Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie
May 5th, 2017
Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.
Het algemene doel van deze spectrale cytometrietechniek is om verschillende fluorochromen te onderscheiden met behulp van hun volledige emissiespectra. Bovendien maakt dit protocol de implementatie van autofluorescentie mogelijk als een onafhankelijke parameter, waardoor een goede analyse mogelijk is van cellen geïsoleerd uit vaste organen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van immunologie en de ontwikkeling van stamcelbiologie, zoals hoe zeldzame celpopulaties te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de unieke capaciteit om tegelijkertijd een groot aantal parameters te analyseren en de autofluorescentie van vast weefsel te beheren. Hoewel deze methode wordt gebruikt voor de bereiding van een enkele celsuspensie afgeleid van darm en hart, kan deze ook worden toegepast op andere organen, zoals long, skeletspier, lever, vet en nier. Om te beginnen isoleer en was de dunne darm van een volwassen muis.
Leg vervolgens het weefsel op een papieren handdoek en verwijder voorzichtig met scherpe schaar de Peyer's patches. Open de darm door hem longitudinaal te snijden en verdeel hem in stukken van één centimeter. Breng vervolgens het weefsel over in een beker gevuld met 30 milliliter HBSS aangevuld met tien procent FCS en incubeer het gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met constant roeren.
Zodra de incubatie is voltooid, breng de celsuspensie over in een 15 milliliter plastic buis en vortex deze gedurende vijf minuten krachtig. Incubeer vervolgens de suspensie gedurende tien minuten op ijs om grote, niet-gedissocieerde fragmenten te laten sedimenteren. Transfer daarna het supernatant naar een nieuwe buis en centrifugeer de cellen gedurende zeven minuten bij 120 keer G.
Nadat de pellet is gevormd, suspenderen we de cellen in tien milliliter één procent FCS in HBSS en tellen ze met behulp van een Neubauer kamer. Voorafgaand aan het kleuren van de cellen, breng één maal tien tot de zesde intestinale cellen over naar een vijf milliliter buis om een negatieve controle voor te bereiden. Om een monster voor te bereiden, voeg één maal tien tot de zesde van intestinale cellen toe, gevolgd door twee milliliter HBSS met één procent FCS in een nieuwe vijf milliliter buis en centrifugeer de suspensie bij 120 keer G, bij vier graden Celsius, gedurende vijf minuten.
Na het weggooien van het supernatant, suspenderen we de cellen in 50 microliter van de antilichaamoplossing. Wikkel de buis in aluminiumfolie en incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de incubatie is voltooid, voeg twee milliliter één procent FCS in HBSS toe aan het monster en centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 120 keer G, vier graden Celsius.
Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet in 200 microliter van een 0,5 microgram per milliliter propidiumjodideoplossing. Nadat een muizenembryo is onthoofd, week je lichaam in een petrischaal, bekleed met een vooraf bevochtigde papieren handdoek, en gevuld met 50 milliliter één procent FCS in HBSS. Onder een stereomicroscoop maak je een incisie aan de rechterkant van de borst van het embryo en open je voorzichtig de thorax, waarbij je het hart niet beschadigt.
Grijp de grote bloedvaten en trek het hart dat verbonden is met de longen en de thymus eruit. Breng de organen over in een 35 milliliter petrischaal gevuld met twee milliliter één procent FCS in HBSS. Isoleer vervolgens het hart van de omliggende organen en bindweefsel.
Na het wassen van het hart, week het in één milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing en snipper het orgaan in stukken van één kubieke millimeter onder een stereomicroscoop met behulp van fijne pincetten en een scalpel. Voeg een extra milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe en breng het versnipperde weefsel over in een afgesloten vijf milliliter buis. Incubeer het monster horizontaal gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Zodra de incubatie is voltooid, homogeniseer het weefsel door repetitieve pipettering van de suspensie met een P1000 pipet. Zet vervolgens de monsters, verticaal gepositioneerd, opzij totdat de fragmenten van het onverteerde weefsel zijn gezakt. Breng het supernatant over in een 50 milliliter buis.
Voeg twee milliliter tien procent FCS in HBSS toe en bewaar de geïsoleerde cellen op ijs. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe aan de vijf milliliter buis die het onverteerde weefselsediment bevat, en blijf het weefsel verteren zoals eerder is aangegeven totdat er geen resterend weefsel meer is waargenomen. Centrifugeer de verkregen celsuspensie gedurende tien minuten bij 120 keer G.
Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer de cellen in één milliliter één procent FCS in HBSS, vrij van calcium- en magnesiumkationen. Om de hartcellen te kleuren, breng 200 microliter van de celsuspensie over in putjes van een rondbodem 96-putjesplaat. Centrifugeer de plaat gedurende één minuut bij 480 keer G en gooi het supernatant weg.
Resuspendeer vervolgens de hartcellen in 100 microliter van de antilichaamoplossing. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de incubatie is voltooid, was de hartcellen met 200 microliter één procent FCS in calcium- en magnesiumvrij HBSS en centrifugeer de suspensie gedurende één minuut bij 480 keer G.
Resuspendeer vervolgens de cellen in 200 microliter één procent FCS in HBSS, vrij van calcium- en magnesiumionen, en breng de suspensie over in een vijf milliliter buis vooraf gevuld met 200 microliter één procent FCS in calcium- en magnesiumvrij HBSS. Voeg tenslotte 400 microliter één procent FCS in HBSS toe, vrij van calcium- en magnesiumkationen, met 0,5 microgram per milliliter propidiumjodide en filter de celsuspensie door een 70 micro nylon gaas. Om de cellen te visualiseren, laad je het gekleurde monster naar een flowcytometer en klik je op preview, en neem vervolgens maximaal twee maal tien tot de zesde gebeurtenissen in het monster op door te klikken op acquire.
In het analysetabblad open je het kleurpalletvenster en registreer je alle bestudeerde parameters door de fluorochroom samen met de bijbehorende marker
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt spectrale cytometrie, een nieuwe techniek in flowcytometrie die de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen te onderscheiden. Deze methode maakt de onafhankelijke behandeling van autofluorescentie mogelijk, waardoor nauwkeurige analyse van cellen uit vaste organen mogelijk wordt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Flow Cytometrie
- Immunologie
- Stamceldonsbiologie
Achtergrond
- Spectrale cytometrie onderscheidt fluorochromen aan de hand van hun volledige emissiespectra.
- Het maakt de analyse van autofluorescentie mogelijk als onafhankelijke parameter.
- Deze techniek is toepasbaar op verschillende vaste organen.
- Het helpt bij het identificeren van zeldzame celpopulaties.
Doel van het onderzoek
- Om de analyse van cellen geïsoleerd uit vaste organen te verbeteren.
- Om de identificatie van verschillende fluorochromen te verbeteren.
- Om het onderzoek naar complexe biologische vragen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isolatie en wassen van de dunne darm van volwassen muizen.
- Bereiding van enkele celsuspensies uit verschillende organen.
- Toepassing van spectrale cytometrietechnieken.
- Analyse van autofluorescentie in vast weefsel.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere parameters mogelijk.
- Het beheerst effectief autofluorescentie in vast weefsel.
- Toepasbaar op organen zoals long, lever en nier.
- Ondersteunt onderzoek in immunologie en stamceldonsbiologie.
Conclusies
- Spectrale cytometrie vertegenwoordigt een significante vooruitgang in flowcytometrie.
- Het biedt een robuuste methode voor het analyseren van complexe celpopulaties.
- Deze techniek kan ons begrip van verschillende biologische processen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Spectral flow cytometry addresses a critical bottleneck in immunology and stem cell research by enabling high-dimensional analysis of cell suspensions from solid tissues without compensation requirements. This capability improves detection of rare populations and reduces misclassification due to autofluorescence, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence when interrogating complex biological systems such as intestinal and cardiac immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving fluorochrome overlap and autofluorescence in solid organ digests.
- Operational Value: Supports functional target validation through 21-parameter profiling of immune and stromal compartments.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by increasing confidence in target engagement and pathway modulation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated single-cell suspensions from intestine, heart, lung, liver, and kidney for downstream assay integration.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative readouts by treating autofluorescence as a measurable parameter rather than noise.
- Strategic Value: Enables scalable compound screening workflows with reduced batch variability in solid tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving native tissue phenotypes during enzymatic dissociation and staining.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation through standardized cell preparation and acquisition protocols.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by clarifying mechanistic ambiguity in complex tissues.
Pipeline & Workflow Integration
Spectral flow cytometry fits within the discovery continuum from hypothesis testing in primary tissues to lead identification via immune profiling, particularly when conventional flow cytometry fails due to spectral overlap or high autofluorescence.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking by enabling high-resolution phenotyping of rare cell subsets in solid organs.
- Screening: Provides assay readiness through standardized isolation of viable cells from intestine and heart, with applicability to other organs.
- Analytics: Generates multi-parametric data without compensation, allowing direct comparison of staining conditions and marker expression.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving tissue-derived cellular states for functional follow-up.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunophenotyping across multiple disease models and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving autofluorescence-confounded populations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through defined dissociation and staining workflows.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving early detection of off-target immune engagement.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on high-fidelity immune profiling from clinically relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, enzymatic tissue dissociation, and multi-panel antibody staining.
- Depends on access to a spectral flow cytometer with unmixing software and appropriate filtration settings.
- Necessitates cross-team standardization of tissue preparation protocols to ensure viability and consistency.
- Involves adaptation considerations when extending the method to fibrous or fatty tissues such as lung or adipose.
- Includes practical limitations related to tissue-specific autofluorescence levels and enzymatic digestion optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:50
Conclusion
8:44
Results: Spectral Cytometry-based Characterization of Embryonic Cardiac Cells
1:07
Intestinal Cells Isolation
2:20
Cell Staining
3:26
Preparation of Cell Suspension from Embryonic Mouse Heart
5:31
Cardiac Cell Staining
6:54
Data Acquisition and Analysis
