Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Het algemene doel van deze spectrale cytometrie-techniek is om verschillende fluorochromen te onderscheiden aan de hand van hun volledige emissiespectra. Bovendien maakt dit protocol de implementatie van autofluorescentie als een onafhankelijke parameter mogelijk, wat een correcte analyse van cellen die uit solide organen zijn geïsoleerd, toestaat. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van de immunologie en de ontwikkeling van de stamcelbiologie, zoals het identificeren van zeldzame celpopulaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het unieke vermogen om gelijktijdig een groot aantal parameters te analyseren en de autofluorescentie van solide weefsels te beheersen. Hoewel deze methode wordt gebruikt voor de bereiding van een single-cell suspensie afgeleid van de darm en het hart, kan deze ook worden toegepast op andere organen, zoals de longen, skeletspieren, lever, vetweefsel en nieren. Begin met het isoleren en wassen van de dunne darm van een volwassen muis.

Plaats het weefsel vervolgens op een papieren handdoek en verwijder voorzichtig de Peyerse platen met een scherpe schaar. Open de darm door deze in de lengte door te snijden en verdeel deze in stukken van één centimeter. Breng het weefsel vervolgens over naar een bekerglas gevuld met 30 milliliters HBSS aangevuld met tien procent FCS, en incubeer dit 30 minuten bij 37 graden Celsius onder constant roeren.

Zodra de incubatie is voltooid, brengt u de celsuspensie over naar een plastic buis van 15 milliliter en vortexen deze krachtig gedurende vijf minuten. Incubeer de suspensie vervolgens tien minuten op ijs om grote, niet-gedissocieerde fragmenten te laten bezinken. Breng daarna het supernatant over naar een nieuwe buis en centrifugeer de cellen bij 120 ×g gedurende zeven minuten.

Zodra de cellen zijn gepellet, resuspenderen we deze in tien milliliter één procent FCS in HBSS en tellen we ze met een Neubauer-telkamer. Voorafgaand aan de celkleuring worden 1 x 10⁶ darmcellen overgebracht naar een buis van vijf milliliter om een negatieve controle voor te bereiden. Om een monster voor te bereiden, voegen we 1 x 10⁶ darmcellen, gevolgd door twee milliliter HBSS met één procent FCS, toe aan een nieuwe buis van vijf milliliter en centrifugeren we de suspensie bij 120 ×g, bij vier graden Celsius, gedurende vijf minuten.

Na het weggooien van het supernatant resuspenderen we de cellen in 50 µL van de antilichaamoplossing. Wikkel de buis in aluminiumfolie en incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C. Zodra de incubatie is voltooid, voegen we 2 mL 1% FCS in HBSS toe aan het monster en centrifugeren we dit bij 120 ×g, 4 °C, gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL propidiumjodide-oplossing van 0,5 µg/mL. Nadat een muizenembryo is gedecapiteerd, wordt het lichaam geweekt in een petrischaal, bekleed met een vochtig papieren handdoekje en gevuld met 50 mL 1% FCS in HBSS. Maak onder een stereomicroscoop een incisie aan de rechterkant van de borstkas van het embryo en open voorzichtig de thorax, waarbij beschadiging van het hart wordt vermeden.

Pak de grote vaten vast en trek het hart, samen met de longen en de thymus, naar buiten. Breng de organen over naar een petrischaal van 35 milliliter gevuld met twee milliliter één procent FCS in HBSS. Isoleer vervolgens het hart van de omliggende organen en het bindweefsel.

Nadat het hart is gewassen, wordt het ondergedompeld in één milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing en wordt het orgaan met een fijne pincet en een scalpel onder een stereomicroscoop fijngehakt in stukjes van één kubieke millimeter. Voeg nog één milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe en overbreng het versnipperde weefsel naar een afgesloten buis van vijf milliliter. Incubeer het monster in horizontale positie bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Zodra de incubatie is voltooid, homogeniseert u het weefsel door de suspensie herhaaldelijk te pipetteren met een P1000-pipet. Zet de monsters vervolgens verticaal weg totdat de fragmenten van het onverteerde weefsel bezinken. Draag het supernatant over naar een buis van 50 milliliter.

Voeg twee milliliter tien procent FCS in HBSS toe en bewaar de geïsoleerde cellen op ijs. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe aan de buis van vijf milliliter met het onverteerde weefselresidu en ga verder met het verteren van het weefsel zoals eerder beschreven, totdat er geen resterend weefsel meer waarneembaar is. Centrifugeer de verkregen celsuspensie bij 120 ×g gedurende tien minuten.

Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL van 1% FCS in HBSS, vrij van calcium- en magnesiumcationen. Om de hartcellen te kleuren, brengt u 200 µL van de celsuspensie over in de putjes van een 96-wells plaat met ronde bodem. Centrifugeer de plaat bij 480 ×g gedurende één minuut en verwijder het supernatant.

Resuspendeer vervolgens de hartcellen in 100 µL van de antilichaamoplossing. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer deze 20 minuten bij 4 °C. Zodra de incubatie is voltooid, worden de hartcellen gewassen met 200 µL van 1% FCS in calcium- en magnesiumvrije HBSS, waarna de suspensie gedurende één minuut wordt gecentrifugeerd bij 480 ×g.

Resuspendeer vervolgens de cellen in 200 µL van 1% FCS in HBSS zonder calcium- en magnesiumionen, en breng de suspensie over naar een buis van 5 mL die vooraf is gevuld met 200 µL van 1% FCS in calcium- en magnesiumvrij HBSS. Voeg ten slotte 400 µL toe van 1% FCS in HBSS zonder calcium- en magnesiumkationen, bevattend 0,5 µg/mL propidiumjodide, en filtreer de celsuspensie door een nylon gaas van 70 µm. Om de cellen te visualiseren, laadt u het gekleurde monster in een flowcytometer en klikt u op preview, om vervolgens tot 2 × 10⁶ events in het monster vast te leggen door op acquire te klikken.

Open in het analysetabblad het venster voor het kleurenpalet en registreer alle bestudeerde parameters door het fluorochroom samen met de bijbehorende marker toe te voegen. Zorg ervoor dat autofluorescentie- en levensvatbaarheidsparameters zijn opgenomen. Analyseer in het controlevenster, binnen de buislijst, de eerste enkelvoudig gekleurde monster met compensatiekraaltjes.

Klik vervolgens in het werkblad op de polygoon-ontwerptool en gate de bead-populatie in de FSC SSC-plot. Dubbelklik op de gate om een dochterplot van de gegatete beads te maken. Gate vervolgens de positieve en negatieve beads afzonderlijk.

Verifieer de geselecteerde dochterpopulatie door opeenvolgende gating en eliminatie van uitschieters in elke positieve en negatieve fractie. Upload vervolgens de negatieve en positieve gates in het un-mixing venster. Selecteer daarna het ongesteinde celmonster in de buislijst en ontwerp aparte gates voor autofluorescerende en niet-autofluorescerende cellen.

Zodra de negatieve en positieve gates voor alle parameters zijn gedefinieerd, inclusief autofluorescentie en levensvatbaarheid, klikt u op berekenen. Pas vervolgens un-mixing toe op de geanalyseerde monsters. Om de gegevens te analyseren, gate u de cellen in een plot van SSC versus FSC en sluit u met propidiumjodide gekleurde dode cellen uit.

Bepaal ten slotte de gates voor alle populaties van belang. Hier worden de resultaten gepresenteerd van flowcytometrie- en spectrale cytometrie-analyses van de cellen die uit het foetale hart zijn geïsoleerd en gekleurd met anti-TER119, anti-CD45 en anti-Sca-1 antilichamen. Een subset van autofluorescerende cellen werd gedetecteerd door twee conventionele cytometers, terwijl deze cellen bij spectrale cytometrie niet als autofluorescerend werden gedefinieerd en waren opgenomen in de CD45 TER119 negatieve populatie.

De cellen die met conventionele flowcytometrie als autofluorescerend werden geïdentificeerd, maar niet als CD31-positieve cellen, werden vervolgens geanalyseerd op de expressie van transcripten die specifiek zijn voor cardiomyocyten. Hoge niveaus van cardiaal troponine en transcripten die kenmerkend zijn voor atriale myocyten werden aangetroffen in de populatie autofluorescerende cellen, wat bevestigt dat een groot subset van cardiomyocyten wordt gemist bij conventionele flowcytometrie. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer acht uur worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle stappen op ijs en tijdig moeten worden uitgevoerd om te garanderen dat de cellen levensvatbaar blijven. Na deze procedure kunnen intracellulaire eiwitten en analyses van aanvullende oppervlaktemarkers worden uitgevoerd om vragen over specifieke moleculaire pathways te beantwoorden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immunologie en ontwikkelings- of stamcelbiologie om zeldzame populaties uit verschillende organen te onderzoeken en te isoleren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cellen uit cellulaire weefsels kunnen worden geïsoleerd en gekleurd, en hoe oppervlaktemarkerexpressie kan worden geanalyseerd via spectrale flowcytometrie om beperkingen als gevolg van autofluorescentie van cellen te overwinnen. Vergeet niet dat werken met propidiumjodide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van PBM, tijdens het uitvoeren van deze procedure.