Geoptimaliseerde workflow voor iteratief bleken breidt multiplexiteitsbeeldvorming van sterk autofluorescerende klinische monsters uit

[Verteller] Met behulp van ruimtelijke proteomics, uitgeroepen tot Nature Methods' 2024 Method of the Year, kunnen de precieze locaties van immuuncellen samen met cel-celinteracties in weefsels in kaart worden gebracht. Dit onthult ruimtelijke patronen die verband houden met klinische resultaten. Het bouwen van complexe antilichaampanels en beeldvormende weefsels met een hoge endogene fluorescentie brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee op het gebied van tijd, middelen en expertise voor IBEX en andere fluorescentiemicroscopietechnieken. Met behulp van IBEX werden tumorspecifieke kenmerken geïdentificeerd bij patiënten met folliculair lymfoom met een hoog risico en met collega's van Human Cell Atlas. Er werd een uitgebreide ruimtelijke kaart van de menselijke thymus gemaakt. Er is weinig bekend over de samenstelling van immuuncellen, ruimtelijke interacties en verschillen in cytokineproductie tussen verschillende mycobacteriële longpathologieën. Dit protocol overbrugt deze kloof. Dit protocol biedt een goedkope, aanpasbare fotobestralingsmethode om autofluorescentie van breedspectrum weefsel aanzienlijk te verminderen, vooral in moeilijke FFPE-monsters, met behoud van het antilichaamsignaal voor ruimtelijke analyse. Dompel om te beginnen de objectglaasjes met weefsel onder in PBS na het voltooien van het antigeen. Verwijder een glaasje uit de PBS en gebruik een pluisvrij doekje om alle overtollige buffer voorzichtig af te drogen zonder het weefsel aan te raken. Teken met een hydrofobe pen een rand rond het weefselgedeelte op het objectglaasje. Nadat u het proces voor de resterende dia's hebt herhaald, laat u de hydrofobe barrières 10 minuten drogen. Verwijder vervolgens met een pluisvrij doekje de PBS van het weefselgedeelte zonder het weefsel rechtstreeks aan te raken. Voeg nu 200 microliter blokkeerbuffer toe op de schuif en sluit de vochtkamer. Plaats de kamer in een niet-verwarmende wetenschappelijke magnetron met een temperatuurregelmechanisme en voer het eerder ingestelde programma vijf cycli uit. Bereid tijdens de blokkerende incubatie de primaire antilichaamkleuringsoplossing 1 met haken en de blokkerende buffer met Fc-blok. Combineer de antilichamen en meng de cocktail voorzichtig. Wanneer de magnetroncyclus is voltooid, verwijdert en opent u de objectglaasjeskamer en verwijdert u de blokkerende buffer van het objectglaasje zonder het weefsel aan te raken. Voeg vervolgens 200 microliter primaire antilichaamkleuringsoplossing 1 toe aan het objectglaasje. Zet de kamer terug in de magnetron en voer het primaire antilichaamprogramma opnieuw uit gedurende ongeveer 30 minuten. Zodra de primaire antilichaamlabeling is voltooid, houdt u de dia verticaal. Om het glaasje te wassen, pipetteert u 1.000 microliter PBS op het weefsel, zodat het kan weglopen. Afvoer het overtollige PBS en fixeer het glaasje met 1% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in de vochtigheidskamer. Was het objectglaasje na het fixeren drie tot vijf keer grondig met 1.000 microliter PBS en laat een laag PBS op het weefsel achter tot de fotobestralingsstap. Om de fotobestralingsbox voor te bereiden, verzamelt u een LED-lamp van 150 watt, een RGBW-flood LED-lamp van 40 watt, een grote plastic container met een inhoud van 75.71 liter of meer, verse PBS en een petrischaaltje. Vul nu de petrischaal met 1x PBS om het glaasje volledig onder te dompelen. Voer de fotobestralingsprocedure uit in een koude ruimte om de warmte van de lampen te minimaliseren. Plaats vervolgens het glaasje in het petrischaaltje en zorg ervoor dat het volledig is ondergedompeld in PBS. Plaats vervolgens de lamp van 40 watt direct boven de petrischaal met de lichtbron naar beneden gericht in de richting van de schuif en zet de lamp op de roodlichtstand. Zet ten slotte zowel de lampen van 150 watt als die van 40 watt aan en dek de hele opstelling af met het deksel van de plastic container. Zet na twee uur de lamp op groen licht en broed gedurende 16 uur. De helderste fluoroforen die compatibel zijn met het kleurstofinactiveringsprotocol werden geïdentificeerd en gekoppeld aan laag tot expressie gebrachte markers om de signaaldetectie te verbeteren. Autofluorescentie was significant verminderd na fotobestraling en bij langere beeldvormingsgolflengten. Direct geconjugeerde antilichamen gericht tegen sterk tot expressie gebrachte structurele markers, alfa-gladde spieractine en pancytokeratine, vervangen in het nabij-infraroodkanaal op 750 nanometer. Het achtergrondsignaal werd computationeel afgetrokken met behulp van een ongekleurde referentieafbeelding en SimpleITK-rekenkunde, en echte signalen werden verbeterd door middel van drempelwaarden. Beeldvorming van hele dia's van met IBEX bevlekte secties onthulde granulomen met necrotische kernen en CD15-positieve neutrofielen. Mycobacterium tuberculosis of niet-tuberculeuze mycobacteriën werden gedetecteerd in de buurt van de necrotische kern van het granuloom met behulp van antigeen-85B-antilichaam. Granuloom-geassocieerd lymfoïde weefsel bevatte CD20-positieve B-cellen, CD4-positieve T-cellen, enkele CD8-positieve T-cellen en CD45-labeling van alle immuuncellen in de long. IBEX-beeldvorming maakte ook visualisatie mogelijk van anatomische kenmerken van de longen, waaronder bronchiale epitheelcellen, arteriële gladde spieren en CD68-positieve macrofagen.