Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle methode voor het meten van de mitochondriale functie van de tumor. Het protocol is breed toepasbaar op klinische translationele oncologie en zal helpen bij het verbeteren van de diagnostische en mechanistische interpretatie van de rol van mitochondriën bij het ontstaan en de progressie van kanker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de toepassing van weefselhomogenisatie om de voorbereiding te vereenvoudigen en de opbrengst van mitochondriën te maximaliseren, terwijl de beperkingen van diffusie worden verminderd.

Deze techniek biedt potentiële toepassingen in klinische en diagnostische omgevingen met een kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale functie van de tumor met behulp van vers gebiopteerd of weggesneden tumorweefsel. Begin met het plaatsen van een glazen homogenisator met één milliliter mitochondriaal ademhalingsmedium, of MiR05, in een nauwsluitende glazen stamper op nat ijs. Plaats het weefsel in een milliliter biopsieconserveringsoplossing, of BIOPS, in een ijskoude petrischaal.

Snijd de tumor in kleine stukjes van ongeveer 5 tot 10 milligram elk en plaats de resterende tumorstukken terug in 10 milliliter BIOPS die op ijs worden gehouden. Nadat u de tissuesecties zorgvuldig op een filterpapier hebt gedept, plaatst u ze op een kleine plastic geteerde weegboot en registreert u het initiële natte gewicht. Plaats de ongebruikte stukken terug in de conische buis van 10 milliliter van BIOPS voor verdere conservering.

Dompel de weefselsecties onder in een ijskoude homogenisator met MiR05 en noteer het resterende gewicht op de weegboot. Gebruik een glazen stamper met een spelingsbereik van 0,09 tot 0,16 millimeter en verstoor het tumorweefsel voorzichtig door vijf tot zeven neerwaartse en hogere slagen te voltooien. Draai voor elke slag de stamper drie keer met de klok mee / tegen de klok in terwijl u de stamper naar beneden duwt en drie keer extra terwijl u de stamper weer omhoog trekt.

Laat het weefsel tussen de slagen door naar de bodem van de homogenisator zakken, maar vermijd het volledig boven het vloeistofvolume te brengen om schuimvorming te voorkomen. Giet het homogenaat in een conische buis van 15 milliliter en leg het op ijs. Pipetteer één tot drie milliliter verse MiR05 over de stamper en in de homogenisator om eventueel achtergebleven weefselhomogenaat te wassen.

Giet de MiR05-was in de conische buis met het homogenaat. Herhaal deze stap twee tot drie keer om een volledige overdracht van het homogenaat te garanderen. Om de weefselhomogenaatconcentratie nauwkeurig te berekenen, inspecteert u de homogenisator en het homogenaat zorgvuldig op achtergebleven niet-gehomogeniseerd materiaal, waaronder bindweefsel.

Om het niet-gehomogeniseerde materiaal uit de homogenisator te verwijderen dat niet met een pincet kan worden bereikt, na toevoeging van MiR05 aan de homogenisator, zuigt u het volume, inclusief het weefsel, op met een pipet en verplaatst u de inhoud naar een petrischaal. Verwijder het niet-gehomogeniseerde materiaal dat in grote stukken aan de onderkant van de conische buis is bezinkt van het homogenaat door ze met een pipet aan te zuigen en plaats ze op de dop van de conische buis. Verwijder het zakdoekje met een pincet uit de petrischaal of conische buisdop en dep het op filterpapier.

Voeg het resterende homogenaat van de conische buisdop terug in de conische buis. Sluit de buis af en keer om om te mengen. Herlees de homogenisatoren en homogenaat voor elk extra niet-gehomogeniseerd materiaal en herhaal de stappen om niet-gehomogeniseerd materiaal indien nodig te verwijderen.

Weeg en noteer de massa van het niet-gehomogeniseerde materiaal dat uit de homogenisator wordt teruggewonnen. Inspecteer het homogenaatpreparaat op elk grof intact weefsel dat wordt overgedragen en verwijder de niet-gehomogeniseerde stukken en weeg indien nodig. Trek het weefselgewicht dat is teruggewonnen van de weegboot, homogenisator en homogenaat af van het oorspronkelijke natte gewicht om het uiteindelijke monstergewicht te berekenen.

Voeg met behulp van het uiteindelijke monstergewicht extra MiR05 toe om homogenaat in de gewenste concentratie te brengen. Zodra het homogenaat is gewogen en bereid, gaat u zo snel mogelijk over tot de test. Bewaar het monster op nat ijs totdat het op het instrument wordt overgebracht.

Zodra het instrument is gekalibreerd en het monster is voorbereid, verwijdert u de stoppen met een draaiende beweging en zuigt u de MiR05 uit de kamers, waarbij u het membraan in de kamer vermijdt. Meng het homogenaat goed en voeg 2,25 milliliter homogenaat toe aan de kamer. Stel dat één homogenaat aan meerdere kamers wordt toegevoegd, pipetteer dan één milliliter van het homogenaat per keer in elke kamer terwijl het homogenaat wordt gemengd om een gelijke weefselverdeling te garanderen.

Klik op F4 om het evenement een naam te geven en een tijdstempel te geven en klik vervolgens op OK. Vul een spuit van 50 milliliter met zuurstof uit een zuurstoftank met een regelaar en een gasslang met een stompe naald van 18 gauge. Injecteer de zuurstof rechtstreeks in de kamers om ze te hyperoxygeneren tot ongeveer 500 micromolaire zuurstof.

Plaats de stoppers losjes en wacht met sluiten totdat de zuurstof ongeveer 480 micromolair bereikt. Sluit met een draaiende beweging langzaam de kamer en laat de ademhaling ongeveer 15 tot 20 minuten in evenwicht brengen. Vul indien nodig het centrale capillair van de stop met MiR05.

Gebruik speciale microsyringes om substraten, ontkoppelaars en remmers in volledig gesloten kamers te injecteren om de gebeurtenissen voor elke kamer in realtime te benoemen en te timen. Selecteer F6 om de zuurstofconcentratie en zuurstofhelling negatieve schalen zo nodig aan te passen. Was de spuit na elke injectie driemaal in water voor in water oplosbare verbindingen en 70% ethanol voor opgeloste ethanolverbindingen.

Voeg vijf microliter 0,8-molair malaat toe en ga onmiddellijk over tot de volgende injectie. Was de injectiespuit driemaal in water. Voeg onmiddellijk vijf microliter 1-molair pyruvaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert.

Voeg na het wassen van de spuit 10 microliter van 0,5-molaire ADP toe en wacht tot de ADP-respons is gestabiliseerd. Was de spuit en voeg vijf microliter 2-molair glutamaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Was de spuit, voeg vervolgens vijf microliter 4-millimolair cytochroom-C toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert.

Voeg na het wassen van de spuit 20 microliter 1-molair succinaat toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Titreer stappen van 0,5 tot 1 microliter van 1 millimolaire FCCP en wacht tot de ademhaling na elke injectie stabiliseert. Ga door totdat er geen extra toename van de ademhaling is.

Was de injectiespuit driemaal in 70% ethanol. Voeg twee microliter 150 micromolair rotenon toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog een microliter rotenon toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is.

Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is en was de injectiespuit vervolgens drie keer in 70% ethanol. Voeg twee microliter 125 micromolair antimycine A toe en wacht tot de ademhaling stabiliseert. Voeg nog een microliter antimycine A toe om ervoor te zorgen dat er geen verdere remming is.

Als er een afname van de ademhaling is, ga dan door met extra injecties totdat er geen afname van de ademhaling is. Was de spuit driemaal met 70% ethanol. Controleer de zuurstofconcentratie van de kamer.

Als de concentratie lager is dan 125 micromolair, reoxygeneer dan naar kamerlucht of mild hyperoxygenaat om ervoor te zorgen dat zuurstof de ademhalingsflux niet beperkt. Voeg vijf microliter 0,8-molair ascorbaat toe. Was de spuit driemaal in 70% ethanol.

Voeg onmiddellijk 10 microliter 0,2-molaire TMPD toe en wacht op een toename van de ademhaling. Voeg na het wassen van de spuit met ethanol onmiddellijk 25 microliter 4-molair natriumazide toe wanneer de ademhalingsflux van ascorbaat TMPD plateaus. Beëindig de door te klikken op Bestand, Opslaan en loskoppelen.

Er werd waargenomen dat 40 milligram per milliliter weefselhomogenaat resulteerde in een snelle zuurstofuitputting. Het zuurstofverbruik vertraagde aanzienlijk met 30 en 20 milligram per milliliter weefselhomogenaat, maar nam nog steeds snel af in korte tijd bij afwezigheid van substraten of ADP. De concentratie van 10 milligram per milliliter weefselhomogenaat resulteerde in het optimale zuurstofverbruik.

Een SUIT-protocol werd gebruikt om NADH- en succinaat-gekoppelde oxidatieve fosforylering en elektronenoverdracht te evalueren, evenals Complex IV-activiteit. Cytochroom C-afgifte werd beoordeeld in aanwezigheid van pyruvaat en malaat, of succinaat en rotenon, die beide aantoonden dat het homogenaatpreparaat de mitochondriën niet beschadigde. Het bleek ook dat NADH-gebonden oxidatieve fosforylering verwaarloosbaar was in EO771-tumoren.

Titratie van FCCP om de maximale elektronenstroom te stimuleren, onthulde dat in EO771-tumoren fosforylering, in plaats van oxidatie, beperkt was tot ademhaling. De tumorhomogenaat ademhalingsprofielen waren vergelijkbaar met die van niet-geïmplanteerde, digitonine-gepermeabiliseerde EO771-cellen, met uitzondering van verminderde maximale elektronenoverdracht ondersteund door N- en S-gebonden substraten in de tumor. De respiratoire kinetiek van succinaat werd verder geëvalueerd door stapsgewijze titraties van subsaturerende ADP totdat de maximale snelheid was bereikt.

De half-maximale concentratie van ADP in aanwezigheid van succinaat en rotenon was 37,5-micromolair, terwijl de maximale snelheid ongeveer 10,5 picomol per seconde per milligram was. Instrumenten die zijn opgezet in routinezorg, evenals weefselbehandeling, zijn van cruciaal belang voor het succes van deze experimenten. Na deze procedures kunnen andere massa- of markerspecifieke benaderingen voor tariefnormalisatie worden toegepast op basis van de kwestie van interesse.

Veel voorkomende maatregelen omvatten totale eiwitkwantificering en enzymatische activiteit van citraatsynthase, maar variëren op basis van het modelsysteem, statistisch ontwerp en onderzoeksvraag.