Name: Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer mitochondriale functie detecteren in HepG2-hepatocyten blootgesteld aan organochloorpesticiden zoals beta-HCH. Deze methode meet ATP-niveaus, zuurstofverbruik en membraanpotentieel voor toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); het Uitstaande Jeugdfonds van de provincie Jiangsu (SBK2014010296); het onderzoeksproject van het Chinese ministerie van Onderwijs (213015A); de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), het vlaggenschip van de belangrijkste ontwikkeling van jiangsu instellingen voor hoger onderwijs; en het Open Project Program van het State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).

Alle experimenten en de experimentprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften en goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie van de Nanjing Medical University.
1. Mitochondriale ultrastructuur door TEM
<ol><li>Het verzamelen van HepG2 cellen<ol>
<li>Seed HepG2 cellen in 100 mm gerechten. Bewaar bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mLEP buis.</li>
		<li>Centrifuge op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Verzamel 4-6 x 105 HepG2 cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 1 mL glutaraldehyde (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) toe met pipetten en incubeer bij 4°C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Voeg toe en was in 4 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer (met Na2HPO4,KH2PO4, NaCl en KCl, pH 7.4), 15 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer met pipetten eruit.</li>
	<li>Voeg 200 μm van 1% osmium (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) en incubbate bij 4 °C gedurende 2 uur toe aan zwart monster. Let op: Osmium is zeer giftige en vluchtige stof. Het moet zorgvuldig worden bediend in de medicijnkast.</li>
	<li>Voeg toe en was in 2 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer, 5 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer eruit.</li>
	<li>Vlek in 2% uranylacetaatoplossing (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water en azijnzuur) in 1,5 mL EP buis gedurende 2 uur.</li>
	<li>Dehydraat en onderdompel door 50% aceton, 70% aceton, 90% aceton (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water), 2 veranderingen van absolute aceton, 15 min per stuk.</li>
	<li>Penetreer in 2 druppels aceton (100%)/inbeddingsmiddel (1:1) voor 1,5 uur bij RT. Epon812 inbedding agent, het recept is als volgt: A: Epon812, 62 mL en DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL en MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, in de winter), A:B=1:9 (v:v, in de zomer). Inbedding in het inbedden van mallen (Zachte plastic plaat met geruit rooster).</li>
	<li>Incubate achtereenvolgens bij 37 °C voor 12 uur, 45 °C voor 12 uur en vervolgens 60 °C voor 48 uur.</li>
	<li>Bereid ultradunne secties (het grootste gebied mag niet meer dan 0,5 mm × 0,3 mm) voor door ultradunne secties machine en TEM (2 μm en 500 nm).</li>
</ol>2. Mitochondriale fluorescentieintensiteitsdetectie
<ol><li>Zaad 2x 104 HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.</li>
	<li>Voeg watervrije DMSO toe om een uiteindelijke concentratie van 1 mM mitochondriale groene fluorescerende sonde te formuleren.</li>
	<li>Voeg 1 mL mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing (uiteindelijke concentratie: 200 nM) toe aan elke put van 6-putplaten, incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten.</li>
	<li>Verwijder de mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing en voeg vers bereid celkweekmedium (DMEM) toe bij 37 °C voorafgaand aan de beeldvorming.</li>
	<li>Observeer mitochondriale groene fluorescentie door een fluorescentiemicroscoop (10x). De maximale excitatiegolflengte bij detectie is 490 nm en de maximale emissiegolflengte is 516 nm.</li>
</ol>3. Test van de cellulaire ATP-niveaus
<ol><li>Seed HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.</li>
	<li>Voeg 200 μL lysebuffers van de luciferase-luciferin ATP-testkit toe aan elke put van 6-putplaten. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verzamel de supernatant met pipetten in nieuwe buizen.</li>
	<li>Verdun het ATP-detectiereagens met de ATP-verdunning bij een verhouding van 1: 5, als ATP-detectiebuffer.</li>
	<li>Standaardcurvebepaling voorbereiden: verdun de ATP-standaardoplossing van 0,5 mM tot 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM door ATP lysis-buffers.</li>
	<li>Voeg 100 μL ATP-detectiebuffer toe in een 96-putplaat gedurende 5 minuten bij RT en voeg 100 μL supernatant van de cel toe, detecteren door een luminometer (chemiluminescentiedetector). Bereken atp-concentratie (nmol/L) hoewel de standaardcurve.</li>
	<li>Detecteer de eiwitconcentratie door een BCA Protein Assay Kit met multimode reader.<ol>
<li>Bereid de standaardcurvebepaling voor: verdun de 5 mg/mL eiwitstandaardoplossing tot 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 mg/mL met dubbel gedestilleerd water.</li>
		<li>Voeg 1 μL supernatant van de cel in een 96-put plaat en voeg 19 μL van dubbel gedestilleerd water.</li>
		<li>Voeg 200 μL BCA-detectieoplossingen toe voor elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Detecteer de OD-waarde (optische dichtheid) door een multimodelezer met 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie (mg/mL) hoewel de standaardcurve.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrigeer het ATP-gehalte per mg eiwitconcentratie (eenheid: ATP-concentratie/eiwitconcentratie, nmol/mg).</li>
</ol>4. Mitochondriale membraan potentieel (MMP) beoordeling door JC-1
<ol><li>Verzamel HepG2 cellen gezaaid in 6-well platen. Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mL EP buis, centrifuge op 1000 x g gedurende 3 min, gooi de supernatant en cellen te verzamelen.</li>
	<li>Voeg 50 μL JC-1 (200X) toe aan 8 mL gedestilleerd water aan vortex en meng. Voeg 2 mL VAN JC-1 (5X) kleuring verven buffer als JC-1 detectie oplossing.</li>
	<li>Incubeercellen met een mengsel van 0,5 mL celkweekmedium en 0,5 mL JC-1 detectieoplossing voor 20 min bij 37 °C.</li>
	<li>Centrifuge bij 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Spoel in 2 veranderingen van 1 mL van JC-1 (1X) verven buffer, centrifuge op 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. En gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Stel cellen op in 0,5 mL van JC-1 (1X) verven buffer, analyseren via stroom cytometrie om groene en rode fluorescentie te detecteren. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 490 nm en het emissielicht op 530 nm. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 525 nm en het emissielicht op 590 nm.</li>
</ol>5. Metingen van het zuurstofverbruik (OCR)
<ol><li>Seed HepG2 cellen in celcultuur microplaten van 96-goed bij een dichtheid van 4500 cellen/100 μL per put. Zorg ervoor dat cellen bedekt met elke put na 24 uur.</li>
	<li>Voeg volgens eerdere literatuur13het juiste volume van de bereide reagentia toe aan de juiste injectiepoort . Poort A: 25 μL 1 μM oligomycine (ATP Coupler); Poort B: 25 μL 0,75 μM FCCP (Electronic Throttle Control, ETC Accelerator); Poort C: 25 μL 0,5 van μM antimycine A/rotenone (mitochondriale remmer A en mitochondriale remmer B).</li>
	<li>Bewaar de cartridge in een 37 °C incubator zonder CO2 tot het gebruiksklaar is.</li>
	<li>Maak een middelgrote verandering van de celplaat door het verwijderen van het lopende medium van elke put en toe te voegen aan de nieuwe DMEM. Het uiteindelijke volume voor elke put is 180 μL.</li>
	<li>Bewaar de celplaat in een couveuse van 37 °C zonder CO2 gedurende 1 uur voor de test.</li>
	<li>Neem OCR automatisch op via software.<ol>
<li>Open de OCR-software.</li>
		<li>Kies Cell Mito Stress Test Kit in de vervolgkeuzelijst Apps.</li>
		<li>Klik op de knop App starten.</li>
		<li>Klik op de knop Stresstest uitvoeren. Het scherm Celstresstestinstelling wordt weergegeven.</li>
		<li>Voert de volgende stappen uit:<ol>
<li>Voer het aantal cellen per put in de box Cell seeding # in.</li>
			<li>Voer de gemiddelde OCR in het vak Gemiddelde basale OCR in.</li>
			<li>Voer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk reagens in en injecteer de reagentia. OPMERKING: De gemiddelde basale OCR-waarde voor de cel moet zijn gedetecteerd voordat de optimalisatietest wordt uitgevoerd bij het optimaliseren voor celzaaiconcentratie.</li>
			<li>Klik op de knop Volgende. Het scherm groepsinfo wordt weergegeven.</li>
			<li>Wijs een groep toe aan de niet-toegewezen putten door een kleur te kiezen en een naam te geven en vervolgens op de juiste putten te klikken. OPMERKING: De verschillende groepen worden gedefinieerd als verschillende behandelingen voorafgaand aan het uitvoeren van de Cell Mito Stress Test. Alle putten van microplaten krijgen dezelfde reagens injecties wanneer de stresstest wordt uitgevoerd.</li>
			<li>Klik op de knop Volgende. Het scherm StressTest Injection Layout wordt weergegeven.</li>
			<li>Klik op Start. De Stress Test wordt nu uitgevoerd op de Analyzer. Wanneer de run voorbij is, volg de punt s in de software, verwijder en gooi de cartridge en de celplaat.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79(2015).</li>
<li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li>
<li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+persistent+organic+pollutants%3A+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li>
<li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hydrogen+affects+body+composition%2C+metabolic+profiles%2C+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li>
<li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified%2C+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li>
<li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+%28IDH1%29+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li>
<li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes%3A+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339(2017).</li>
<li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells%3A+Implications+for+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li>
<li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853(2017).</li>
<li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5216043/">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295(2016).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li>
<li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li>
<li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinase+2+%28GRK2%29+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li>
<li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319(2017).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li>
<li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li>
<li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li>
<li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve OC...

De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP's) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden zoals veroudering, obesitas, diabetes, cardiovasculaire functie, kanker en veiligheidstoxiciteit4,,5,,6,7. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het beoordelen van mitochondriale disfunctie veroorzaakt door OCPs.
We stelden HepG2-cellen bloot aan β-hexachloormohexaan (β-HCH), een representatieve OCP's, voor 24 uur bij een dosis die gelijk is aan interne blootstelling van de mens. Ten eerste werd TEM toegepast om de ultrastructuur van hepatocyten te observeren, zoals kernen, mitochondriën en endoplasmatisch reticulum8. Vergeleken met gewone microscopen maakt TEM het mogelijk om de 2D en 3D ultrastructuur van cellen en celcomponenten (cellijnen of weefsel), de morfologie, chemische samenstelling en functie van natuurlijke of kunstmatige materialen die een centrale rol spelen in de moderne wetenschap en technologie te verkennen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentie intensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP)in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. Mito-tracker groen is een mitochondriën groene fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor levende cel mitochondriaal-specifieke fluorescerende vlekken. De mitochondriën in hepatocyten werden gekleurd door mito-tracker groene oplossing en mitochondriale fluorescentie intensiteit, aantal en patroon werden waargenomen met een confocale microscopie9. Mitochondriale groene fluorescerende sonde kan worden gebruikt om levende cellen te bevlekken. Vergeleken met rhodamine 123 of JC-1 is mitochondriaal groene fluorescerende sonde niet afhankelijk van mitochondriaal membraanpotentieel voor mitochondriale vlekken. ATP-niveaus werden bepaald door een luciferase-luciferin kit en genormaliseerd door eiwitconcentratie. ATP-testkit kan worden gebruikt om ATP-niveaus te detecteren in gemeenschappelijke oplossingen, cellen of weefsels. Deze kit is gebaseerd op firefly luciferase gekatalyseerd door fluoresceïne om fluorescentie te genereren, wanneer ATP nodig is om energie te leveren. Wanneer de vuurvlieg luciferase en fluoresceïne buitensporig zijn, is de generatie van fluorescentie evenredig met de concentratie van ATP. Daarnaast is deze kit speciaal ontworpen om de chemiluminescentie van ATP te optimaliseren. ATP, als de belangrijkste energiemoleculen, speelt een belangrijke rol in de verschillende fysiologische of pathologische processen van cellen. Veranderingen in ATP-niveaus kunnen defecten in de celfunctie weerspiegelen, met name de productie van mitochondriale energie. Meestal onder apoptose, necrose of in een giftige toestand, cellulaire ATP niveaus verminderd 10. MMP's test kit met JC-1 is een kit die JC-1 gebruikt als een fluorescerende sonde om cellen, weefsels of gezuiverde MMP's snel en gevoelig te detecteren. Het kan worden gebruikt voor vroegtijdige opsporing van apoptose. De kationische kleurstof JC-1 is een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de MMP die kan worden geanalyseerd onder stroom cytometrie aangegeven door veranderingen van groene en rode fluorescentie verhouding te detecteren. Wanneer het MMP hoog is, wordt JC-1 samengevoegd in de matrix van de mitochondriën tot een polymeer (J-aggregaten), dat rode fluorescentie produceert. Wanneer het MMP laag is, kan JC-1 zich niet ophopen en vormt monomeer die groene fluorescentieproduceert 11. Dus de verhouding van rode en groene fluorescentie kan het niveau van MMP weerspiegelen. De OCR van cellen is een cruciale indicator van de normale cellulaire functie12. Het wordt beschouwd als een parameter voor onderzoek mitochondriale functie. Cell mito stress test kit biedt een stabiele methode voor het analyseren van de belangrijkste parameters van mitochondriale functie. De kit biedt kwaliteitscontrole en voorspellende reagentia, evenals een standaardmethode voor het uitvoeren van cel mitochondriale stresstest. Het kan worden gebruikt om alle celtypen te detecteren, inclusief primaire cellen, cellijnen, zwevende cellen, en ook voor eilandjes, aaltjes, gisten en geïsoleerde mitochondriën.
OCR-meting kan waardevol inzicht geven in de fysiologische status of veranderingen van cellen. Het werd bepaald met een extracellulaire flux analyzer om ademhaling baseline, proton lek, maximale luchtwegen, ATP omzet en reserve capaciteit te detecteren. Kortom, na basismetingen van OCR werd OCR gedetecteerd nadat het achtereenvolgens had toegevoegd aan oligomycine (ATP Coupler), FCCP (mitochondriale oxidatieve fosforylatie uncoupler) en antimycine A/rotenone (een remmer van zuurstofverbruik)per put.
In een poging om de ontwikkeling van meer specifiek protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten in vitro te vergemakkelijken, presenteren we hier experimenten door TEM, confocale microscopie, luminometer, stroomcytometrie en extracellulaire flux analyzer met toekomstige toepassing bij het bestuderen van mitochondriën schade gerelateerde nadelige resultaten.

<table><tbody><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscoop&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>Hoge contrast, hoge resolutie beeldvorming, Observatie en beeldvorming met lage dosis, Observatie bij lage temperatuur, Uitstekende analytische prestaties, Automatisering voor gemak en prestaties</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green is een mitochondriale groen fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor mitochondriële specifieke fluorescente kleuring van levende cellen.</td></tr><tr><td>Laser scanning confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>Het ontwerp is compact, stabiel, de lichtbaan is de kortste, hoge lichtprecisie, creatieve technologie en geavanceerde scantechnologie samen om een perfect 3-dimensionaal monsterbeeld te produceren.</td></tr><tr><td>Verbeterde ATP Assay Kit</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td><td>De verbeterde ATP Assay Kit kan worden gebruikt om ATP (adenosine 5'-trifosfaat) niveaus in gangbare oplossingen, cellen of weefsels te detecteren. Cellen en weefselmonsters kunnen worden verdeeld om de monstervoorbereiding te voltooien, detectiegevoeligheid tot 0,1 nmol / L, chemiluminescentie kan gedurende 30 minuten worden onderhouden.</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>Een luminometer is een chemiluminescentie detector, het testmonster zelf kan licht zijn, geen stimulatie nodig. Een luminometer is het instrument dat chemiluminescentie detecteert.</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>BCA Protein Assay Kit is een van de meest gebruikte methoden voor het detecteren van eiwitconcentraties.</td></tr><tr><td>Multimode reader</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>Multimode reader kan worden gebruikt om eiwitconcentratie te detecteren.</td></tr></tbody></table>

experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten blootgesteld aan organochloor pesticiden

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.

De mitochondriën cristae van HepG2 cellen blootgesteld aan β-HCH werden aanzienlijk beschadigd. Verspreide mitochondriën waren licht tot duidelijk uitgebreid, onregelmatig gevormd, en mitochondriale nok verdwenen met relatief abnormale mitochondriale architectuur (Figuur 1).
De gemiddelde mitochondriale groene fluorescentieintensiteit, die de mitochondriën vertegenwoordigt, daalde in HepG2-cellen di...

Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.

Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Het is een messer die oproep antwoord op een belangrijke vraag die je hebt in ook een functie van het veld, zoals ATP-niveau en het zuurstofverbruik tarieven. De nieuwe of de ene pagina oud, deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren en het is veel voor een speciale evaluatie van cellulaire mitochondriale functie. Om dit experiment te starten, zaad 20,000 HepG2 cellen in een glazen bodem Petri schotel.Voeg bèta-hexachlooohohexaan of B-HCH toe in couveuse bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2 gedurende 24 uur. Bereid een millimolar mitochondriale groene fluorescentie sonde oplossing door het toevoegen van watervrije DMSO aan DMEM cel cultuur medium. Voeg vervolgens een milliliter per schotel van deze oplossing aan de cellen in glazen bodem Petri gerechten.En broeden op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Verwijder na incubatie de mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing uit de cellen. Voeg een milliliter per gerecht van vers bereid op 37 graden Celsius DMEM cel cultuur medium.Om groene fluorescentie in mitochondriën te detecteren, observeer de cellen onder een confocale microscoop. Om niveaus van cellulaire ATP te evalueren, zaad tot 20.000 HepG2-cellen in

experimental-protocol-for-detecting-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.

Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van triazolpesticiden in planten te beoordelen.

Beoordeling van cytotoxiciteit van metabolieten van typische triazolpesticiden in planten

Deze studie introduceert een methodologie voor het bestuderen van xenobiotische effecten op de mitochondriale functie via respirometrische en enzymatische testen. Het onderzoekt de modulatie van de elektronentransportketen in verschillende soorten en biedt inzichten voor de gerichte ontwikkeling van biopesticiden tegen door insectenvectoren overgedragen ziekten.

Onthulling van xenobiotisch transport en effecten in geïsoleerde mitochondriën: inzichten uit respirometrische en enzymatische tests

Leer mitochondriale functie detecteren in HepG2-hepatocyten blootgesteld aan organochloorpesticiden zoals beta-HCH. Deze methode meet ATP-niveaus, zuurstofverbruik en membraanpotentieel voor toxicologisch onderzoek.

Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

Meer video's verkennen