Name: Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Leer hoe u de efficiëntie en gevoeligheid van HPLC post-column derivatisering verbetert met reaction flow kolommen. Deze methode analyseert verbindingen met lage detectie-respons zonder reactiespiralen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door UWS en ThermoFisher Scientific. Een van de auteurs (DK) erkent de ontvangst van een Australian Postgraduate Award.

Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen). Opmerking: Dit protocol beschrijft 3 methoden reactie stroming post-column derivatisering (RF-PCD) technieken, elk met een ander reagens eigen aan de aard van een chemische verbinding van belang. Voor de analyse van ROS naar de sectie &quot;1. Detectie van ROS gebruik DPPH •&quot;, voor de analyse van primaire amines zie rubriek &quot;2. Detectie van primaire amines met behulp van fluorescamine&quot;, en voor de analyse van fenolverbindingen ga naar de sectie &quot;3 . Detectie van fenolenhet gebruik van 4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide &quot;. Gebruik ultrapuur water (bv, Milli-Q-water) in de gehele. Noot: aansluiting van de RF kolom wordt bereikt bijna dezelfde wijze als een gebruikelijke HPLC-kolom met als belangrijkste verschil het aantal eindfittingen een RF kolom. Fittingen gebruikt om een ​​standaard HPLC-kolom HPLC systeem verbinding kunnen worden gebruikt om een ​​RF kolom sluiten op het HPLC systeem. 1. Detectie van ROS gebruik van DPPH • <ol><li> Opzetten van HPLC instrument <ol><li> Bereid de HPLC instrument met 100% water op lijn A en 100% methanol op lijn B als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de eisen van de fabrikant. </li><li> Stel de HPLC instrumentele elementen en de aanvullende derivatisering pomp zoals weergegeven in figuur 4A. </li><li> Stel de UV-Vis detector geanalyseerd bij een golflengte van 520 nm. </li></ol></li><li> Opzetten vanRF column <ol><li> Sluit de inlaat van de RF kolom HPLC instrument. </li><li> Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat. </li><li> Sluit een uitlaatopening periferiepoort de UV-Vis detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id buis. </li><li> Sluit de DPPH • pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom. </li><li> Blokkeer de ongebruikte periferiepoort aan de uitgang van de RF-kolom onder toepassing van een kolom stopper. </li><li> Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn B - 100% methanol. </li><li> Equilibreren van de kolom met 100% methanol mobiele fase gedurende 10 min bij 4,6 mm ID x 100 mm kolomlengte. Deze tijd moet worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken. </li></ol></li><li> Bereiding van DPPH • reagens <ol><li> Bereid een 0,1 mg / ml oplossing van DPPH • in methanol. </li&gt; <li> Ultrasone trillingen de kolf die de DPPH • reagens gedurende 10 min. </li><li> Bedek de kolf in folie ter voorkoming van blootstelling aan licht. </li><li> Spoel de DPPH • pomp met de voorbereide DPPH • reagens volgens de eisen van de fabrikant. </li></ol></li><li> Tuning van de kolom stopcontact RF <ol><li> Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere. </li><li> Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min. </li><li> Weeg de centrale poort vaartuig en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt: Gewicht van de Central Port (g) = eindgewicht van Central Port Vessel (g) - De aanvankelijke gewicht van Central Port Vessel (g) </li><li> Herhaal stap 1.4.2 en 1.4.3 van het effluent verlaat de UV-Vis dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht voor de periferiepoort vaartuigvolgt: Gewicht van perifere Port (g) = eindgewicht van Peripheral Port Vessel (g) - De aanvankelijke gewicht van perifere Port Vessel (g) </li><li> Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere poorten als volgt: % Central Port = gewicht van het Centraal-Port (g) / (gewicht van Centraal-Port (g) + Gewicht van perifere Port (g)) x 100 % Perifere Port = gewicht van perifere Port (g) / (gewicht van Centraal-Port (g) + Gewicht van perifere Port (g)) x 100 </li><li> Zorg ervoor dat de segmentatie verhouding tussen de centrale stroming en de perifere stroom 30:70 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 30%, verminderen de hoeveelheid stroom uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitlaat van de centrale poort. Als de centrale stroom minder dan 30% verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort. </li><li> Herhaal stap 1.4.1 tot 1.4.6 tot een segmentatie verhouding van 30:70 (CV: perifere) wordt bereikt. </li><li> Stel het debiet van de DPPH • pomp reagens 0,5 ml min -1. Opmerking: De RF kolom met DPPH • reagens is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd. </li></ol></li><li> Bericht run shutdown voorwaarden <ol><li> Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt de derivatiseringsreagens pomp flow. </li><li> Verwijder de DPPH • reagens pomp lijn uit het perifere poort en sluit de poort. </li><li> Equilibreren van de kolom met de mobiele fase waarin het wordt opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min. </li><li> Stop de stroom van de mobiele fase pomp op de HPLC instrument. </li><li> Vervang de DPPH • reagens met methanol en zuiveren de extra pomp. Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten. </li></ol></li></ol> 2. Detectie van primaire amines met behulp van tlamine <ol><li> Bereiding van de mobiele fase <ol><li> Bereid 1 L van een 10 mM ammoniumacetaat oplossing, de pH van de oplossing tot 9,0 met 5 M ammoniumhydroxide vóór verdunning volume. </li><li> Voeg 52,6 ml acetonitril (ACN) voor de ammoniumacetaatbuffer een voorgemengde mobiele fase van 95:05 (buffer: ACN) bereiken. </li></ol></li><li> Opzetten van HPLC instrument <ol><li> Bereid de HPLC instrument de voorgemengde bereid buffer lijn A als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de eisen van de fabrikant. </li><li> Stel de HPLC instrumentele elementen en de aanvullende derivatisering pomp zoals weergegeven in figuur 4A. </li><li> Bevestig een pulsdemper spoel de derivatisering pomp. </li><li> Set-up van de fluorescentie detector (FLD) met een golflengte van 390 nm en emissie golflengte van 475 nm. </li></ol></li><li> Opzetten van RF-kolom <ol><li> Sluit the inlaat van de RF kolom HPLC instrument. </li><li> Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat. </li><li> Sluit een uitlaat perifere poort van de RF-kolom om de FLD detector met behulp van een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang. </li><li> Sluit de derivatisering pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom. </li><li> Blokkeer de ongebruikte periferiepoort aan de uitgang van de RF-kolom onder toepassing van een kolom stopper. </li><li> Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn A - 10 mM ammoniumacetaat buffer pH 9, voorgemengd met 5% ACN. </li><li> Equilibreren de kolom met de 100% lijn A mobiele fase gedurende 10 min voor een 4,6 mm ID x 100 mm lengte van de kolom. Deze keer kan worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken. </li></ol></li><li> Bereiding van fluorescamine reagens <ol><li> Voeg 100 ml van een 0,1 mg ml -1 fluorescamine reagens. </li> &lt;li&gt; Sonificeer 1 min. </li><li> Dek af met folie om de blootstelling aan licht. </li><li> Spoel de reagens pomp met de voorbereide fluorescamine reagens volgens de eisen van de fabrikant. </li></ol></li><li> Tuning van de kolom stopcontact RF <ol><li> Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere. </li><li> Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min. </li><li> Weeg het centrale vat en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt in stap 1.4.3. </li><li> Herhaal stappen 2.5.2 tot 2.5.3 van het effluent verlaat de FLD dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht perifere als volgt in stap 1.4.4. </li><li> Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere havens als volgt in stap 1.4.5. </li><li> Zorgen de segmentering verhouding tussen de centrale stroming en de perifereflow is 43:57 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 43%, verminderen de hoeveelheid stroom uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitlaat van de centrale poort. Als de centrale stroom onder 43%, verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort. </li><li> Herhaal stap 2.5.1 tot 2.5.6 tot een segmentatie verhouding van 43:57 (CV: perifere) wordt bereikt. </li><li> Stel het debiet van de mobiele fase pomp 0,7 ml min -1. </li><li> Stel de derivatisering pomp stroomt bij 0,1 ml min -1. Opmerking: De RF kolom met fluorescamine reagens is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd. </li></ol></li><li> Bericht run shutdown voorwaarden <ol><li> Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt de derivatisering pomp. </li><li> Verwijder de derivatisering pomp lijn uit het perifere haven en de stopper. </li><li> Equilibreren van de kolom met de mobiele fasedie moet worden opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min. </li><li> Stop de stroom van de mobiele fase pomp. </li><li> Vervang de fluorescamine reagens met acetonitril en zuiveren de derivatisering pomp. Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten. </li></ol></li></ol> 3. Detectie van fenolen gebruik van 4-aminoantipyreen en kaliumferricyanide <ol><li> Bereiding van de mobiele fase <ol><li> Bereid 1 liter van een 100 mM ammoniumacetaat oplossing, de pH van de oplossing tot 9,0 met 5 M ammoniumhydroxide vóór verdunning volume. </li><li> Voeg 52,6 ml methanol aan ammoniumacetaat buffer tot een voorgemengde mobiele fase van 95 bereiken: 5 (buffer: methanol). </li></ol></li><li> Opzetten van HPLC instrument <ol><li> Bereid de HPLC instrument de voorgemengde bereid buffer lijn A als de mobiele fase. Spoel de pomp volgens de fabrikant &#39;; S eisen. </li><li> Stel de HPLC instrumentele componenten en de twee extra reagens pompen zoals weergegeven in figuur 4B. </li><li> Bevestig een pulsdemper spoel aan elk van de reagens pompen. </li><li> Stel de UV-Vis detector geanalyseerd bij een golflengte van 500 nm. </li></ol></li><li> Opzetten van RF-kolom <ol><li> Sluit de inlaat van de RF kolom HPLC instrument. </li><li> Sluit een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang aan de centrale poort van de RF-kolom uitlaat. </li><li> Sluit een uitlaat periferiepoort van de RF kolom om de UV-Vis detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id buis. </li><li> Sluit elke reagens (dat wil zeggen 4-aminoantipyreen en kalium ferricyanide) pompstreng een periferiepoort aan de uitgang van de RF kolom. </li><li> Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp 1 ml min-1 bij 100% lijn A - 100 mM ammoniumacetaat buffer pH 9, voorgemengd met 5% methanol. </li><li> Equilibreren van de kolom wet de 100% lijn A mobiele fase gedurende 10 min voor een 4,6 mm ID x 100 mm lengte van de kolom. Deze keer kan worden geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken. </li></ol></li><li> Bereiding van 4-aminoantipyreen reagens <ol><li> Bereid een ammonium acetaat buffer met een pH van 9 door stap 3.1.1. </li><li> Weeg 150 mg 4-aminoantipyreen en los op in 100 ml bereide ammoniumacetaat-buffer (pH 9). </li><li> Sonificeer 1 min. </li><li> Dek af met folie om de blootstelling aan licht. </li><li> Ontlucht het eerste reagens pomp met de bereide 4-aminoantipyreen reagens volgens voorschriften van de fabrikant. </li></ol></li><li> Bereiding van kalium ferricyanide reagens <ol><li> Weeg 150 mg kalium ferricyanide en los op in 100 ml ammoniumacetaat buffer (pH 9) bereid volgens stap 3.1.1. </li><li> Sonificeer 1 min. </li><li> Bedek in folie ter voorkoming van blootstelling aan licht. </li><li> Purge het tweede reagens pomp met de bereide kalium ferricyanide reagens volgens voorschriften van de fabrikant. </li></ol></li><li> Afstemmen van de RF-kolom <ol><li> Weeg nauwkeurig twee schone en droge vaten. Label ene vat als de centrale en de andere als perifere. </li><li> Verzamel de effluent verlaat de centrale poort in het vat gelabelde centraal voor 1,0 min. </li><li> Weeg het centrale vat en bereken het gewicht van de stroom vanaf de centrale poort als volgt in stap 1.4.3. </li><li> Herhaal stappen 3.6.2 tot 3.6.3 van het effluent verlaat de UV-Vis dat voor het periferiepoort van de RF kolom wordt bevestigd en bereken gewicht perifere als volgt in stap 1.4.4. </li><li> Bereken het percentage van de stroom uit de centrale en perifere havens als volgt in stap 1.4.5. </li><li> Zorg ervoor dat de segmentatie verhouding tussen de centrale stroming en de perifere stroom 50:50 (centraal: perifere). Als de centrale stroom boven 50%, verminderen devochtverlies uittredend toevoegen van een lengte van 0,13 mm id slang aan de uitgang centrale poort. Als de centrale stroming dan 50%, verminderen de lengte van 0,13 mm slang van de centrale poort. </li><li> Herhaal stap 3.6.1 tot 3.6.6 tot een segmentatie verhouding van 50:50 (CV: perifere) wordt bereikt. </li><li> Stel het debiet van de 4-aminoantipyreen pomp 0,5 ml min -1. </li><li> Stel het debiet van het kalium- ferricyanide pomp 0,25 ml min -1. Opmerking: De RF kolom met de tweecomponenten reagentia is nu klaar voor analyse. Monsters kunnen nu worden geïnjecteerd. </li></ol></li><li> Bericht run shutdown voorwaarden <ol><li> Zodra alle van de monsters werden geïnjecteerd de run is voltooid, wat aangeeft dat de run is voltooid, stopt zowel van het reagens pompen. </li><li> Verwijder de reagens pomp lijnen uit het perifere havens en ze te vervangen door een 15 cm stuk van 0,13 mm buis. </li><li> Equilibreren van de kolom met de mobiele fase in which moet worden opgeslagen doordat de mobiele fase door de kolom stroomt in 1 ml min-1 gedurende 10 min. </li><li> Stop de stroom van de mobiele fase pomp op de HPLC instrument. </li><li> Vervang beide reagentia op het reagens pompen met methanol en zuiveren de extra pompen volgens eis fabrikant. Opmerking: Het HPLC-systeem kunnen nu worden afgesloten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+1-%282-pyridylazo%29-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li>
<li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography%3A+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu%28II%29+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li>
<li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li>
<li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro%28so%29+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis%2FGriess+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li>
<li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds%3A+a+review+on+instrumentation+and+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li>
<li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li>
<li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+%28UHPLC%29+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li>
<li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li>
<li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li>
<li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescamine%3A+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids%2C+Peptides%2C+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li>
<li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI%2FMS%28n%29+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li>
<li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li>
<li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li>
<li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liq.+Chrom.+Rel.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li>
<li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li>
<li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+%28HPLC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li>
<li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li>
<li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li>
<li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid%3A+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
<li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li>
<li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li>
<li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations%3A+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

RF-PCD maakt het efficiënt mengen van het derivatiseringsreagens het effluent na de kolom HPLC zonder gebruik van reactie spoelen, het minimaliseren van de effecten van bandverbreding en verbetering scheidend vermogen. RF-PCD werkwijzen hebben ook aangetoond verbeterd signaal respons met betrekking tot detectie methode. Camenzuli et al. 28 was de eerste die de toepassing van reactie stroom kolommen met DPPH • voor de detectie van ROS in een espresso monster melden. Hun studie omvatte de an...

High performance liquid chromatografie (HPLC) in combinatie met post column derivatisering (PCD) is een krachtige tool die nuttig zijn bij het oplossen van een aantal zaken in het analytisch laboratorium is. Het kan worden gebruikt om verbindingen die anders ondetecteerbaar de reeks detectoren verkrijgbaar zijn 1,2 detecteren, verhogen het signaal van het doelanalyt, waarbij ondergrenzen van detectie en kwantificering 3-5 toelaat of selectief derivatiseren een doelanalyt ter voorkoming matrixeffecten 6. Algemeen gebruikte PCD reacties omvatten de omzetting van amines, zoals aminozuren, met ortho-phthaladehyde 7-9, ninhydrine 9,10 of 11,12 fluorescamine, de derivatisering van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met de 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil groep (DPPH •) 13,14 of 2,2&#39;-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) 15,16 en het gebruik van de jodide-azide reagens zwavel c derivatiserenontaining verbindingen 17,18. Er zijn echter vele nadelen aan het gebruik van PCD reacties met HPLC systemen 6. Voornamelijk hiervan is het gebruik van spoelen reactie tussen het punt van toevoeging van het derivatiseringsreagens (s) en de detector, welke tijd mogelijk maken voor het mengen en de reactie plaatsvinden 8. Deze reactie lussen vaak volumes van 500 ul of meer, die significant in vergelijking met het volume van de rest van het HPLC-systeem 19. Het gebruik van deze hoge reactievolume lussen resulteert in verhoogde piekverbreding vergeleken met wat zou worden waargenomen zonder de aanwezigheid van de reactielus. Dit resulteert in kortere, bredere pieken die hoger kwantificeringsgrenzen en detectie hebben en negatief beïnvloedt chromatografische resolutie. Figuren 1 en 2 benadrukken de verslechtering van piekvorm die resulteren uit de toevoeging van verschillende postkolom reactielus volumes. deze analysewerd uitgevoerd met een mobiele fase mengsel van 94% methanol en 6% Milli-Q water. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 1 ml / min, het injectievolume was 20 ui en de golflengte analyse was 265 nm. Spoelen van verschillende dode volume van 20 pl tot 1000 ul werden ingevoegd tussen de kolom en de detector om de effecten van reactielus dood volume in PCD werkwijzen simuleren. Deze lussen werden uit roestvrij stalen buis van 0,5 mm inwendige diameter. Het experiment werd uitgevoerd op een HPLC-systeem dat bestaat uit een regelaar (SCL-10AVP), een lage druk Gradient klep (FCL-10ALVP), een pomp (LC-20AD), een injector (SIL-10ADVP), en een PDA detector ( SPD-M10ADVP). De mobiele fase werd door een ontgasser gepompt voorafgaand aan het inbrengen in het HPLC-systeem. De scheiding werd uitgevoerd met een 250 mm x 4,6 mm ID kolom 5 urn. Proefomstandigheden werden gekozen typisch PCD reacties die onlangs in de literatuur bekend zijn. Deeenvoudigste, het meest voorkomende postkolom reactor opstelling wordt aangeduid als een niet-gesegmenteerde buisvormige reactor die in feite een lange, dunne buis waardoor de vloeistof kan stromen en de reactie kan plaatsvinden. In dit systeem piekverbreding is afhankelijk niet alleen het dode volume toegevoegd aan het systeem, maar ook de inwendige diameter van de buis zoals door Iijima et al. 8. Bovendien spoelgeometrie een rol speelt bij de waargenomen merk verbreding. Stewart 20 verklaard dat het wikkelen van de reactor verandert de secundaire stroom profielen, wat resulteert in betere menging, waardoor het dode volume geminimaliseerd worden. Men heeft gezegd dat de piek verbreding niet significant is bij het ​​gebruik van een open rond gebreide spoel 21. Wanneer de piekverbreding overmatig groot, kunnen andere soorten reactoren ook worden overwogen 20,22. Deze kunnen onder meer bed reactoren of gesegmenteerde stroom reactoren. Deze reactoren zijn in het bijzonder bruikbaar voor langzame reacties die anders require grote reactie loops. Als niet-gesegmenteerde buisvormige reactoren zijn de meest voorkomende soorten reactoren worden gebruikt in PCD-toepassingen, de rest van dit artikel gaat met dit type reactor setup. Het ontwerp van de reactiekolom stroom (RF) omvat een multi-poort eindfitting waarmee mobiele fase om de kolom af te sluiten (of voer) met een enkele poort aan het radiale centrale gebied van de kolom of drie poorten aan de buitenste wandgebied van de kolom (zie figuur 3). Beide stromen worden gescheiden onder toepassing van een eindfitting die een centrale poreuze frit die wordt omgeven door een ondoordringbare ring die op zijn beurt omgeven door een buitenste poreuze frit die zich uitstrekt naar de kolomwand. Door de centrale ondoordringbare ring dwarsstroom niet tussen de twee poreuze gebieden. Tijdens de reactie stroom chromatografie, worden de derivatiseringsreagens (s) tegen de richting van de mobiele fasestroom gepompt in een of two van de buitenste poorten van de reactiekolom stroom. De kolom eluent wordt gemengd met het derivatiseringsreagens (s) in de buitenste frit en doorgegeven aan de detector via een buitenmantel poort. Reactie stroom kan worden gebruikt voor een enkele reagens derivatisering (1 poort voor het derivatiseringsreagens, 1 poort naar de kolom eluent doorgeven aan de detector en 1 poort geblokkeerd) of een dubbele reagenssysteem (2 poorten voor de derivatisering reagentia en 1 poort langs de kolom elutiemiddel waardoor de detector). De stroom uit de centrale stroom kan worden gebruikt om de gederivatiseerde kolom eluent effectief multiplexing detectie 23, of doorgegeven aan afval detecteren. Een belangrijke tuning techniek die beschikbaar is bij het uitvoeren van RF-PCD chromatografie is de verhouding tussen de centrale en perifere stromen. De optimale verhouding voor elke derivatisering afhankelijk van een aantal factoren als de centrale stroom wordt gedetecteerd of doorgegeven aan afval. Derhalve opnieuw de optimale verhouding is vastgesteld, Moet ervoor worden gezorgd dat de juiste stroom verhouding voorafgaand aan elke run wordt uitgevoerd wordt bereikt. Gebleken is dat het gebruik van een frit op de kolom eluent stroom en derivatiseringsreagens RF-PCD leidt tot meer efficiënte menging in vergelijking met traditionele mengtechnieken die gebruiken typisch een dood volume nul T-stuk of klein dood volume meng W- piece de twee stromen te mengen. Dit heeft het gebruik van relatief kleine lussen reactie, of zelfs de eliminatie van de reactielus geheel. De vermindering van de reactielus formaat leidt tot scherpere pieken in vergelijking met traditionele postkolom derivatisering methoden. Dit betekent dat, hoewel niet alle van de kolom eluent gederivatiseerd, grotere signaal-ruisverhoudingen worden waargenomen en dus lagere detectiegrenzen en kwantificatie worden verkregen. Reactie stroom chromatografie ontwikkeld om problemen met de aanpassing van PCD reactie overwinnens moderne HPLC kolommen en systemen, met name het rendementsverlies door bandverbreding door grote postkolom dode ruimten als gevolg van de noodzaak om gebruik grote reactievolume lussen. Hoe efficiënter mengprocessen in RF-PCD vergelijking met conventionele PCD dat kleinere reactielus volume worden gebruikt leidt tot een toename waargenomen scheidingsefficiëntie. Verder RF-PCD chromatografie toont beide verhoogd signaal en verminderde ruis in vergelijking met conventionele technieken PCD resulteert in lagere grenzen van de detectie en kwantificering in vergelijking met conventionele methoden PCD. Een bijkomend voordeel van RF-PCD PCD vergelijking met conventionele werkwijzen is de mogelijkheid om de gederivatiseerde stroom die elueert uit de centrale poort van de RF kolom en het gederivatiseerde stroom die elueert uit het omtreksgebied van de kolom te volgen. RF-PCD is een relatief nieuwe, maar veelbelovende techniek die veel voordelen ten opzichte van traditionele methoden PCD weergeeft. <p class="jove_content"&gt; Verbinding van de RF kolom wordt bereikt bijna dezelfde wijze als een gebruikelijke HPLC-kolom met als belangrijkste verschil het aantal eindfittingen een RF kolom. Fittingen gebruikt om een ​​standaard HPLC-kolom HPLC systeem verbinding kunnen worden gebruikt om een ​​RF kolom sluiten op het HPLC systeem.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Niet-commercieel</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Wordt geleverd met de kolom</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-punts analytische weegschaal</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Niet-wetenschappelijk materiaal</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Elke kleine fles met een platte bodem is voldoende, bijvoorbeeld, HPLC-flessen</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Hangt af van het gebruikte instrument</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetrische kolven, pipetten, etc. Hoeveelheid en volumes zijn afhankelijk van de monstervoorbereidingsmethode.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosiefd</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyreen&nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanide&nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

bericht column derivatisering behulp reaction flow high performance liquid chromatography columns

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Een protocol voor het gebruik van reactieflow-kolommen voor hoogprestatie vloeistofchromatografie voor methoden die postkolomderivatisatie (PCD) gebruiken, wordt gepresenteerd. Een grote moeilijkheid bij het aanpassen van PCD aan moderne HPLC-systemen en -kolommen is de behoefte aan grote reactiespiralen die reagentenmenging en vervolgens de derivatisatiereactie mogelijk maken. Dit grote dode volume na de kolom leidt tot bandverbreding, wat resulteert in een verlies van waargenomen scheidingsefficiëntie en inderdaad detectie in gevoeligheid. Bij reactieflow-postkolomderivatisatie (RF-PCD) worden de derivatisatiereagens(en) tegen de stroom van de mobiele fase gepompt in een of twee van de buitenste poorten van de reactieflowkolom waar het wordt gemengd met kolomeffluënt binnen een frit gehuisvest in de kolomendfitting. Deze techniek zorgt voor een efficiëntere menging van het kolomeffluënt en derivatisatiereagens(en), wat betekent dat het volume van de reactielussen kan worden geminimaliseerd of zelfs helemaal kan worden geëlimineerd. Er is gevonden dat RF-PCD-methoden beter presteren dan conventionele PCD-methoden in termen van waargenomen scheidingsefficiëntie en signaal-ruisverhouding. Een verder voordeel van RF-PCD-technieken is de mogelijkheid om het effluënt dat uit de centrale poort komt in zijn ongederivatiseerde toestand te monitoren. RF-PCD is momenteel getest op een relatief klein aantal postkolomreacties, maar er is momenteel geen reden om te suggereren dat RF-PCD niet zou kunnen worden aangepast aan elke bestaande een- of tweede component (zolang beide reagentia tegelijkertijd worden toegevoegd) postkolomderivatisatiereactie.

De eerste PCD methode die werd aangepast voor RF-PCD is de derivatisering van antioxidanten met de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil groep (DPPH •) 24. Deze reactie werd geïntroduceerd door Koleva et al. 25 en is op grote schaal gebruikt sinds. De detectie is gebaseerd op de ontkleuring van de DPPH • radicalen in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, vandaar de aanwezigheid van antioxidanten leidt tot een daling van de absorptie waargenomen. De DPPH • reac...

Een protocol voor het gebruik van reactieflow hoogprestatievloeistofchromatografie kolommen voor methoden die post-kolom derivatisatie (PCD) toepassen, wordt gepresenteerd.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Het algemene doel van deze methode is om de efficiëntie en gevoeligheid van hogedrukvloeistofchromatografie met postkolom-derivatisering, of PCD-methode, te verbeteren door het gebruik van een reactiefluxkolom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in vakgebieden zoals de farmaceutische, biomedische en milieuwetenschappen, waarbij verbindingen met een lage respons voor HPLC-detectoren worden geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen reactiespoelen nodig zijn.Omdat het mengen van het kolomeffluent en het derivatiseringsreagens efficiënter verloopt dan bij conventionele methoden, is deze methode gebruikt om inzicht te verschaffen in antioxidanten, aminozuren en fenolen. Het kan ook worden toegepast op andere klassen verbindingen, zoals thiolen, metalen, antibiotica en toxines.Hoewel het gehele monster niet wordt gederivatiseerd, is de concentratie van de analyt binnen de effluentstroom hoger dan bij conventionele analyse met post-kolom derivatisatie, dankzij een geringere bandverbreding. Om deze procedure te starten, bereidt u het HPLC-instrument voor met 100% water op Lijn A en 100% methanol op Lijn B als mobiele fase, waarbij de pompen worden gespoeld volgens de vereisten van de fabrikant. Stel de HPLC-instrumentele componenten en de aanvullende derivatisatiepomp in.Stel vervolgens de UV/VIS-detector in om te analyseren bij een golflengte van 520 nanometer. Verbind de inlaat van de reactiestroomkolom, of RF-kolom, met het HPLC-instrument. Verbind een uitgangspoort met de UV/VIS-detector met behulp van een slang van 15 centimeter met een binnendiameter van 0,13 millimeter.Sluit vervolgens de DPPH-pompleiding aan op een perifere poort aan de uitlaat van de RF-kolom. Blokkeer de ongebruikte perifere poort aan de uitlaat van de RF-kolom met een kolomstopper. Sluit een stuk slang van 15 centimeter met een binnendiameter van 0,13 millimeter aan op de centrale uitlaatpoort van de RF-kolom.Stel de stroomsnelheid van de HPLC-pomp in op 1 mm/min met 100% methanol. Equilibreer vervolgens de kolom gedurende 10 minuten met 100% methanol. Bereid op dit punt een oplossing van 0,1 mg/mL DPPH in methanol.Sonicate de kolf met het DPPH-reagens gedurende 10 minuten. Spoel de DPPH-pomp door met het bereide DPPH-reagens volgens de vereisten van de fabrikant. Neem vervolgens twee droge en schone vaten en label er één als "centraal" en de andere als "perifeer". Weeg de twee vaten nauwkeurig.Vang het effluent dat uit de centrale poort stroomt gedurende één minuut op in het vat met het label "central". Bereken na het opnieuw wegen van het vat van de centrale poort het gewicht van de stroom vanuit de centrale poort. Herhaal de voorgaande stappen voor het effluent dat uit de UV/VIS-detector stroomt, welke is aangesloten op de perifere poort van de RF-kolom.Bereken het gewicht voor het vat van de perifere poort. Bereken vervolgens het percentage van de stroom die vanuit de centrale en perifere poorten komt. Herhaal de vorige stappen totdat de stroomverhouding correct is, en stel daarna de stroomsnelheid van de DPPH-pomp in op 0,5 milliliters per minuut.Zodra de run is voltooid, wordt de flow van de derivatiseringsreagenspomp gestopt. Verwijder de pompleiding van het DPPH-reagens uit de perifere poort en sluit de poort af met een stop. Equilibreer de kolom met de mobiele fase waarin deze bewaard moet worden, waarbij de mobiele fase gedurende 10 minuten met een snelheid van één millimeter per minuut door de kolom wordt geleid.Stop vervolgens de flow van de bellenfasepomp op het HPLC-instrument. Vervang tenslotte het DPPH-reagens door methanol en spoel de extra pomp door. Hier worden twee chromatogrammen van een ristretto-koffiemonster getoond, gederivatiseerd met een DPPH-radicaal met behulp van zowel conventionele PCD- als RF-PCD-instrumentatie.De berekende kwantificerings- en detectielimieten voor elk van de geanalyseerde aminozuren in zowel de RF-PCD- als de conventionele PCD-modus zijn hier vermeld. Een chromatogram van de vier aminozuren die zijn geanalyseerd met de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de niet-gederivatiseerde stroom van de RF-PCD-methode wordt hier getoond. Een vergelijking van de signalen verkregen voor de pieken van glycine en leucine met gebruik van zowel de conventionele PCD- als de RF-PCD-methode wordt hier weergegeven.Hier wordt een vergelijking getoond van de piekbreedte van de tryptofaanpiek bij analyse met de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de ongederiveerde stroom van de RF-PCD-methode. Een testmonster met 21 componenten, bestaande uit zowel componenten die reageren op het derivatiseringsschema als componenten die dat niet doen, werd gescheiden, gederivatiseerd en gedetecteerd. Ten behoeve van de vergelijking werd hetzelfde mengsel ook gescheiden en gedetecteerd zonder derivatisering.Hier wordt een vergelijking getoond van de piekvorm van para-Kresol, zowel gederivatiseerd met behulp van de RF-PCD-kolom als ongederivatiseerd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in dezelfde tijd worden opgezet als een conventionele analyse met post-kolom derivatisering. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de stroomsnelheidsverhoudingen zo dicht mogelijk bij de voorgeschreven waarden liggen.Na deze procedure kunnen andere reagentia voor derivatisering na de kolom, zoals OPA, ninhydrine of halogenen, worden gebruikt om andere verbindingen te analyseren. Na het bekijken van deze video moet u een goed beeld hebben van hoe u een reactiestroomkolom instelt en afstelt.

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hier presenteren we een protocol voor de werking en optimalisatie van Active Flow Technology (AFT) kolom in Curtain flow (CF) modus voor verbeterde scheidingsprestaties.

Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Hier presenteren we een protocol voor de geoptimaliseerde FlashPack capillaire kolomverpakkingsprocedure. Toepassing van een geoptimaliseerd protocol op een gemeenschappelijke 100-bar drukbomopstelling maakt 10 keer snellere verpakking en productie van lange ultra-high performance capillaire kolommen mogelijk.

Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

Hier presenteren we een protocol voor de werking en afstemming van parallelle gesegmenteerde flow chromatografie kolommen om multiplexed detectie mogelijk te maken.

Tuning een parallelle gesegmenteerd Flow Column en Multiplexed Detection inschakelen

Phosphoinositides signaleren lipiden waarvan de relatieve abundantie snel verandert in reactie op verschillende stimuli. Dit artikel beschrijft een methode om de overvloed aan phosphoinositides meten door metabolisch labelen van cellen met 3H-myo-inositol, gevolgd door extractie en deacylering. Geëxtraheerd glycero-inositiden omgezet worden vervolgens gescheiden door hoge-prestatie vloeistofchromatografie en gekwantificeerd door flow scintillatieteller.

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Een nieuwe methodologie wordt aan synthetiseren en programma hoofdketen vloeibaar-kristallijne elastomeren met in de handel verkrijgbaar uitgangsmonomeren. Een uitgebreide lijst van thermomechanische eigenschappen werd aangepast door de hoeveelheid van crosslinker, terwijl de bediening prestatie was afhankelijk van de hoeveelheid aangebrachte spanning tijdens het programmeren.

Synthese programmeerbare hoofdketen Vloeibaar-kristallijne Elastomers Met een tweetraps thiol-acrylaat Reaction

Hier beschrijven we in grote detail een gevestigd en robuust protocol voor de extractie van glucosinolaten uit gemalen plantmateriaal. Na een on-column sulfatase-behandeling van de extracten, worden de desulfoglucosinolates geëlueerd en geanalyseerd door middel van hoog-druk vloeistof chromatografie.

Een eenvoudige methode voor glucosinolaat Extractie en analyse met hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC)

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

Leer hoe u de efficiëntie en gevoeligheid van HPLC post-column derivatisering verbetert met reaction flow kolommen. Deze methode analyseert verbindingen met lage detectie-respons zonder reactiespiralen.

Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Meer video's verkennen