Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Het algemene doel van deze methode is om de efficiëntie en gevoeligheid van hogedrukvloeistofchromatografie met postkolom-derivatisering, of PCD-methode, te verbeteren door het gebruik van een reactiefluxkolom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in vakgebieden zoals de farmaceutische, biomedische en milieuwetenschappen, waarbij verbindingen met een lage respons voor HPLC-detectoren worden geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen reactiespoelen nodig zijn.

Omdat het mengen van het kolomeffluent en het derivatiseringsreagens efficiënter verloopt dan bij conventionele methoden, is deze methode gebruikt om inzicht te verschaffen in antioxidanten, aminozuren en fenolen. Het kan ook worden toegepast op andere klassen verbindingen, zoals thiolen, metalen, antibiotica en toxines.

Hoewel het gehele monster niet wordt gederivatiseerd, is de concentratie van de analyt binnen de effluentstroom hoger dan bij conventionele analyse met post-kolom derivatisatie, dankzij een geringere bandverbreding. Om deze procedure te starten, bereidt u het HPLC-instrument voor met 100% water op Lijn A en 100% methanol op Lijn B als mobiele fase, waarbij de pompen worden gespoeld volgens de vereisten van de fabrikant. Stel de HPLC-instrumentele componenten en de aanvullende derivatisatiepomp in.

Stel vervolgens de UV/VIS-detector in om te analyseren bij een golflengte van 520 nanometer. Verbind de inlaat van de reactiestroomkolom, of RF-kolom, met het HPLC-instrument. Verbind een uitgangspoort met de UV/VIS-detector met behulp van een slang van 15 centimeter met een binnendiameter van 0,13 millimeter.

Sluit vervolgens de DPPH-pompleiding aan op een perifere poort aan de uitlaat van de RF-kolom. Blokkeer de ongebruikte perifere poort aan de uitlaat van de RF-kolom met een kolomstopper. Sluit een stuk slang van 15 centimeter met een binnendiameter van 0,13 millimeter aan op de centrale uitlaatpoort van de RF-kolom.

Stel de stroomsnelheid van de HPLC-pomp in op 1 mm/min met 100% methanol. Equilibreer vervolgens de kolom gedurende 10 minuten met 100% methanol. Bereid op dit punt een oplossing van 0,1 mg/mL DPPH in methanol.

Sonicate de kolf met het DPPH-reagens gedurende 10 minuten. Spoel de DPPH-pomp door met het bereide DPPH-reagens volgens de vereisten van de fabrikant. Neem vervolgens twee droge en schone vaten en label er één als "centraal" en de andere als "perifeer". Weeg de twee vaten nauwkeurig.

Vang het effluent dat uit de centrale poort stroomt gedurende één minuut op in het vat met het label "central". Bereken na het opnieuw wegen van het vat van de centrale poort het gewicht van de stroom vanuit de centrale poort. Herhaal de voorgaande stappen voor het effluent dat uit de UV/VIS-detector stroomt, welke is aangesloten op de perifere poort van de RF-kolom.

Bereken het gewicht voor het vat van de perifere poort. Bereken vervolgens het percentage van de stroom die vanuit de centrale en perifere poorten komt. Herhaal de vorige stappen totdat de stroomverhouding correct is, en stel daarna de stroomsnelheid van de DPPH-pomp in op 0,5 milliliters per minuut.

Zodra de run is voltooid, wordt de flow van de derivatiseringsreagenspomp gestopt. Verwijder de pompleiding van het DPPH-reagens uit de perifere poort en sluit de poort af met een stop. Equilibreer de kolom met de mobiele fase waarin deze bewaard moet worden, waarbij de mobiele fase gedurende 10 minuten met een snelheid van één millimeter per minuut door de kolom wordt geleid.

Stop vervolgens de flow van de bellenfasepomp op het HPLC-instrument. Vervang tenslotte het DPPH-reagens door methanol en spoel de extra pomp door. Hier worden twee chromatogrammen van een ristretto-koffiemonster getoond, gederivatiseerd met een DPPH-radicaal met behulp van zowel conventionele PCD- als RF-PCD-instrumentatie.

De berekende kwantificerings- en detectielimieten voor elk van de geanalyseerde aminozuren in zowel de RF-PCD- als de conventionele PCD-modus zijn hier vermeld. Een chromatogram van de vier aminozuren die zijn geanalyseerd met de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de niet-gederivatiseerde stroom van de RF-PCD-methode wordt hier getoond. Een vergelijking van de signalen verkregen voor de pieken van glycine en leucine met gebruik van zowel de conventionele PCD- als de RF-PCD-methode wordt hier weergegeven.

Hier wordt een vergelijking getoond van de piekbreedte van de tryptofaanpiek bij analyse met de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de ongederiveerde stroom van de RF-PCD-methode. Een testmonster met 21 componenten, bestaande uit zowel componenten die reageren op het derivatiseringsschema als componenten die dat niet doen, werd gescheiden, gederivatiseerd en gedetecteerd. Ten behoeve van de vergelijking werd hetzelfde mengsel ook gescheiden en gedetecteerd zonder derivatisering.

Hier wordt een vergelijking getoond van de piekvorm van para-Kresol, zowel gederivatiseerd met behulp van de RF-PCD-kolom als ongederivatiseerd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in dezelfde tijd worden opgezet als een conventionele analyse met post-kolom derivatisering. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om erop te letten dat de stroomsnelheidsverhoudingen zo dicht mogelijk bij de voorgeschreven waarden liggen.

Na deze procedure kunnen andere reagentia voor derivatisering na de kolom, zoals OPA, ninhydrine of halogenen, worden gebruikt om andere verbindingen te analyseren. Na het bekijken van deze video moet u een goed beeld hebben van hoe u een reactiestroomkolom instelt en afstelt.