Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

Het verkrijgen van voldoende hoeveelheden membraaneiwitten voor downstreamtoepassingen blijft een belangrijke technische uitdaging. Dit protocol maakt de zuivering van verschillende membraantransporteiwitten naar homogeniteit mogelijk. Een belangrijk voordeel van deze techniek is dat Saccharomyces cerevisiae een tijd- en kosteneffectief eukaryotisch expressiesysteem is voor membraaneiwitten dat de optimalisatie van vele belangrijke experimentele variabelen mogelijk maakt.

Begin met het inenten van drie getransformeerde gistkolonies, in 50 milliliter volledig aanvullend selectief medium zonder histidine. Aangevuld met gist stikstof basis en 2%glucose voor een nachtelijke incubatie bij 190 rotaties per minuut en 30 graden Celsius. Verwijder de cultuur de volgende dag.

Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid op 600 nanometer of OD 600 te bepalen. En inenting elk van vier twee-liter kolf met 500 milliliter cultuur medium tot een OD 600 van 0,01. Dan schud de culturen op 190 rotaties per minuut op 30 graden Celsius gedurende 30 uur om de cellen om alle glucose te consumeren en om te groeien tot een hoge dichtheid.

Om borate transporter expressie te induceren, voeg 125 milliliter van vijf x gist peptone medium, aangevuld met 10% galactose bij 190 rotaties per minuut bij 30 graden Celsius gedurende 16 uur. Oogst vervolgens de gistcellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 100 milliliter koud water. Draai in vortex om de gistpellet opnieuw op te sluiten en breng de oplossing serieel over om dit te doen met alle flessen met pellets.

Om de gistmembranen te oogsten, voeg eerst 11,25 milliliter van één molaire Tris, 0,45 milliliter 0,5 molaire EDTA en 2,25 milliliter van 100 millimolar PMSF toe aan de geresuspended cellen. Voeg water toe aan een uiteindelijk volume van 225 milliliter en breng de cellen over op een 450 milliliter metalen kraal die een bus klopt. Maak het resterende volume af met koude 0,5 millimeter glazen kralen en monteer de kralenkamer met een rotor.

Dompel de kamer onder in een ijsbad en voer zes pulsen van één minuut uit, gescheiden door twee minuten rusttijden om oververhitting van het lysaat te voorkomen. Na de laatste puls, verwijder de filtratie membraan uit een plastic wegwerp fles top filter geschroefd in een glazen fles en giet de inhoud van de kraal kralen kamer op de montage tijdens het aanbrengen van vacuüm. Spoel vervolgens met de twee x kraal wassen buffer door toe te voegen aan de kamer wervelende en vervolgens toe te voegen aan de kralen.

Spoel de kraalbeadkamer af met 225 milliliter wasbuffer en was de kralen met de inhoud van de kamer. Verzamel het lysaat door centrifugatie en decanteer de supernatant in polycarbonaatflessen voor ultracentrifugatie voor het verzamelen van de membranen. Aan het einde van de ultracentrifugatie gooi de supernatant en weeg de flessen met het membraan pellets voordat u de membranen in ongeveer 35 milliliter van membraan resuspensie buffer.

Voeg de suspensies toe aan een glazen Douncer, dan dounce homogeniseren de membranen een aliquot het homogenaat in een 50 milliliter conische buis voor negatieve 80 graden Celsius opslag. Weeg de lege centrifugeflessen af om de massa van de geoogste membranen te bepalen. Voor eiwitoplosting en zuivering, voeg een roerstaaf en 150 milligram DDM per gram membraan toe aan een beker op ijs en resuspend de ontdooide membranen tot een eindvolume van 15 milliliter membraan resuspensiebuffer, aangevuld met één millimolar PMSF en 20 millimolar imidazolen per gram membraan.

Voeg de membraanoplossing toe aan het bekerglas gedurende een uur roeren in een ijsbad. Gevolgd door centrifugatie om het niet-oplosbaar materiaal te pelleteren. In een koude ruimte van 4 graden Celsius, filtreer de supernatant door een vijf micrometer spuitfilter en gebruik een peristaltische pomp ingesteld op een stroomsnelheid van een milliliter per minuut om het monster te laden op een één milliliter geïmmobiliseerde nikkel affiniteit kolom Dan, was de kolom met 10 kolom volumes van wasbuffer en verdun het eiwit in elutie buffer.

Het verzamelen van het eluaat in tien een milliliter fracties. Voer de verzamelde bereide gelfracties uit op een vier tot 20%Tris-Glycine SDS-paginagel, samen met oplosbaar lysate en wasfracties op kamertemperatuur, waarbij de verzamelde piek fracties voor concentratie naar een 500 micro liter of minder volume trekt in een 50 kilo dalton cutoff concentrator in een benchtop centrifuge bij vier graden Celsius. Filtreer het geconcentreerde eiwit door een spinkolomfilter van 0,2 micrometer en injecteer het filtraat op een kolom met grootteuitsluiting die in een S-200-buffer is geëquilibreerd.

Na het uitvoeren van de piekfracties op een tweede vier tot 20%Tris-Glycine SDS paginagel, vlek de gel en verzamel de zuivere piekfracties voor concentratie in een 50 kilo Dalton cutoff concentrator bij vier graden Celsius zoals net aangetoond. Meet vervolgens de absorptie van het eiwitmonster op een golflengte van 280 nanometer om de concentratie te bepalen voordat het monster voor onbepaalde tijd wordt opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius. Om een glutaraldehyde cross-linking test uit te voeren, voeg eerst 0,5 milligram per milliliter ontdooid eiwit toe in drie microliter S-200-buffer aan vijf microliter s200-buffer.

Voltooi de negatieve controlereactie met de toevoeging van één microliter van 20%natrium dodecylsulfaat en één microliter van 1,5%glutaraldehyde. Voltooi de experimentele monsters met de toevoeging van een micro liter water en een micro liter 1,5% glutaraldehyde. Na 30 minuten op kamertemperatuur beëindigt u de reactie met vijf microliters van 3x SDS-paginagel die een overmaat aan Tris-buffer bevat om de glutaraldehyde te doven en alle 15 microliters van de oplossing op een vier tot 20% Tris-Glycine SDS-paginagel te laden.

Dan, voer de gel op 200 volt gedurende 30 minuten voor het bevlekken om de omvang van de dimer kruis-koppeling te bepalen, zoals blijkt uit een band die draait op twee keer de grootte van de gedenatureerde monomeer. Bevlek de gel door te schudden op een langzame orbitale shaker met gel vlek toegevoegd aan de gel. Hier tonen typische gels voor de ontweken fracties van nikkelaffiniteit chromatografie drie gedeeltelijk gezuiverde eiwitten met de lysaatfracties die geen significante band aantonen die overeenkomt met de boratetransporter zoals verwacht voor eiwitten die niet goed uitdrukken.

De ad millimolar wasstraat in elke gel toont minimaal verlies van de tien histidine gelabelde eiwit, ondanks hun relatief hoge vervuilers oude concentratie. Terwijl de banden die overeenkomen met de borate transporters zijn duidelijk zichtbaar in de ontweken fracties. Vóór S200-kolominjectie worden de eiwitten onvoldoende gezuiverd voor veel downstreamtoepassingen, zoals aangegeven door de extra banden in elk monster.

Na hun injectie in grootte-uitsluitingskolommen nochtans, kunnen ontgaan fracties van een hoge zuiverheid worden waargenomen. Crosslinking toont aan dat de gezuiverde homomerieke transporteurs hun assemblage in oplossing gemakkelijk kunnen laten beoordelen met de mate van kruisverkoppeling die afhankelijk is van het aantal lysineresiduen in de nabijheid van elkaar Het is belangrijk om te onthouden dat zodra de celoogst begint, het eiwit te allen tijde koud moet worden gehouden. Ofwel op ijs in een kamer van vier graden Celsius of in een delicatessenzaak.

Na deze procedure kunnen de membraaneiwitten verder worden gekenmerkt door biofysische, biochemische of structurele methoden, waaronder röntgenkristallografie of cryolekselektronenmicroscopie. Door de zuivering van milligramhoeveelheden homogeen eiwit mogelijk te maken, werden deze technieken gebruikt om de kristalstructuur van de Arabidopsis thaliana één transporter te bepalen.