Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen
30 maart 2017
Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.
Het algemene doel van dit experiment is om een gespecialiseerd microfluïdisch apparaat te maken en dit te gebruiken om de levensduur en cellulaire fenotypes van een enkele gistcel te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele van de belangrijkste vragen op het gebied van gistveroudering, zoals waarom moedercellen verouderen en sterven en wat de eerdere moleculaire gebeurtenissen zijn die de verlies van cellulaire homeostase en uiteindelijk celveroudering en -dood aandrijven? Het grote voordeel van deze techniek is dat we moedercellen kunnen volgen, hun levensduur kunnen volgen en de verschillende moleculaire markers tegelijkertijd kunnen bekijken, zodat we kunnen zoeken naar moleculaire gebeurtenissen die correleren met de levensduur.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in gistveroudering, kan deze ook worden toegepast op andere gebieden, zoals het monitoren van secundaire reacties op deelname die celcontrole gedurende vele generaties vereisen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de fabricage van microfluïdische apparaten, celbelasting, microscoopopstelling veel oefening vereisen om succesvol uit te voeren. Eerdere demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat het moeilijk is om het microfluïdische apparaat goed te laden met gist.
Om te beginnen, maak een siliconenwafer mal voor het apparaat met behulp van standaardtechnieken zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats het met de functiezijde omhoog in een 15 centimeter Petri-schaal. Bevestig de mal op de Petri-schaal met tapes.
Plaats vervolgens een schone weegschaal op een weegschaal en scheurt de weegschaal. Giet 50 gram PDMS-basis in de weegschaal en voeg vervolgens vijf gram PDMS-hardingsmiddel toe. Roer de PDMS-basis en het hardingsmiddel met een wegwerppipet.
Begin vanaf de rand van de weegschaal en beweeg langzaam naar binnen. Roer het mengsel gedurende enkele minuten grondig totdat er kleine luchtbellen in het hele mengsel ontstaan. Giet het mengsel langzaam in de Petri-schaal, zodat het de siliconenwafer mal volledig bedekt.
Plaats de Petri-schaal vervolgens 10 minuten in een vacuüm om alle luchtbellen uit het PDMS-mengsel te verwijderen. Als er nog luchtbellen op het oppervlak van het mengsel achterblijven, gebruik dan een pipet om ze weg te blazen. Bak vervolgens het apparaat gedurende twee uur op 75 graden Celsius.
Wanneer het is afgekoeld tot kamertemperatuur, snijd voorzichtig door de PDMS rond de mal en vervolgens verwijdert u voorzichtig de laag gepolymeriseerd PDMS van de siliconenwafer mal, waarbij u schade aan de constructie van de wafer mal vermijdt. Plaats de PDMS-laag op de werktafel met de patroonzijde naar boven. Knip voorzichtig het afzonderlijke chip uit met een industrieel scheermesje met een enkele rand, waarbij een voldoende marge van de rand van elke afzonderlijke chip wordt behouden om schade aan de constructie te voorkomen.
Met de patroonzijde naar boven, gebruik een ponspen om gaten recht naar beneden te ponsen door de inlaat- en uitlaatcirkels aan elke kant van de kanalen. Controleer elk gat door de naald van de ponspen weer in het gat te steken. Zorg ervoor dat de naald van de andere kant kan komen, wat aangeeft dat er geen blokkades zijn.
Gebruik vervolgens het tape om stofdeeltjes en puin van het bovenoppervlak te verwijderen. Herhaal deze stap minstens drie keer en laat een schoon stuk Scotch tape op de PDMS achter om een stofvrij oppervlak te behouden. Draai vervolgens het apparaat om en herhaal deze procedure aan de andere kant van de PDMS.
Laat ook het laatste stukje tape op deze kant achter. Bereid nu een glazen oppervlak voor de basis van het apparaat. Selecteer het 24 millimeter bij 30 millimeter stuk dekglas met een dikte tussen de 13 en 17 millimeter.
Spuit 70% ethanol op het glas en droog het met stofverwijderaar om het oppervlak te steriliseren. Breng vervolgens het dekglas en PDMS over naar een plastic plaat. Verwijder de Scotch tape van de PDMS en plaats de patroonzijde naar boven in de plaat, zonder contact met het bovenoppervlak.
Breng vervolgens de plaat over in een plasmakamer. Breng een zuurstofplasbehandeling aan op de PDMS en het dekglas om de oppervlakken hydrofiel te maken. Verwijder vervolgens de plaat uit de plasmakamer en verbind voorzichtig de plasmabehandelde oppervlakken van de PDMS in dekglas.
Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de PDMS en het dekglas zijn. Breng vervolgens het apparaat over naar een oven en bak gedurende ten minste twee uur op 75 graden Celsius. Dompel de invoer- en uitvoerslangen een dag vóór de bereiding van de PDMS-chip onder in 70% ethanol-oplossing.
De volgende dag vult u een vijf milliliter spuit met geautoclaveerd water en spoelt u elke buis door de buis op de spuit te plaatsen en de buis met water te spoelen. Herhaal de wasstap minstens drie keer om resterend ethanol te verwijderen. Bekijk vervolgens de PDMS-kanalen onder een optische microscoop.
Gebruik een 10 X objectief om ervoor te zorgen dat de structuren consistent en intact zijn. Stabiliseer de intacte PDMS-chip op het microscoopplatform met behulp van Scotch tape. Bevestig een vijf milliliter spuit geladen met steriel water aan een spuitpomp en steek de corresponderende invoer- en uitvoerslangen in het apparaat.
Stel de stroomsnelheid in op 750 microliter per uur en spoel de chip ongeveer 10 minuten. Kijk naar de kanalen om er zeker van te zijn dat eventuele luchtbellen zijn weggespoeld. Als er na de 10 minuten spoelen nog luchtbellen aanwezig zijn, pas dan handmatig de snelheid aan om de luchtbellen te elimineren.
Breng een milliliter van een voorbereide gistmonster over in twee 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 3.000 keer G. Verwijder het grootste deel van het supernatant uit elke buis en combineer de rest om een 5 milliliter monster te vormen. Met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het maken van gespecialiseerde microfluïdische apparaten om de levensduur en cellulaire fenomenen van enkele gistcellen te meten. Deze methode beoogt om sleutelvragen in het gistverouderingsveld aan te pakken, met name met betrekking tot de verouderingsprocessen van moedercellen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Cellulaire biologie
- Gistveroudering
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van de cellulaire omgeving mogelijk.
- Het begrijpen van gistveroudering kan inzichten bieden in bredere biologische verouderingsprocessen.
- Het volgen van moedercellen en hun moleculaire markers is cruciaal voor dit onderzoek.
- Juiste inlading van gist in microfluïdische apparaten is uitdagend en vereist oefening.
Doel van Studie
- Om de levensduur van enkele gistcellen te meten.
- Om de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot cellulaire veroudering te onderzoeken.
- Om levensduur te correleren met verschillende moleculaire markers.
Gebruikte Methoden
- Fabricage van microfluïdische apparaten.
- Inlading van gistcellen in de apparaten.
- Microscoop opstelling voor observatie.
- Volgen van cellulaire fenomenen en levensduur.
Hoofdresultaten
- Succesvol volgen van moedercellen en hun levensduur.
- Identificatie van moleculaire markers geassocieerd met veroudering.
- Inzichten in het verouderingsproces van gistcellen.
- Mogelijke toepassingen in andere gebieden van cellulair onderzoek.
Conclusies
- De microfluïdische methode biedt waardevolle inzichten in gistveroudering.
- Uitdagingen in apparaatfabricage en celinlading kunnen worden overwonnen met oefening.
- Deze techniek kan mogelijk worden toegepast op andere onderzoeksgebieden die langetermijncelobservatie vereisen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking molecular events to functional aging phenotypes in single cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through real-time correlation of biomarkers with lifespan trajectories.
- Scientific Value: Enhances target confidence by identifying conserved molecular drivers of aging across genetic backgrounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative phenotypic screening across multiple channels.
- Operational Value: Delivers high-resolution imaging and budding frequency readouts that enable reliable compound effect assessment.
- Scientific Value: Facilitates assay scalability by trapping hundreds of cells per channel for longitudinal analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by characterizing cellular aging dynamics with single-cell resolution.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through standardized lifespan and phenotype measurement.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing causal molecular events from correlative changes in aging.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by tracking real-time molecular markers alongside replicative lifespan in mother cells.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved phenotypic outputs such as budding intervals and morphology changes for compound screening.
- Analytics: Generates Kaplan-Meier survival estimates and single-cell lineage data to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing conserved aging phenotypes translatable to higher eukaryotic models.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to multiple yeast strains and environmental conditions for repeated use.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in linking molecular markers to aging outcomes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized device fabrication and cell loading protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective interventions in aging pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with strong phenotypic validation in aging models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and sterile biomolecular handling.
- Depends on access to plasma treatment systems, syringe pumps, and fluorescence microscopy setups.
- Necessitates cross-team standardization for consistent chip preparation and yeast strain handling.
- Involves adaptation considerations when extending to non-yeast model systems due to differences in cell size and adhesion.
- Limited by the need for meticulous bubble removal and surface cleaning to ensure reliable cell trapping and imaging.
