Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse
26 november 2015
Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.
Het algemene doel van dit laser capture micro dissectie protocol is om totaal RNA te isoleren uit zuivere populaties van prostaat epitheelceltypen uit heterogene bevroren prostaatweefsels voor downstream genexpressieanalyses. Deze methode kan helpen bij het analyseren van monsters van patiënten en het beantwoorden van belangrijke vragen in het prostaatkankeronderzoeksveld, zoals hoe RNA-expressie verschilt in goedaardige en ziekelijke epitheliale prothetische weefselmonsters, of in klinische proefmonsters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat laser capture micro dissectie RNA-isolatie mogelijk maakt van homogene populaties van epitheliale of str-cellen uit bevroren prostaatweefsel.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode moeite hebben om hoogwaardig RNA te verkrijgen omdat ze niet weten welke stappen cruciaal zijn om RNA's te behouden. Gratis voorwaarden Begin met het verzamelen van alle reagentia en gereedschappen die nodig zijn voor de procedure. Laat het bevroren prostaatweefsel 30 minuten in de cryostaat gelijkmatig worden en spuit montagemedium in de bodem van de cassette en monteer het weefsel snel met gekoelde pincetten.
Plaats de cassette vijf minuten in de koeler van de cryostaat om het montagemedium te laten stollen. Eenmaal ingesteld, spuit bevroren montagemedium op de klemvijzel en druk het gemonteerde weefsel voorzichtig erin. Onderkant omhoog.
Laat de voorbereiding vijf minuten staan. Voordat u de klemvijzel in de houder plaatst, vergrendelt u de hendel in positie en plaatst u een nieuw mes op de cryostaat. Na het ontgrendelen van de hendel, schuift u het monster voorzichtig door totdat de gewenste weefselexpositie is bereikt.
Wanneer u klaar bent, stelt u de cryostaat in op vijf micron en snijdt u een of twee secties. Plaats deze secties op een geladen glasplaatje voor hematine en eoin-kleuring. Plaats de schuif onmiddellijk in koud, 100% ethanol gedurende twee minuten.
Verwijder na deze tijd de schuif en laat deze op kamertemperatuur drogen. De h en d gekleurde schuif biedt een betere visualisatie van nucleaire texturen en moet door de patholoog worden gebruikt om de gebieden van belang te markeren. Plaats vervolgens een penframe op kamertemperatuur.
Schuif in een frameondersteuning, stel de cryostaat in op 10 micron en maak secties. Een tot vier secties kunnen op elk glasplaatje worden geplaatst, afhankelijk van de weefselmassa. Duik de schuif onmiddellijk in koud 100% ethanol.
Verwijder de schuif na twee minuten en bewaar deze in de vriezer voor latere analyse. Op dezelfde dag van de laser capture microdissectie, haal de penframe slides uit de vriezer en werk in een RNA-vrij gebied. Hydrateer de dia's door ze zachtjes twee minuten in 90% ethanol te dompelen, vervolgens twee minuten in 75% ethanol.
Eenmaal gehydrateerd, kleur de prostaatweefsels door de dia's zachtjes tussen vijf en 30 seconden in 0,5% toine blauw te dompelen. Houd het weefsel vast door de dia's twee keer in diep water gedurende 15 seconden te wassen, gevolgd door 75% ethanol gedurende 30 seconden tot drie minuten. Ten slotte brengt u de penframe dia's over naar een RNA-vrije droge container op ijs.
Voordat u met de procedure begint, plaatst u een schuif om te drogen op een schuifwarmer gedurende 15 minuten. Droog alleen de schuif die zal worden verwerkt en bewaar de rest op ijs tot ze nodig zijn. Schakel de LCM-componenten in de volgende volgorde in.
Microscoopvermogen, de lasersleutel, de laserschakelaar en vervolgens de computer. Start vervolgens de laser microdissectie software met behulp van de software. Vraag de microscoop om de dia's en verzamelbuizen te laden.
Klik op ontlaad monsterhouder en laad de schuif op de schuifhouder met het weefsel naar beneden. Plaats de schuifhouder in de juiste sleuf in de microscoop en klik op doorgaan. Klik vervolgens op ontlaad verzamelbuizen.
Label en laad buizen op de buishouder en plaats deze in de juiste sleuf. Bevestig de doppen en voeg 35 microliters lysisbuffer toe. Zorg ervoor dat u bubbels vermijdt.
Zodra de verzameldoppen zijn geladen, klikt u op OK. Gebruik de software om de positie van de schuif in de houder te selecteren en selecteer vervolgens de verzameldop om het monster te verzamelen. Visualiseer en focus de schuif via de computer bij 10 x vergroting.
Gebruik de software om de laser te kalibreren door laser te selecteren. Kalibreer vervolgens, pas de vermogensopening en snelheid van de laser aan door laser en vervolgens controle te selecteren. Blijf aanpassingen maken totdat de laser volledig door het weefsel snijdt.
Het is cruciaal om de gebieden van belang te omlijnen, wat meestal door een door een raad gecertificeerde patholoog wordt gedaan om de gewenste gebieden van het weefsel die aan LCM worden onderworpen nauwkeurig te dissecteren. Gebruik de aftekentool in de software om de gewenste gebieden van epitheel in de weergave te omlijnen en vermijd het verzamelen van enig stroma. Klik op snijden om de laser te starten.
Als een gebied niet volledig is gesneden, gebruikt u de beweeg- en snijtool om er handmatig overheen te gaan. Blijf het objectief naar nieuwe weergaven verplaatsen en herhaal het lasersnijden totdat de schuif volledig is gedissecteeerd of de gewenste hoeveelheid weefsel is verzameld. Wanneer u klaar bent, verwijdert u voorzichtig de buizen uit de verzamelhouder en sluit u de doppen, waarbij u de lysis, buffer en weefsel in de doppen in gedachten houdt.
Korte tijd centrifugeren gedurende 30 seconden om de vloeistof en het weefsel op de bodem van de buis te verzamelen. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius en bewaar ze bij min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor RNA-isolatie. Deze voorbeelden tonen representatieve toluidineblauw gekleurde prostaatsecties op een penframe schuif voor en na het vastleggen van benigne epitheelceltype specifieke control
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van laser-capture microdissectie om zuivere populaties van prostaat-epitheelceltypen te isoleren uit heterogene bevroren prostaatweefsels. Deze methode faciliteert downstream RNA-analyse en ondersteunt onderzoek naar prostaatkanker.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Oncologie
Achtergrond
- Onderzoek naar prostaatkanker vereist nauwkeurige RNA-analyse van specifieke celtypen.
- Heterogene weefsels bemoeilijken de isolatie van zuivere celpopulaties.
- Laser-capture microdissectie biedt een oplossing voor hoogwaardige RNA-extractie.
- Inzicht in verschillen in RNA-expressie kan bijdragen aan de klinische praktijk.
Doel van de studie
- Om totaal RNA te isoleren uit zuivere populaties van prostatische epitheelcellen.
- Om de RNA-expressie in goedaardige versus zieke weefsels te analyseren.
- Om het begrip van prostaatkanker te verbeteren door middel van genexpressie-analyses.
Gebruikte methoden
- Techniek voor laser-capture microdissectie.
- Isolatie van RNA uit bevroren prostaatweefselmonsters.
- Kritieke stappen voor het behoud van de RNA-kwaliteit tijdens de procedure.
- Gebruik van gekoelde pincetten en monteermedium voor de behandeling van weefsel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardig RNA uit specifieke celpopulaties.
- Vermogen om RNA-expressieprofielen in verschillende weefselmonsters te differentiëren.
- Demonstratie van de effectiviteit van laser-capture microdissectie in onderzoek.
- Potentieel voor verbeterde analyse van patiëntspecimens in klinische studies.
Conclusies
- Laser-capture microdissectie is een waardevolle tool voor onderzoek naar prostaatkanker.
- Geïsoleerd RNA kan inzicht bieden in ziektemechanismen.
- Deze methode vergroot het vermogen om heterogene weefsels effectief te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Laser-capture microdissectie (LCM) maakt de nauwkeurige isolatie van zuivere populaties prostaat-epitheelcellen uit heterogeen weefsel mogelijk, waardoor stromale bias in genexpressiestudies direct wordt aangepakt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie en ondersteunt een robuuste biomarkerontdekking voor prostaatkankeronderzoek. De integratie van RNA-analyse afgeleid van LCM in vroege ontdekkings- en translationele fasen verbetert de besluitvorming over de portfolio door biologische ambiguïteit te verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt analyse van celtype-specifieke genexpressie in goedaardig versus ziek prostaatweefsel mogelijk.
- Ondersteunt functionele target-validatie door het isoleren van homogene epitheliale of stromale populaties.
- Vermindert storende stromale signalen, waardoor de voorspellende betrouwbaarheid van moleculaire bevindingen toeneemt.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door de bijdrage van specifieke celtypen aan ziektefenotypen te verduidelijken.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde RNA-monsters voor downstream RT-qPCR- en RNAseq-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door monsterhomogeniteit te waarborgen en variabiliteit te verminderen.
- Maakt standaardisatie van genexpressie-assays mogelijk over klinische en preklinische specimens.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van verbindingen door moleculaire read-outs te koppelen aan gedefinieerde celpopulaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt genexpressieprofielen uit met ziekterelateerde epitheliale compartimenten voor de ontwikkeling van biomarkers.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door celtype-specificiteit te behouden.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgangsbeslissingen mogelijk op basis van robuuste, cel-specifieke moleculaire gegevens.
- Ondersteunt translationeel onderzoek door hoogwaardig RNA te leveren voor de analyse van monsters uit klinische studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
RNA-isolatie op basis van LCM bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking, doelwitvalidatie en translationeel onderzoek, wat een naadloze overgang mogelijk maakt van hypothesetoetsing naar preklinische evaluatie.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van de nulhypothese door zuivere epitheliale of stromale populaties te isoleren voor differentieel genexpressieonderzoek.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve RNA-monsters voor de ontwikkeling en validatie van assays.
- Analytics: Biedt hoogwaardige moleculaire read-outs voor het vergelijken van goedaardige en zieke weefselcondities.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt de relevantie voor de ziekte door moleculaire output af te stemmen op specifieke weefselcompartimenten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow voor celtype-specifieke RNA-analyse over meerdere studies en programma's heen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van RNA-gebaseerde assays.
- Strategische waarde: Ondersteunt gefundeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en versnelling van discovery- en translationele programma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, het bedienen van een cryostaat en technieken voor RNA-preservering.
- Vereist toegang tot LCM-instrumentatie en infrastructuur voor RNA-analyse.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor monsterbereiding en datainterpretatie.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende weefseltypen of ziektemodellen.
- De RNA-integriteit is zeer gevoelig voor verwerking en omgevingsomstandigheden.
