TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn dat het de kosten van etikettering verlaagt, de eiwitextractie verbetert en hoogwaardige gegevens genereert. De belangrijkste voordelen van ons protocol zijn de hoge etiketteringsefficiëntie voor de verschillende soorten monsters, de reproduceerbaarheid en de betrouwbare gegevensverwerving. Na het isoleren van quadriceps spierweefsel monsters van een geëuthanaseerde muis volgens een IACUC goedgekeurd protocol, wegen 10 milligram spierweefsel en gebruik pincet om de spiervezels te scheiden.

Om een lysaat te maken, breng je het gescheiden weefselmonster over in een twee milliliter buis met 200 microliter van een millimeter zirconia silica kralen en 500 microliters chaps lysis buffer. Plaats de monsters in een kraalvers disruptor en voer twee opeenvolgende runs van 45 seconden uit. Na de tweede cyclus, om het DNA-gebonden eiwit vrij te geven, sonisch het monster 10 keer gedurende 10 seconden per sonicatie op een 50%amplitude met intervallen van 30 seconden op ijs.

Na de laatste sonicatie, centrifugeren het lysaat en breng de supernatant naar een nieuwe centrifuge buis. Voor het verminderen/alkyleren van reagensbehandeling breng je 200 microgram eiwit per conditie over in nieuwe centrifugebuizen en gebruik je een verse CHAPS lyse buffer om het uiteindelijke volume in elke buis tot 100 microliters te brengen. Voeg vervolgens vijf microliter TCEP toe aan elke buis en broed de monsters een uur lang uit op 55 graden Celsius.

Los aan het einde van de incubatie negen milligram iodoacetamide op in 132 microliter van 100 millimolar TEAB en bescherm de resulterende 375 millimolar iodoacetamideoplossing tegen licht. Voeg vervolgens vijf microliter iodoacetamide toe aan elk monster en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voor methanol/chloroforme neerslag, voeg 400 microliter methanol aan elke 100 microliter eiwit en kort vortex de monsters.

Om de vloeistoffen die aan de zijkanten van de monsterbuizen worden afgezet, op te nemen, worden de monsters kort gecentrifugeerd en 100 microliter chloroform aan elke buis toegevoegd. Na een korte vortexing, snel centrifugeren de buizen weer om de vloeistof te verzamelen aan de zijkanten van de buizen en voeg 300 microliters van water aan de monsters. Vortex krachtig om homogene oplossingen te verkrijgen en centrifugeren de monsters gedurende een minuut onder dezelfde centrifuge voorwaarden.

Breng de buizen aan het einde van de centrifuge voorzichtig over in een rek zonder de lagen te storen en verwijder de supernatant voorzichtig. Voeg 300 microliter methanol toe aan de resterende inter- en bodemfasen en draaivorst de monsters weer krachtig. Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten en pireer de supernatants zorgvuldig aan.

Dan voorzichtig aspirate zo veel vloeistof uit elk monster mogelijk onder een stroom van lucht tot de pellets zijn gewoon een beetje vochtig. Beoordeel de hydratatie om de twee minuten gedurende ongeveer 10 minuten. Indien nodig kunnen de pellets worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking.

Om het eiwit te verteren, resuspend de neergeslagen pellet in 100 microliters van TEAB lyse buffer en voeg 100 microliters van trypsine opslag oplossing aan de onderkant van een 100 microgram trypsine glas flacon. Voeg na vijf minuten bij kamertemperatuur 2,5 microliter van de vers bereide trypsineoplossing per 100 microgram eiwit toe aan elk monster en broed de monsters 's nachts bij 37 graden Celsius uit. Los voor peptide-etikettering elke 0,8 milligram TMT-tag flacon op met 41 microliter watervrije acetonitril per tag en ontcubeer de reagentia gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe vortexen terwijl de etiketten tegen licht worden beschermd.

Aan het einde van de incubatie, kort centrifugeren de flesjes en zorgvuldig 41 microliters van TMT label reagens toe te voegen aan elk 100 microliter monster voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, blus de reacties met de toevoeging van acht microliters van 5%hydroxylamine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens splitsen de monsters in gelijke aliquots in nieuwe centrifuge buizen voor opslag bij min 80 graden Celsius.

In deze representatieve gegevensverwerving werden 39, 653 in totaal peptiden geanalyseerd, waarvan er 4, 457 gelijk hadden aan of groter dan twee unieke peptiden en 3, 829 opgenomen reporter ionen voor alle kanalen. Een vouw verandering cutoff werd gebruikt om de relatieve verdeling van eiwitten uit zieke in vergelijking met gezonde cellen met 296 eiwitten van aanzienlijk lagere overvloed en 108 eiwitten van aanzienlijk hogere overvloed waargenomen te bepalen. PANTHER analyse toonde een gecategoriseerde lijst van eiwitten op basis van aanzienlijk lagere of hogere overvloed aan zieke cellen op basis van hun moleculaire functie.

De analyse van de koord van de proteïnen van beduidend lagere of hogere overvloed identificeerde verder veelvoudige interacties en sterke verenigingen tussen proteïnen. Aanvullende methoden kunnen worden uitgevoerd om eiwit-naar-eiwit interacties te identificeren, om de interacties te classificeren door groepen, en om de interacties in een verscheidenheid van trajecten te identificeren. Proteomics technieken zijn krachtige instrumenten binnen de biomedische onderzoeksvelden voor het begrijpen van de mechanismen van ziekteontwikkeling door het verstrekken van gedetailleerde eiwit overvloed informatie.