Nanodeeltjes tracking analyse voor de kwantificering en groottebepaling van extracellulaire blaasjes

NTA-resultaten zijn zeer gevoelig voor operator bias. Dit protocol toont de effecten van gewijzigde NTA-parameters op de verkregen resultaten. Een gestandaardiseerde methode zal helpen de striktheid en reproduceerbaarheid in NTA-analyse te vergroten.

Door het monster in een cuvette te analyseren, kan in elke video een statistisch willekeurige steekproef worden vastgelegd. Dit resulteert in meer reproduceerbare gegevens en de visualisatie van deeltjes over een breed scala aan groottes. Aangezien het moeilijk kan zijn om een monster in het aanbevolen deeltjesconcentratiebereik te krijgen, moet u een seriële verdunning uitvoeren om de ideale verdunningsfactor te identificeren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Kungheng Cai, een promovendus uit het laboratorium van Anthony Ferrante. Om cuvette voor te bereiden op analyse van het volgen van nanodeeltjes, bedek je de werkruimte met een pluisvrij materiaal om te voorkomen dat vezels de cuvetten binnendringen. Draag handschoenen en plaats een cuvette met een roerstaaf op de magnetische cuvette mal.

Gebruik een haakgereedschap om het inzetstuk in de cuvette te plaatsen met de inkeping van het inzetstuk zichtbaar aan de voorkant van de cuvette. Gebruik een pipet om langzaam 400 tot 500 microliter gezuiverde extracellulaire blaasjes op de cuvette toe te voegen door het gat in de insert en meng het monster door voorzichtig te pipetteren zonder luchtbellen in te brengen, dop vervolgens de cuvette af, tik zo nodig bubbels uit en gebruik een pluisvrije doek om het buitenoppervlak van de cuvette af te vegen. Om de deeltjesconcentratie van het verdunningsmiddel of een monster te analyseren, schakelt u het werkstation en instrument van de computer in en start u het analyseprogramma voor het volgen van deeltjes.

Wanneer u hierom wordt gevraagd, klikt u op NTA en opent u het opnametabblad. Volg de instructies op het scherm om alle benodigde voorbeeldinformatie in te vullen. Voor ev-trackinganalyse stelt u het verdunningswater in op PBS.

Het zoutgehalte wordt automatisch gevuld tot 9% Om de concentratie van het verdunningsmiddel of het monsterdeeltje te verkrijgen, opent u het deksel van het instrument en verwijdert u de beschermkap waar het cuvette zal worden geplaatst. Plaats de cuvette in de juiste richting in het instrument met de inkeping van het inzetstuk naar de camera gericht en vervang de dop en het deksel van het instrument. Klik op de streamingpijl om de camera in te schakelen en klik op de punthaakpijl om de opname-instellingen uit te vouwen.

Pas de scherpstelling aan totdat de relatief kleine deeltjes goed zichtbaar zijn. Om de analyse in te stellen voor een kleine EV-kwantificering, stelt u de framesnelheid in op 30 frames per seconde, de belichting op 15 milliseconden, de roertijd op vijf seconden, de wachttijd op drie seconden, de blauwe, groene en rode laservermogens op respectievelijk 210, 12 en 8 milliwatt, de frames per video op 300 en de versterking op 30 decibel. Pas de scherpstelling aan totdat de relatief kleine deeltjes goed zichtbaar zijn.

Het vergroten van de zoom en/of de versterking kan helpen bij het scherpstellen van deeltjes. Maar als u de versterking verhoogt, vergeet dan niet om deze voorafgaand aan de opname in te stellen op 30 decibel. Zodra deeltjes scherp zijn, stelt u de zoominstelling in op 0,5x om bandbreedte te besparen en verlies van frames te voorkomen en klikt u op record om te beginnen met het opnemen van de video.

Wanneer er een prompt verschijnt waarin staat dat de video's zijn opgenomen, klikt u op OK om de opname te voltooien en selecteert u het tabblad Proces. Als er tijdens het opnemen zeer grote deeltjes zichtbaar waren in een video, navigeert u naar de map met opgenomen video's en verwijdert u eventuele problematische video vóór de verwerking. Schakel het selectievakje Audiodetectie overschrijven uitschakelen in en stel de functiediameter in op 30.

Klik op proces om videoverwerking te starten en een live distributiegrafiek te bekijken. Wanneer de verwerking is voltooid, klikt u op OK en selecteert u het tabblad Plot. Voor EV's geeft u het hoofddiagram weer als log bin silica.

Andere functies van de grafiek, zoals het wijzigen van de x-as om het gebied in te stellen voor integratie van de geproduceerde figuur, kunnen worden aangepast. Als u een PDF-rapport van de resultaten wilt maken, klikt u op de knop Rapport. Het gemiddelde, de mediaan, de modusgrootte en de concentratie die zijn aangepast voor de verdunningsfactor en de distributiebreedte worden weergegeven.

NTA van het verdunningsmiddel moet vóór elk monster worden uitgevoerd, zodat de concentratie van deze blanco kan worden afgetrokken van de deeltjesconcentratie van het EV-monster. Om de cuvetten na analyse te reinigen, leegt u de cuvette en vult u de cuvetten 10 tot 15 keer volledig met gedeioniseerd water en de drie keer met 70 tot 100% ethanol om eventueel restmonster te verwijderen. Droog de buitenkant van de cuvetten met een pluisvrije microvezeldoek en droog de binnenkant met een persluchtstof.

Om de inzetstukken en roerstaafjes schoon te maken, plaatst u de materialen in een glazen injectieflacon met 70 tot 100% ethanol en schudt u de injectieflacon krachtig. Spoel vervolgens de inzetstukken en roerstaafjes in gedeioniseerd water met schudden zoals gedemonstreerd en droog ze met pluisvrije doeken. Plaats na het drogen onmiddellijk alle schone componenten in opslag tot de volgende analyse.

Voordat een analyse werd uitgevoerd, werd de instrumentkalibratie getest met polystyreenparels om de geldigheid van de verkregen gegevens te garanderen. Zoals waargenomen, rapporteerde het deeltjesvolginstrument nauwkeurig de grootte van de 100 nanometer manodisperse kralen, maar rapporteerde alleen nauwkeurig de grootte van de 400 nanometer kralen. Daarom waren de instrumentinstellingen voor dit protocol nauwkeuriger voor kleinere deeltjes, dichter bij 100 nanometer groot.

Met behulp van deze instellingen wordt de gerapporteerde deeltjesconcentratie dienovereenkomstig geschaald met de verdunningsfactor die aantoont dat het instrument de deeltjesconcentratie bij verschillende verdunningen nauwkeurig kan detecteren met weinig variabiliteit tussen technische replicants. De optimale verdunning voor een EV-monster van 4,41 maal 10 tot 10e deeltjes per milliliter van muisweefsel afgeleid EV-monster werd bepaald tussen 1.000 en 3.000. In deze analyse verhoogde het verhogen van de versterking de gevoeligheid van de camera, waardoor een toename van de visualisatie van een groter aantal kleinere deeltjes mogelijk werd.

Het verhogen van het blauwe laservermogen van 70 naar 210 milliwatt terwijl de groene en rode laserkrachten constant bleven, verschoof de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte van 122 naar 105 nanometer en verhoogde de gerapporteerde totale deeltjesconcentratie van 1,1 keer 10 naar de achtste naar 1,7 keer 10 naar de achtste. Het verhogen van het vermogen van de rode laser verhoogde de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte van 175 naar 246 nanometer en verlaagde de gerapporteerde totale deeltjesconcentratie. Het verhogen van het groene laservermogen resulteerde in een afname van de gerapporteerde gemiddelde deeltjesgrootte en een toename van de gerapporteerde totale deeltjesconcentratie.

Het vinden van de juiste verdunning om een monster binnen het optimale detectiebereik te plaatsen, kan voor elk monster een paar pogingen vergen. Ook de cuvette reiniging vraagt om extra zorgvuldige behandeling. We raden aan om meer dan één orthogonale methode toe te passen voor EV-deeltjesgrootte- en concentratiemetingen.

Dynamische lichtverstrooiing, resistieve pulsdetectie, transmissie-elektronenmicroscopie en single-particle interferometrische reflectiebeeldvormingsdetectie kunnen ook worden uitgevoerd om EV's te karakteriseren.