Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

Het is een messer die oproep antwoord op een belangrijke vraag die je hebt in ook een functie van het veld, zoals ATP-niveau en het zuurstofverbruik tarieven. De nieuwe of de ene pagina oud, deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren en het is veel voor een speciale evaluatie van cellulaire mitochondriale functie. Om dit experiment te starten, zaad 20,000 HepG2 cellen in een glazen bodem Petri schotel.

Voeg bèta-hexachlooohohexaan of B-HCH toe in couveuse bij 37 graden Celsius en vijf procent CO2 gedurende 24 uur. Bereid een millimolar mitochondriale groene fluorescentie sonde oplossing door het toevoegen van watervrije DMSO aan DMEM cel cultuur medium. Voeg vervolgens een milliliter per schotel van deze oplossing aan de cellen in glazen bodem Petri gerechten.

En broeden op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Verwijder na incubatie de mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing uit de cellen. Voeg een milliliter per gerecht van vers bereid op 37 graden Celsius DMEM cel cultuur medium.

Om groene fluorescentie in mitochondriën te detecteren, observeer de cellen onder een confocale microscoop. Om niveaus van cellulaire ATP te evalueren, zaad tot 20.000 HepG2-cellen in zes putplaten. Voeg bèta-HCH en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Voeg 200 microliter lyse buffer toe aan de cellen in elke put. Centrifuge op 12.000 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, en ga verder met het verzamelen van supernatant zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 100 microliters ATP detectie buffer aan de plaat.

Voeg 100 microliters verzamelde celsupernatant toe aan een 96 putplaat bij kamertemperatuur en ging over tot het detecteren van cellulaire ATP door middel van een luminometer zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor de beoordeling van mitochondriaal membraanpotentieel, groeien HepG2 cellen in zes putplaten met de toevoeging van beta-HCH, zoals eerder beschreven. Verzamel de cellen door ze te verteren met 0,5 milliliter 0,25%EDTA gedurende een minuut bij 37 graden Celsius.

Voeg een milliliter DMEM toe om de spijsvertering te stoppen en breng de verteerde cellen over naar 1,5 milliliter buizen. Centrifuge de buizen op 1000 keer G gedurende drie minuten, en gooi dan de supernatant. Verdun de celpellet met 0,5 milliliter celkweekmedium en 0,5 milliliter JC1 mitochondriale membraan potentiële kleurstof.

En 20 minuten uitbroeden bij 37 graden Celsius. Vervolgens centrifugeren de buizen op 600 keer G gedurende drie minuten op vier graden Celsius, en dan was de cel pellet volgens het tekstprotocol. Na het centrifugeren van de gewassen pellet, verwijder de supernatant.

En opnieuw op te schorten de pellet in 0,5 milliliter van JC1 verven buffer. Analyseer de JC1 gekleurde cellen via flow cytometrie om groene en rode fluorescentie te detecteren. Wanneer de JC1 monomeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 490 nanometer en het emissielicht op 530 nanometer.

Wanneer het JC1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 525 nanometer en het emissielicht op 590 nanometer. Om het zuurstofverbruik te analyseren, zaad HepG2 cellen in een 96 goed cel kweekplaat in een dichtheid van 4, 500 cellen per 100 microliter per put. Na 24 uur incubatie bij 37 graden Celsius, zorg ervoor dat de cellen in elke put zijn bedekt met medium.

Voordat u de OCR-software uitvoert, laadt u de microplaat met cartridge en de celkweekplaat in een extracellulaire fluxanalyzer zoals beschreven in het tekstprotocol. Open de OCR-software en in het vervolgkeuzemenu apps, kies de stresstestkit voor cel mito en klik op de knop Start-app. Klik vervolgens op de knop stresstest uitvoeren.

Wanneer het celstresstestscherm verschijnt, voert u het aantal cellen in dat per put wordt ingezaaid in het vak celzaainummer en de gemiddelde OCR in het gemiddelde van basale cel OCR-box. Voer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk reagens in en injecteer vervolgens de reagentia. Klik op de volgende knop.

Wanneer het groepsinfoscherm wordt weergegeven, wijst u een groep toe aan niet-toegewezen putten door een kleur te kiezen en een naam te geven. Klik dan op de juiste putten. Klik op de volgende knop en klik in het scherm van de stresstestinjectieindeling dat verschijnt, op start om de stresstest uit te voeren op de analyzer.

Volg na de voltooide run de aanwijzingen in de software en verwijder en gooi de cartridge en de celplaat weg. Gemiddelde intensiteit van mitochondriale groene fluorescerende vlekken daalde in HepG2 cellen blootgesteld aan beta-HCH. Hieruit blijkt dat er een afname is van het mitochondriaal aantal en een toename van beschadigde mitochondriën in overeenstemming met de toename van de concentratie van pesticiden.

Bovendien daalden de ATP-niveaus in HepG2-cellen met de verhoogde concentraties bèta-HCH-blootstelling, met de verminderde functie van mitochondriën in deze cellen. Na JC1 vlekken voor mitochondriale membraan potentieel, of MMP, flow cytometer toonde hoge rode groene JC1 fluorescentie in intacte HepG2 cellen. Dit was te wijten aan de aanwezigheid van rode fluorescerende JC1 aggregaten, die een teken zijn van hoge MMP.

In cellen behandeld met bèta-HCH, roodgroene JC1 fluorescentie afgenomen als gevolg van een aanwezigheid van groene fluorescerende JC1 monomeren, een teken van lage MMP. Ten slotte daalde het zuurstofverbruik ook met de verhoogde concentraties bèta-HCH-blootstelling, wat verder aantoont dat dit bestrijdingsmiddel de goede mitochondriale functie schaadt. Oh, nou, probeer deze procedure, het is belangrijk om te onthouden om die cellen te zien als geschikt om het te testen.

Na de ontwikkeling ervan maakt dit zeker een weg vrij voor onderzoeken op het gebied van fundamentele functie om relevante organismen in de medische rol die ermee gepaard gaat te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe u een hoeveelheid of kwaliteit, capaciteit, nu lid of potentieel onder tuitblad functie te detecteren.