschaft in de kit) aan het lysaat en door vortexen gemengd gedurende 5 sec. Centrifugeer gedurende 30 seconden om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis. </li><li> Centrifugeer de pre-bevochtigd filter voor ~ 30 sec op topsnelheid om vloeistof te verwijderen. </li><li> Voeg 1,25 delen (in dit geval 129 pl) van 100% ethanol aan het lysaat mengsel voorzichtig vortex of pipet op en neer. ** Deze methode zal zowel grote als kleine RNA soorten te herstellen. </li><li> Laad het monster op de vooraf bevochtigde microfilter en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut aan het RNA aan het filter binden. Daarna wassen microfilter met 180 gl &quot;wasoplossing 1, R21; Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min. Let op: Vanaf dit punt alle centrifugaties moet worden gedaan bij 13.000 xg, of maximum snelheid. </li><li> Was filter tweemaal met 180 gl &quot;wasoplossingen 2 en 3&quot;, respectievelijk aangegeven door de kit protocol. Centrifugeer 30 sec, gooi dan de stroom door en draai de filter gedurende 1 minuut om resterende vocht te verwijderen en het filter drogen. </li><li> Transfer filter om een ​​nieuwe collectie buis. </li><li> Warm elutieoplossing tot -95 ° C (bij de kit). </li><li> Breng 10 pl voorverwarmde elutieoplossing naar het midden van het filter, sluit de dop en opslaan gedurende 5 min bij RT. Centrifugeer 1 minuut aan het RNA te elueren, en herhaal deze stap eenmaal onder verkrijging ~ 20 pi RNA. </li><li> Voer de DNase I behandeling van 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Kwantificeren RNA door spectrofotometer met absorptie bij 260 nm. De verhouding van de optische dichtheid bij een golflengte van 260 nm en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van de beoordelenRNA (zie tabel 1) 15. </li></ol> 6. Gene Expression Analysis Opmerking: genexpressie van lange RNA soorten (zoals mRNA en lncRNAs) wordt getoond in stap 6.1 en korte RNA soorten (zoals microRNA&#39;s) wordt getoond in stap 6.2. Verschillende kits beschikbaar voor RT-qPCR en de hoeveelheid RNA vereist varieert per kit (zo weinig als 10 ng). RNA sequentie analyse wordt beschreven in 6.3. <ol><li> Reverse transcriberen (RT) het RNA in cDNA mengen 5 pl 20 ng / pl RNA monster met 5 ui van de RT master mix (RT buffer, dNTP&#39;s, willekeurige primers, RT enzym RNase inhibitor). Incubeer het reactiemengsel gedurende 25 min bij 25 ° C, daarna 120 minuten bij 37 ° C en 5 minuten bij 85 ° C. </li><li> Verdun de RT-reactie 1:10 met RNase vrij water en het gebruik van 2,5 ul per 10 ul qPCR reactie met primers of primer / probe-sets voor de genen van belang. Opmerking: Om de analyse van gedeeltelijk afgebroken RNA vergemakkelijken Het is raadzaam om primers gebruiken for kortere amplicons (minder dan 100 bp) 16. (Tabel 2B) <ol><li> Voor microRNA expressie analyse uitvoeren van de RT-reactie door het mengen van 5 ul van 2-10 ng / ul RNA-monster met 5 pi van de RT-master mix. Let op: iedere commercieel verkrijgbare PCR-gebaseerde microRNA detectie technologie vereist het gebruik van eigen en specifieke RT primers. </li></ol></li><li> Alternatief of in aanvulling op RT-PCR gebruikt next generation sequencing (RNA-seq of klein RNA-seq) verschillende soorten RNA te kwantificeren. Gewoonlijk gebruiken 500 ng RNA voor deze procedure (Tabel 3) en het uitvoeren van de werkwijze zoals aangegeven door de fabrikant en detectie instrument. </li></ol>

<ol><li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li>
<li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li>
<li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li>
<li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies%3A+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+molecular+pathology%22%5BJournal%5D)">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+steroid+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+microRNAs%2C+miR-100+and+-125b%2C+are+regulated+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+prevention+research%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li>
<li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95(2010).</li>
<li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165(2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+research+%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li>
<li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li>
<li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+veterinary+diagnostic+investigation+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li>
<li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Genexpressie profilering van humane monsters kan lastig zijn, niet alleen voor de kwaliteit of kwantiteit van weefsel mogelijk, maar ook de verschillende zich in een bepaald weefsel specimen histologische entiteiten. Deze Vooral in de prostaat waarin goedaardige weefsels grotendeels stromale weefsels en delen van kanker zijn verstoken van stroma. LCM vergemakkelijkt fysieke scheiding van prostatische stroma en epitheel RNA een nauwkeuriger handtekening van de twee verschillende celtypen (Figuur 1A). In ...

De prostaat is een heterogeen weefsel samengesteld uit secretoire epitheel gerangschikt in glandular acini omgeven door fibromusculaire stroma voornamelijk samengesteld uit gladde spieren 1. De epitheliale compartiment omvat vijf verschillende maar georganiseerde celtypes: basale cellen, secretorische cellen, neuro-endocriene cellen, transit versterken en stamcellen 2. Bij prostaatkanker (PCa), die voortvloeit uit de luminale epitheliale cellen, de groei van het adenocarcinoom veroorzaakt een duidelijke geleidelijke afname van het stromale compartiment 3. Daarom zullen weefselmonsters zijn duidelijke verschillen in het aandeel van stromale en epitheliale celtype gebaseerd op de mate van PCa. Deze verschillen kunnen leiden tot vertekende aannames van de genexpressie gegevens van hele weefsels verkregen ongeacht microdissectie van het gewenste celtype. Daarom, om deze bias te verwijderen is het noodzakelijk om celtypen te scheiden voorafgaand aan RNA-extractie engenexpressie analyse. Macrodissection of microdissectie kan worden fysiek gescheiden goed gekarakteriseerde epitheliale delen van de omliggende stroma 4 -6. Macrodissection wordt meestal gedaan met een scheermesje onder een dissectiemicroscoop en werkt goed voor het scheiden van grote prostaatkanker knobbeltjes stroma, maar niet kan verwijderen goedaardige epitheel van omliggende stroma (zie voorbeeld goedaardige prostaat histologie in figuur 1). Microdissectie met een laser (LCM) aanzienlijk arbeidsintensiever dan macrodissection, maar kan zeer nauwkeurig ontleden goedaardige epitheel 4. Recente publicaties van ons lab hebben aangetoond dat RNA met succes door de LCM van beide formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) biopten of bevroren weefsel 4,7-9 kan worden gewonnen. De belangrijkste uitdagingen in LCM-RNA-extractie zijn 1) om nauwkeurig ontleden de gewenste gebieden van het weefsel, en 2) te behouden RNA integriteit tijdens de LCM en isolatie proces 4,10. RNA geïsoleerd uit zuivere celpopulaties kunnen worden gebruikt voor genexpressieanalyse door verscheidene werkwijzen zoals reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) 7,8, microarray 11 en diep -sequencing 12-14. Het doel van dit protocol is het totaal RNA van LCM prostaat epitheel isoleren uit bevroren weefsel op stroomafwaartse genexpressie analyses.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrane 4.0 mm slides&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Glasplakjes, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Kleurvat)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Kleurrek)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&reg; CS</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blauw</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser Microdissection System</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Dunne wandbuizen voor LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Hematoxyline kleuring&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-capture microdissectie van human prostatic epithelium voor rna-analyse

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

De prostaatklier bevat een heterogeen milieu van stromale, epitheliële, neuro-endocriene en immuuncellen. Een gezonde prostaat bestaat uit fibromusculair stroma dat discrete epitheel-beklede secretoire lumina omringt en een zeer kleine populatie van immuun- en neuro-endocriene cellen. In tegenstelling daarmee hebben gebieden met prostaatkanker een verhoogde dysplastische luminaal epitheel met een sterk verminderde of afwezige stromapopulatie. Gezien het grote verschil tussen stromale en epitheelcellen, is het van essentieel belang om de celtypen te scheiden voor elk type downstream moleculair onderzoek. Ondanks deze kennis vergelijken de meeste genexpressiestudies goedaardige prostaat met kanker zonder microdissectie, wat leidt tot stromabias in de goedaardige monsters. Laser-capture microdissectie (LCM) is een effectieve methode om verschillende celtypen fysiek te scheiden van een monstersnede. Het doel van dit protocol is om aan te tonen dat RNA met succes kan worden geïsoleerd uit LCM-verzameld menselijk prostaatepitheel en kan worden gebruikt voor downstream genexpressiestudies zoals RT-qPCR en RNAseq.

In een eerdere studie toonde wij het ​​gebruik van LCM op epitheliale en stromale weefsels verzamelen om expressie profilering vergelijken door RT-qPCR van mRNA en microRNAs uit bevroren en FFPE prostaat weefsel van dezelfde patiënt 4. LCM is tijdrovend, met name wanneer grote hoeveelheid RNA te verzamelen voor de volgende generatie sequencing analyse. Daarom is het cruciaal om de werkruimte te houden en gereedschappen RNase-free. Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en cel-specificiteit controles in de opgev...

Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Het algemene doel van dit protocol voor laser capture microdissectie is het isoleren van totaal RNA uit zuivere populaties van prostatische epitheelceltypen uit heterogene, bevroren prostaatweefsels voor daaropvolgende genexpressieanalyses. Deze methode kan helpen bij het analyseren van patiëntmonsters en het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar prostaatkanker, zoals het verschil in RNA-expressie tussen benigne en zieke epitheliale prostaatweefselmonsters, of in monsters uit klinische studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat laser capture microdissectie de RNA-isolatie mogelijk maakt van homogene populaties epitheel- of stromacellen uit bevroren prostaatweefsel.Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn aan deze methode moeite met het verkrijgen van RNA van hoge kwaliteit, omdat zij niet weten welke stappen kritiek zijn voor het behoud van RNA's. Vrije condities Begin met het verzamelen van alle reagentia en instrumenten die nodig zijn voor de procedure. Laat het bevroren prostaatweefsel 30 minuten equilibreren in de cryostaat, spuit vervolgens montage medium in de bodem van de cassette en monteer het weefsel snel met gekoelde pincetten.Plaats de cassette vijf minuten in de koeler van de cryostaat om het inbedmiddel te laten uitharden. Zodra dit is gestold, spuit u bevroren inbedmiddel op de houder en drukt u het gemonteerde weefsel er voorzichtig in. Met de onderzijde naar boven.Laat het preparaat vijf minuten rusten. Voordat u de houder in de klem plaatst, vergrendelt u de hendel in de juiste positie en plaatst u een nieuw mes in de cryostaat. Na het ontgrendelen van de hendel schuift u het monster voorzichtig naar voren totdat de gewenste blootstelling van het weefsel is bereikt.Wanneer u klaar bent, stelt u de cryostaat in op vijf micron en snijdt u één of twee coupes. Plaats deze coupes op een geladen objectglas voor hematoxine- en eosinekleuring. Plaats het objectglas onmiddellijk gedurende twee minuten in koude, 100% ethanol.Verwijder na deze tijd de slide en laat deze drogen bij kamertemperatuur. De h- en d-gekleurde slide biedt een betere visualisatie van nucleaire texturen en dient door de patholoog te worden gebruikt om de gebieden van belang te markeren. Plaats vervolgens een penframe op kamertemperatuur.Schuif het weefsel in een framehouder, stel de cryostaat in op 10 micron en maak coupes. Afhankelijk van de grootte van het weefsel kunnen één tot vier coupes op elke objectglas worden geplaatst. Dompel het objectglas onmiddellijk in koud 100% ethanol.Verwijder de objectglas na twee minuten en bewaar deze in de vriezer voor latere analyse. Haal op dezelfde dag als de laser-capture microdissectie de objectglazen met penframe uit de vriezer terwijl u in een RNA-vrije zone werkt. Hydrateer de objectglazen door ze voorzichtig twee minuten in 90%ethanol te dippen, gevolgd door twee minuten in 75%ethanol.Zodra ze gehydrateerd zijn, kleurt u het prostaatweefsel door de objectglaasjes gedurende vijf tot 30 seconden voorzichtig in 0,5% tolueenblauw te dompelen. Ontkleur het weefsel door de objectglaasjes tweemaal 15 seconden in gedestilleerd water te wassen, gevolgd door 30 seconden tot drie minuten in 75% ethanol. Plaats tot slot de objectglaasjes in een RNA-vrije droge container op ijs.Plaats vóór aanvang van de procedure een objectglas gedurende 15 minuten op een objectglasverwarmer om deze te drogen. Droog alleen het objectglas dat verwerkt zal worden en bewaar de rest op ijs tot ze nodig zijn. Schakel de LCM-componenten in de volgende volgorde in.Schakel de microscoop, de lasersleutel, de laserschakelaar en vervolgens de computer in. Start daarna de software voor laser-microdissectie op. Instrueer de microscoop om de slides en opvangbuisjes te laden.Klik op unload sample holder en plaats de slide op de slidehouder met het weefsel naar beneden gericht. Plaats de slidehouder in de juiste gleuf van de microscoop en klik op continue. Klik vervolgens op unload collection tubes.Label de buisjes en plaats ze in de buisjeshouder en steek ze in de juiste gleuf. Sluit de doppen goed af en voeg 35 µL lysisbuffer toe. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen ontstaan.Zodra de opvangdoppen zijn geladen, klikt u op oké. Gebruik de software om de positie van de objectglashouder te selecteren en kies vervolgens de opvangdop om het monster op te vangen. Visualiseer en focus het objectglas via de computer bij een 10 x vergroting.Gebruik de software om de laser te kalibreren door laser te selecteren. Kalibreer vervolgens, pas de apertuur van het vermogen en de snelheid van de laser aan door laser en daarna controle te selecteren. Ga door met het maken van aanpassingen totdat de laser volledig door het weefsel snijdt.Het is essentieel om de interessegebieden af te bakenen, wat doorgaans door een gecertificeerd patholoog wordt gedaan, om de gewenste gebieden van het weefsel dat aan LCM wordt onderworpen nauwkeurig te dissekeren, waarbij de door de patholoog gemarkeerde H&amp;E-kleuring (8x11) als visuele gids dient. Gebruik de tool 'vorm tekenen' in de software om de gewenste gebieden van het epitheel in het beeld te omlijsten en voorkom het verzamelen van stroma. Klik op 'snijden' om de laser te starten.Als een gebied niet volledig is doorgesneden, gebruik dan de 'move and cut'-tool om dit handmatig te corrigeren. Blijf het objectief naar nieuwe weergaven verplaatsen en herhaal het lasersnijden totdat het preparaat volledig is gedissecteerd of de gewenste hoeveelheid weefsel is verzameld. Verwijder na voltooiing voorzichtig de buisjes uit de opvanghouder en sluit de doppen, waarbij u rekening houdt met de lysisbuffer en het weefsel in de doppen.Centrifugeer kort gedurende 30 seconden om de vloeistof en het weefsel op de bodem van de buis te verzamelen. Incubeer de monsters 30 minuten bij 42 graden Celsius en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius tot de RNA-isolatie plaatsvindt. Deze voorbeelden tonen representatieve met toluidineblauw gekleurde prostaatsneden op een objectglas met penframe vóór en na laser capturing van controles specifiek voor het goedaardige epitheelceltype.Bevestig de specificiteit van het door de laser gecaptureerde gebied van het weefsel. Goedaardig epitheel en stroma. Exprimeren geen prostaatkankerspecifiek gen, A-M-A-C-R.Het stroma vertoonde geen expressie van het epitheelspecifieke gen en KX 3.1. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in een RNA-vrije omgeving te werken om degradatie van RNA te voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u RNA kunt isoleren uit homogene populaties van epitheel- of stromacellen uit bevroren weefsel voor talrijke downstream analysetechnieken.Vergeet niet dat het werken met een cryostaat extreem gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals een goede training en uiterste voorzichtigheid bij het hanteren van het mes.

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol voor microRNA (miRNA) expressieanalyses in gearchiveerde, formaline-gefixeerde, paraffine-ingeslagen (FFPE) of vers bevroren prostaatkanker (PCa) klinisch weefsel met behulp van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH).

miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues

Hier beschrijven we een protocol voor een reproduceerbare laser vangt microdissection (LCM) voor het isoleren van trabecular gevlochten (TM) voor downstream RNA analyse. De mogelijkheid om het analyseren van wijzigingen in genexpressie in het Vertaalgeheugen zal helpen bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TM-gerelateerde oogbeschadigingen en/of ziekten.

Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.

Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.

Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.

Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Leer laser-capture microdissectie van prostaatepitheelcellen uit bevroren weefsel voor RNA-analyse. Deze methode is essentieel voor onderzoek naar prostaatkanker en genexpressieprofielen.

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

Meer video's verkennen