Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

Het knooppunt en de notochordalplaat zijn essentiële organisatoren tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis. Vandaag zullen we twee technieken beschrijven die door ontwikkelingsbiologen worden gebruikt om deze structuren te visualiseren en te bestuderen. In het eerste protocol laten we zien hoe we scanning electro microscopie, SEM en in het tweede, hele mount immunofluorescentie kunnen uitvoeren.

Het knooppunt en de notochordalplaat zijn tijdelijk aanwezig op het oppervlak van het embryo op embryonale dag E7.75, de nadruk kleine trilharen projecteren naar buiten, die hun identificatie en visualisatie door SEM mogelijk maken. In beide protocollen zullen we kritische stappen demonstreren bij het omgaan met de relatief kleine muisembryo's en ons richten op hoe ze kunnen worden overgedragen en gerouteerd. Om te beginnen, open de buik van een geëuthanaseerde zwangere muis door de huid en de mesenteries.

Verwijder met behulp van een schaar en fijne tangen de baarmoeder. Spoel de baarmoeder kort in gedestilleerd water en plaats deze in een kleine petrischaal met PBS. Gebruik vervolgens een ontledende microscoop en fijne tangen om de baarmoederspieren te verwijderen om de individuele decidui te bevrijden.

Houd onder de ontledenmicroscoop elke decidua met een paar tangen vast en gebruik een ander paar om een longitudinale, volledige dikteincisie tussen het rode deel en het witte deel te maken. Maak oppervlakkige perforaties verticaal langs het witte deel van de decidua, aaneengesloten met de incisie. Trek vervolgens de decidua horizontaal in twee helften uit elkaar en verwijder het embryo voorzichtig uit het witte deel van de decidua.

Breng hierna de embryo's over naar een nieuwe petrischaal met steriel gefilterde PBS. Verwijder Reicherts membraan uit elk embryo, te beginnen bij de ectoplacental kegel. Voor toekomstige genotyping, verwijder een klein stukje van de dooier zak.

Breng de embryo's onder een chemische kap over op een microcentrifugebuis met EM-kwaliteitfixittief bestaande uit 2,5% glutaraldehyde en steriel gefilterde PBS. Verwijder hierna het fixitive uit de buis zonder de embryo's te storen. Was de embryo's drie keer in steriele, gefilterde PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Dehydrateer de embryo's in een ethanolserie gedurende elk vijf minuten met behulp van 50%70% en 85% ethanol verdund in PBS. Was drie keer in 100% ethanol. Bewaar embryo's in 100% ethanol bij 20 graden Celsius, of ga naar de volgende stap.

Breng hierna de embroyos over naar een geschikt vat en verwijder de resterende vloeistof. Voeg HMDS en ethanol met een verhouding van 1 op 1 toe aan de embryo's gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens de vloeistof en voeg 30 minuten pure HMDS toe.

Verwijder de vloeistof uit de embryo's met een pipet en laat ze 30 minuten drogen. Gebruik een kleine borstel en dubbelzijdige tape om de gedroogde embryo's op SEM stubs te monteren, met de ventrale zijkanten omhoog. Steek de stompen in een sputter coating machine voor gouddeeltjes coating.

Een van de meest delicate stappen in het SEM-deeltje is het monteren van de embryo's in de juiste richting op de stomp. Zodra het embryo op de band belandt, kan de oriëntatie niet meer worden gewijzigd. Plaats hierna de gecoate stompjes in een SEM-microscoop, breng een vacuüm aan en observeer de embryonale knooppunten en notochordalplaatcellen met trilharen.

Na het verwijderen van de embryo's op E7.75, plaats ze in PBS Tween in een petrischaaltje op ijs. Breng de embryo's onder een chemische kap over naar een microcentrifugebuis met fixatieve oplossing. Verwijder hierna het fixatief uit de buis, waarbij u ervoor zorgt dat de embryo's niet meer worden aangeraakt.

Was vervolgens de embryo's drie keer in PBS met 0,2%Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een nootachtige shaker. Verwijder de laatste wasbeurt uit de embryo's en voeg een blokkeeroplossing toe die PBS Triton bevat, met 10% warmtegeactiveerd serum. Blokkeer de embryo's minstens twee uur op een nutator bij vier graden Celsius.

Verwijder vervolgens de blokkering en voeg ongeveer een milliliter primaire antilichaam verdund in blokkeren oplossing. Broed de embryo's 's nachts op een nutator op vier graden Celsius. Verwijder het primaire antilichaam en bewaar het voor later gebruik.

Spoel vervolgens de embryo's twee keer met PBS Triton. En was ze drie keer gedurende 30 minuten op een nutator. Vervang de was door de verdunde florescence geconjugeerde secundaire antilichaam tegen de primaire antilichaam gastheer soorten.

En broeden 's nachts op een nutator op vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het secundaire antilichaam en spoel de embryo's twee keer af met PBS Triton. Voor het wassen drie keer gedurende 30 minuten met PBS Triton.

Vervang de laatste wasbeurt door PBS Triton met verdunde florescentie geconjugeerde phalloïden en verdunde DAPI en vlek gedurende een uur bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens de embryo's twee keer in PBS Triton. En was ze met PBS Triton gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Vervang hierna de PBS Triton door PBS en laat de embryo's op ijs staan. Bereid vervolgens schone, positief geladen glijbanen, afdekbonnen en waterige glycerol gebaseerde montagemedia voor. Plaats twee stukken van duidelijke tape 15 millimeter uit elkaar op de dia.

Gebruik vervolgens, onder de ontledenmicroscoop, een aangepaste P200-pipet om een embryo naar de glijbaan te verplaatsen. Met behulp van fijne tangen, maak twee volledige bezuinigingen op de zijkanten van de dooier zak om het embryo te ontvouwen. Plaats vervolgens het embryo met de ventrale kant omhoog.

Voeg 50 microliter montagemedia toe aan het embryo. Voeg vervolgens een schar van montagemedia toe aan de cover slip. Plaats het over de twee stukken tape, en laat het langzaam op de embryo's met behulp van een gebogen naald.

Gebruik een absorberend doekje om overtollige montagemedia te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat de afdekstrook niet wordt verplaatst. Gebruik vervolgens een royale hoeveelheid nagellak om de zijkanten van de afdekslip te verzegelen. Gebruik ten slotte een confocale microscoop scannen om de embryo's te observeren.

Het is van cruciaal belang om de afdeksel na montage niet over de embryo's te verplaatsen, omdat het ze kan vervormen voor 3D-visualisatie. Met behulp van scanning elektronenmicroscopie werd de vorming van het knooppunt in wilde typen en strip één gemuteerde muisembryo's op E7.75 waargenomen. In tegenstelling tot de pitvormige node in het wilde type, vertoonden de gemuteerde embryo's een afgeplatte en een gewone node en nodalcordal plaat.

Geheel nu aan immunofluorescentie werd gebruikt om de node en notochordal plaatvormingstekorten in Strook 1 mutantembryo's op cellulair niveau te bestuderen. De gegevens toonden aan dat ze abnormaal waren en belemmerd in de gemuteerde embryo's. Het knooppunt en de nodalecortale plaat zijn slechts tijdelijk aanwezig op het oppervlak van het embryo, daarom is timing essentieel voor het succes van SEM.

Bijvoorbeeld, twee tot vier somite embryo's zijn goed voor SEM analyse van een volwassen knooppunt met lange trilharen. De zuiverheid reagentia is ook essentieel voor het succes van deze technieken, vooral in het onderzoeken van de ultrastructuur door SEM. Kleine onzuiverheden die vasthouden aan het embryo meestal resulteren in enorme artefacten.

Wij zijn van mening dat deze twee technieken aanvullende informatie geven over de structuur van het knooppunt en de nodalecortale plaat tijdens de normale ontwikkeling en in mutanten die gebreken vertonen in de vorming van deze structuren.