Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Het algemene doel van deze methode is om de efficiëntie en gevoeligheid van postkolomderivatisatie bij hoge-drukvloeistofchromatografie, of PCD-methode, te verbeteren door het gebruik van een reactiestroomkolom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op gebieden zoals de farmaceutische, biomedische en milieuwetenschappen, waar verbindingen die een lage respons hebben op HPLC-detectoren worden geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen reactiespiralen nodig zijn.

Aangezien het mengen van de kolomdamp en het derivatiseringsreagens efficiënter verloopt dan conventionele methoden. Deze methode is gebruikt om inzicht te geven in antioxidanten, aminozuren en fenolen. Het kan ook worden toegepast op andere klassen van verbindingen, zoals thiolen, metalen, antibiotica en toxines.

Hoewel het hele monster niet wordt gederivatiseerd, is door de lagere bandverbreding de concentratie van het analyt in de uitstromende stroom hoger dan bij conventionele postkolomderivatiseringanalyse. Om deze procedure te starten, bereidt u het HPLC-instrument voor met 100% water op lijn A en 100% methanol op lijn B als mobiele fase, en spoelt u de pompen volgens de fabrikantvereisten. Stel de HPLC-instrumentcomponenten en de extra derivatiseringspompen in.

Stel vervolgens de UV/VIS-detector in om te analyseren bij een golflengte van 520 nanometer. Verbind de inlaat van de reactiestroom-, of RF-, kolom met het HPLC-instrument. Verbind een uitlaatrandpoort met de UV/VIS-detector met behulp van een buis van 15 centimeter lengte met een binnendiameter van 0,13 millimeter.

Verbind vervolgens de DPPH-pompplein met een randpoort op de uitlaat van de RF-kolom. Blokkeer de ongebruikte randpoort op de uitlaat van de RF-kolom met een kolomdopbuis. Verbind een buis van 15 centimeter lengte met een binnendiameter van 0,13 millimeter met de centrale uitlaatpoort van de RF-kolom.

Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp naar één millimeter per minuut bij 100% methanol. Equilibreer vervolgens de kolom gedurende 10 minuten met 100% methanol. Bereid op dit punt een oplossing van 0,1 milligram per milliliter DPPH en methanol.

Soniceer de fles met het DPPH-reagens gedurende 10 minuten. Spuit de DPPH-pomp door met het bereide DPPH-reagens volgens de fabrikantvereisten. Neem vervolgens twee droge en schone vaten en label er een als centraal en de andere als rand. Weeg de twee vaten nauwkeurig af.

Verzamel het uitstromende vocht uit de centrale poort in het vat gelabeld als centraal gedurende één minuut. Bereken na het opnieuw wegen van het centrale poortvat het gewicht van de stroom uit de centrale poort. Herhaal de vorige stappen voor het vocht dat uit de UV/VIS uitkomt die is bevestigd aan de randpoort van de RF-kolom.

Bereken het gewicht voor het randpoortvat. Bereken vervolgens het percentage van de stroom die uit de centrale en randpoorten komt. Herhaal de vorige stappen totdat de stroomsnelheid correct is, stel vervolgens de stroomsnelheid van de DPPH-pomp in op 0,5 milliliter per minuut.

Zodra de run is voltooid, stopt u de stroom van de derivatiseringsreagenspomp. Verwijder de DPPH-reagenspompleiding van de randpoort en stop de poort. Equilibreer de kolom met de mobiele fase waarin deze moet worden opgeslagen, laat de mobiele fase gedurende 10 minuten met een snelheid van één millimeter per minuut door de kolom stromen.

Stop vervolgens de stroom van de bubbelfasepomp op het HPLC-instrument. Vervang ten slotte het DPPH-reagens door methanol en spoel de extra pomp door. Twee chromatogrammen van een ristretto-koffiemonster, gederivatiseerd met een DPPH-radicaal met behulp van zowel conventionele PCD- als RF-PCD-instrumenten, worden hier getoond.

De berekende kwantificerings- en detectielimieten voor elk van de aminozuren die in zowel RF-PCD- als conventionele PCD-modi zijn geanalyseerd, worden hier vermeld. Een chromatogram van de vier aminozuren die zijn geanalyseerd met behulp van de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de ongederivatiseerde stroom van de RF-PCD-methode wordt hier getoond. Een vergelijking van de signalen verkregen voor de pieken als gevolg van glycine en leucine met behulp van zowel de conventionele PCD- als RF-PCD-methoden wordt hier weergegeven.

Een vergelijking van de piekbreedte van de tryptofaanpiek bij analyse met behulp van de conventionele PCD-methode, de RF-PCD-methode en de ongederivatiseerde stroom van de RF-PCD-methode wordt hier getoond. Een testmonster met 21 componenten dat enkele componenten bevat die een reactie vertonen op het derivatiseringsschema en sommige die dat niet doen, werd gescheiden, gederivatiseerd en gedetecteerd. Hetzelfde mengsel werd ook ongederivatiseerd gescheiden en gedetecteerd voor vergelijking.

Een vergelijking van de piekvorm van para-Cresol, zowel gederivatiseerd met behulp van de RF-PCD-kolom als ongederivatiseerd, wordt hier getoond. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in dezelfde tijd worden ingesteld als conventionele postkolomderivatiseringanalyse. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden dat u zo dicht mogelijk bij de voorgeschreven stroomsnelheidsverhoudingen moet zijn.

Na deze procedure kunnen andere postkolomderivatiseringsreagensen, zoals OPA, ninhydrine of halogenen, worden gebruikt om andere verbindingen te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed idee moeten hebben over het instellen en afstemmen van een reactiestroomkolom.