Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Het algemene doel van dit experiment is het maken van een gespecialiseerd microfluidisch apparaat en dit te gebruiken om de levensduur en cellulaire fenotypes van een enkele gistcel te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen in het veld van gistveroudering, zoals waarom moedercellen verouderen en sterven en wat de vroege moleculaire gebeurtenissen zijn die het verlies van cellulaire homeostase en uiteindelijk celveroudering en celdood aansturen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we moedercellen, hun levensduur en diverse moleculaire markers gelijktijdig kunnen volgen, waardoor we kunnen zoeken naar moleculaire gebeurtenissen die correleren met de levensduur.

Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de veroudering van gist, kan zij ook worden toegepast op andere gebieden, zoals het monitoren van secundaire reacties op participatie waarbij celcontrole over vele generaties vereist is. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat de fabricage van microfluïdische apparaten, het laden van cellen en de instelling van de microscoop veel oefening vereisen om succesvol te worden uitgevoerd. Een voorafgaande demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het lastig is om het microfluïdische apparaat correct met gist te laden.

Begin met het vervaardigen van een mal van een siliciumwafer voor het apparaat met behulp van standaardtechnieken zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de mal met de functionele zijde naar boven in een Petri-schaal van 15 centimeter. Bevestig de mal op de Petri-schaal met plakband.

Plaats vervolgens een schoon weegbakje op een balans en tareer de balans. Giet 50 gram PDMS-basis in het weegbakje en voeg vervolgens vijf gram PDMS-uithardingsmiddel toe. Roer de PDMS-basis en het uithardingsmiddel met een wegwerppipet.

Begin bij de rand van het weegbakje en beweeg langzaam naar binnen. Roer het mengsel gedurende enkele minuten grondig totdat er overal in het mengsel kleine belletjes ontstaan. Giet het mengsel langzaam in de Petrischaal, zodat de mal van de siliciumwafer volledig wordt bedekt.

Plaats de Petrischaal vervolgens 10 minuten in een vacuüm om alle luchtbellen uit het PDMS-mengsel te verwijderen. Als er na het verwijderen uit het vacuüm nog bellen op het oppervlak van het mengsel aanwezig zijn, gebruik dan een pipet om deze weg te blazen. Bak het apparaat daarna twee uur lang bij 75 °C.

Wanneer het is afgekoeld tot kamertemperatuur, snijdt u voorzichtig door het PDMS rondom de mal en pelt u vervolgens voorzichtig de laag gepolymeriseerd PDMS van de mal van de siliciumwafer, waarbij u schade aan de constructie van de wafermal vermijdt. Plaats de PDMS-laag op de werkbank met de zijde van het patroon naar boven. Snijd de individuele chip voorzichtig uit met een industrieel enkelzijdig scheermesje, waarbij een voldoende marge vanaf de rand van elke afzonderlijke chip wordt aangehouden om schade aan de constructie te voorkomen.

Gebruik een ponspen om, met de patroonzijde naar boven, gaten recht naar beneden door de inlaat- en uitlaatcirkels aan elke zijde van de kanalen te ponsen. Controleer elk gat door de naald van de ponspen opnieuw in het gat te steken. Zorg ervoor dat de naald aan de andere kant naar buiten komt, wat aangeeft dat er geen blokkades zijn.

Gebruik vervolgens de tape om stofdeeltjes en vuil van het bovenoppervlak te verwijderen. Herhaal deze stap ten minste drie keer en laat een schoon stukje Scotch-tape op de PDMS achter om het oppervlak stofvrij te houden. Draai het apparaat vervolgens om en herhaal deze procedure aan de tegenovergestelde zijde van de PDMS.

Laat het laatste stukje plakband aan deze kant ook zitten. Bereid nu een glazen oppervlak voor de basis van het apparaat voor. Selecteer het dekglasstuk van 24 millimeter bij 30 millimeter met een dikte tussen 13 en 17 millimeter.

Spray 70% ethanol op het glas en droog het af met een stofverwijderaar om het oppervlak te steriliseren. Breng vervolgens het dekglas en de PDMS over naar een plastic plaat. Verwijder de Scotch tape van de PDMS en plaats deze met de patroonzijde naar boven in de plaat, zonder het bovenoppervlak te raken.

Plaats de plaat vervolgens in een plasmakamer. Pas een zuurstofplasmabehandeling toe op de PDMS en het dekglas om de oppervlakken hydrofiel te maken. Haal de plaat daarna uit de plasmakamer en verbind voorzichtig de plasmabehandelde oppervlakken van de PDMS en het dekglas.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de PDMS en het dekglas zitten. Plaats het apparaat ten slotte in een oven en bak dit gedurende ten minste twee uur bij 75 °C. Dompel de in- en uitlaatslangen één dag vóór de bereiding van de PDMS-chip onder in een 70% ethanoloplossing.

Vul de volgende dag een spuit van vijf milliliter met geautoclaveerd water en was elke buis door de buis op de spuit te plaatsen en deze met water door te spoelen. Herhaal de wasstap ten minste drie keer om residuen van ethanol te verwijderen. Inspecteer vervolgens de PDMS-kanalen onder een optische microscoop.

Controleer met een 10 X objectief of de structuren consistent en intact zijn. Stabiliseer de intacte PDMS-chip op het microscoopplatform met behulp van plakband. Bevestig een spuit van vijf milliliter gevuld met steriel water aan een spuitpomp en sluit de overeenkomstige inlaat- en uitlaatslangen aan op het apparaat.

Stel de stroomsnelheid in op 750 µL per uur en spoel de chip gedurende ongeveer 10 minuten. Houd de kanalen in de gaten om er zeker van te zijn dat eventuele luchtbellen worden weggespoeld. Als er na het spoelen van 10 minuten nog bellen aanwezig zijn, pas dan de snelheid handmatig aan om de bellen te verwijderen.

Overbreng één milliliter van een bereid gistmonster in twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter en centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 3.000 ×g. Verwijder het grootste deel van het supernatant uit elk buisje en voeg de rest samen om een monster van 5 milliliter te vormen. Nu het gistmonster gereed is, verwijdert u de toevoerbuisjes uit de PDMS-chip. Keer de spuitpomp handmatig om om een kleine luchtbel van één tot twee centimeter lengte op te zuigen in elk toevoerbuisje, en zuig vervolgens de celculturen op.

Plaats vervolgens de inputbuis terug in de PDMS-chip en start de pomp opnieuw om de cellen te laden met een snelheid van 750 microliters per uur. Laat de spuitenpomp 10 minuten aanstaan en controleer daarna de voortgang van het laden van de cellen onder de microscoop. Bij een succesvolle lading zullen cellen worden vastgehouden onder meer dan 60% van de suspend pillar.

Om de gistcellen in stand te houden, vervangt u de oplossing in de spuit door een voedingsoplossing en stelt u de snelheid in op 400 microliters per uur. Het fenotype van de levensduur van gist kan worden bepaald door het aantal knoppen te tellen dat door elke gevangen moedercel is geproduceerd en de Kaplan-Meier-schatter te berekenen. Met dit protocol vangt het apparaat regelmatig verse dochtercellen op die zijn afgeknopt van de reeds gevangen cellen.

Deze cellen veranderen vervolgens in nieuwe moedercellen die geïdentificeerd kunnen worden met behulp van software voor downstream beeldanalyse. Deze nieuwe moedercellen zorgen voor een nauwkeurigere meting van de levensduur. In dit experiment was de gemiddelde levensduur van de nieuwe moedercellen iets langer, met ongeveer twee generaties.

Naast het aantal knoppen kan het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende knoppingsgebeurtenissen uit de beeldgegevens worden geëxtraheerd. De knopping vertraagt dramatisch tegen het einde van hun levensduur, wat wijst op de ongezonde toestand van deze verouderde cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zowel een vers gemaakte chip te gebruiken om bellen te helpen voorkomen, als de celconcentratie te verhogen om de efficiëntie van het celladen te verbeteren indien nodig.

Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van gistveroudering om de vroege moleculaire veranderingen te onderzoeken die causaal zijn voor het verouderingsfenotype. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dit microfluïdische apparaat maakt en hoe u het gebruikt om de levensduur en cellulaire fenotypen in individuele cellen te meten.