Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten
27 april 2019
SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.
De betekenis van dit protocol is het gebruik van een nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG eiwit voor de detectie van het eiwit modifier SUMO in verschillende eukaryotische cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een eenvoudig protocol voor de antilichaamvrije detectie van SUMO in verschillende cellen, waaronder de weefselkweek van zoogdieren en nematodeklieren. SUMO speelt een belangrijke rol bij kanker en neurodegeneratieve aandoeningen, en dit onderstreept de noodzaak van robuuste en betrouwbare tools voor de detectie en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten.
Omdat SUMO zeer behouden is, kan het fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit worden gebruikt om geschimenteerde SUMO in veel verschillende organismen te labelen. Deze video toont het gebruik ervan in zoogdiercellen. Daarnaast beschrijft de volledige tekst het gebruik ervan in aaltjes.
De visuele demonstratie van deze techniek biedt kritische hints voor de behandeling van cellen voor vlekken en SUMO detectie. Om te beginnen groeien weefsel cultuur cellen van keuze op 22-millimeter ronde deksel glijdt in zes-goed TC platen tot 70 tot 80% confluent. Was de cellen kort met een milliliter DPBS.
Om de cellen te repareren, voeg twee milliliter verse 4%PFA en DPBS aan elke put. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen drie keer gedurende vijf minuten in een milliliter DPBS terwijl de plaat wordt gekalift.
Om de cellen te permeabiliseren, 15 minuten inbroed met 1%Triton X-100 in DPBS. Was de cellen opnieuw, zoals voorheen. Incubeer de cellen met 500 microliter van 1 molaire glycine HCL pH 2 gedurende 10 seconden.
Neutraliseer vervolgens de pH onmiddellijk met 500 microliters van 10X SUMO Protease buffer, of SPB. Na het wassen van de cellen zoals voorheen, verwijder de deksel glijdt uit de put en plaats ze in een vochtigheidskamer. Voor UTAG-FL kleuring alleen, meng een microgram UTAG-FL met 100 microliter van 1X SPB met vijf millimolar TCEP in een buis.
Vervolgens pipette de mix op de cellen op de cover slip en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende een uur in de vochtigheidskamer. Om de afdekslipjes te wassen, worden pipette 200 microliters van DPBS op elke afdeksel en laat 10 minuten op zijn plaats. Herhaal de was nog twee keer.
Verwijder de afdek uit de laatste wasbeurt en keer om op een voorgezuiverde microscopie schuif met een druppel montagemedium. Bewaar de monsters 's nachts in een 20 graden Celsius vriezer voor het bekijken onder de microscoop. Visualiseer de cellen met behulp van de juiste filtersets voor DAPI en Texas Red.
Zie de volledige tekst voor een protocol over het labelen van SUMO en vaste nematode-komaf. Terwijl het labelen van zoogdiercellen vrij eenvoudig is, vereist het labelen van aaltjes eicellen voorafgaande training in gonad dissecties. KmUTAG-FL geïncubeerd met vaste PMT2 cellen toonde een duidelijke nucleaire kleuring.
Zowel diffuse nucleaire kleuring en verschillende nucleaire foci waren zichtbaar. Nucleaire lokalisatie werd bevestigd met behulp van co-kleuring met DAPI. In overeenstemming met de SUMO-overvulactiviteit van KmUTAG-FL deed het nucleaire lokalisatiepatroon denken aan SUMO23-kleuring.
Co-kleuring met anti-SUMO23 8A2 antilichaam bevestigde de co-lokalisatie van KmUTAG-FL met het SUMO23 signaal. Dit valideert de werkzaamheid van KmUTAG-FL om SUMO23 in zoogdiercellen te detecteren. Geïsoleerde gonaden van eicelproducerende volwassen hermafrodiet c.
elegans nematoden werden gelabeld met anti-SUMO antilichaam. In overeenstemming met eerdere rapporten, anti-SUMO antilichaam in eerste instantie gelokaliseerd op de nucleaire plasm van late myotische profase eicellen. Het vervolgens herverdeeld naar de centrale ring complex van de gepaarde homologs als de nucleaire envelop brak en de chromosomen in de richting van de metafase plaat.
In parallelle voorbereidingen, gonads gelabeld met KmUTAG-FL bleek soortgelijke patronen. KmUTAG-FL verschoof van het labelen van het nucleoplasma naar het concentreren op het ringcomplex toen eicellen begonnen en voltooiden het proces van nucleaire enveloppe afbraak. Deze resultaten valideren KmUTAG-FL als een nuttig instrument voor de analyse van myose en SUMO-gerelateerde processen in c.
elegans en eventueel andere aaltjes. Tijdens het uitvoeren van fixatie is het van cruciaal belang om verse paraformaldehyde en een korte fixatietijd te gebruiken om SUMO native gevouwen te houden, zodat het kan worden herkend door de KmUTAG. Aangezien de tertiaire structuur van SUMO zeer behouden is gebleven, is het zeer waarschijnlijk dat SUMO-varianten van aanvullende model- en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met het KmUTAG-FL-reagens.
Momenteel gebruiken we deze nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit om de functie van SUMO te bestuderen tijdens cellulaire stress. Houd er ten slotte rekening mee dat alle stappen met behulp van het fixatieve paraformaldehyde in een laboratoriumveiligheidskap moeten worden uitgevoerd en dat dit reagens goed moet worden verwijderd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van een nieuw fluorescent SUMO-trapping protein (kmUTAG) voor de detectie van SUMO-conjugaten in diverse eukaryote cellen. De techniek maakt antilichaam-vrije visualisatie van SUMO mogelijk, wat essentieel is voor het begrijpen van de rol ervan bij kanker en neurodegeneratieve aandoeningen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitmodificatie
Achtergrond
- SUMO is een klein ubiquitine-achtig modifier-eiwit dat sterk geconserveerd is over verschillende soorten.
- Het speelt een belangrijke rol in diverse cellulaire processen, waaronder de stressrespons en eiwitlokalisatie.
- Betrouwbare detectiemethoden voor SUMO-gemodificeerde eiwitten zijn essentieel voor functionele analyse.
- Dit protocol maakt gebruik van een recombinant SUMO-trapping-eiwit om SUMO te visualiseren in verschillende celtypen.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige methode te bieden voor het detecteren van SUMO-conjugaten zonder het gebruik van antilichamen.
- Om de toepassing van kmUTAG in zoogdiercellen en oocyten van nematoden aan te tonen.
- Om het begrip van de rol van SUMO bij gezondheid en ziekte te vergroten.
Gebruikte methoden
- Fluorescerende labeling van SUMO met behulp van kmUTAG-proteïne.
- Visualisatie van SUMO-conjugaten in mammaliaanse weefselkweken.
- Toepassing van de techniek in gonaden van nematoden.
- Analyse van de SUMO-lokalisatie in diverse eukaryote cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van SUMO-conjugaten in verschillende celtypen.
- Demonstratie van de effectiviteit van kmUTAG voor antilichaam-vrije detectie.
- Inzichten in de lokalisatie en functie van SUMO-gemodificeerde eiwitten.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van de rol van SUMO bij kanker en neurodegeneratieve aandoeningen.
Conclusies
- Het kmUTAG-eiwit is een waardevol instrument voor de detectie van SUMO in diverse organismen.
- Deze methode vereenvoudigt de studie naar de biologische functies van SUMO.
- Verder onderzoek kan deze techniek benutten om SUMO-gerelateerde pathways bij gezondheid en ziekte te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Antilichaamsvrije detectie van SUMO-modificaties maakt robuuste target-validatie mogelijk in ziekterelevante systemen, in het bijzonder voor oncologie- en neurodegeneratieprogramma's waar SUMOylering de eiwitstabiliteit en -functie beïnvloedt. Het kmUTAG-reagens biedt een recombinant, cross-species instrument dat de assay-variabiliteit vermindert en mechanistische de-risking ondersteunt door endogene SUMO-conjugaten in levende of gefixeerde cellen direct te visualiseren. Deze aanpak verbetert het voorspellend vertrouwen in vroege discovery-fasen door antilichaamsafhankelijke artefacten te elimineren en gestandaardiseerde analyse van de SUMO-pathway over verschillende modelsystemen heen mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe bevraging van SUMO-afhankelijke eiwitregulatie mogelijk zonder interferentie door antilichamen, wat het testen van doelhypothesen in modellen voor kanker en neurodegeneratieve ziekten ondersteunt.
- Operationele waarde: Recombinante productie garandeert consistentie tussen batches en schaalbaarheid voor high-throughput screeningcampagnes die read-outs van SUMO-activiteit vereisen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen van de SUMO-conjugatiestatus, wat standaardisatie van assays mogelijk maakt voor door verbindingen geïnduceerde veranderingen in SUMOylatie.
- Operationele waarde: Compatibel met standaard microscopie- en fixatieworkflows, waardoor integratie in bestaande celgebaseerde assayplatformen mogelijk is zonder gespecialiseerde apparatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert cross-species SUMO-lokalisatiestudies van zoogdiercellen tot oocyten van nematoden, wat de translationele afstemming van biomarkers in geconserveerde stressresponspaden ondersteunt.
- Operationele waarde: Werkt in gefixeerde weefselpreparaten, waardoor retrospectieve analyse van SUMO-dynamiek in preklinische ziektemodellen mogelijk wordt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarbij modulatie van de SUMO-route een werkingsmechanisme is, en biedt orthogonale validatie voor biochemische of genetische SUMO-perturbatiestudies voorafgaand aan lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde screening door on-target SUMO-conjugatie te bevestigen als reactie op pathway-modulatoren of genetische knockdowns.
- Screening: Maakt reproduceerbare detectie van de vorming van SUMO-foci mogelijk als fenotypische readout in high-content screening-assays.
- Analytics: Levert kwantitatieve gegevens over subcellulaire lokalisatie (nucleair versus cytoplasmatisch, diffuus versus focaal) die gecorreleerd kunnen worden aan behandeling met verbindingen of de genetische achtergrond.
- Translationeel Onderzoek: Toont het behoud van SUMO-transportpatronen tussen soorten aan, wat extrapolatie van nematode-modellen naar zoogdier-systemen ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Recombinant kmUTAG-FL kan worden opgeslagen in een biobank en gedeeld worden tussen afdelingen als gestandaardiseerd reagens voor het monitoren van de SUMO-pathway.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert fout-positieven bij de detectie van SUMO door binding aan vrij SUMO te minimaliseren, waardoor het vertrouwen in conjugaat-specifieke signalen toeneemt.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor de aanschaf, validatie en titratie van antilichamen, waardoor de tijdlijnen en kosten voor assayontwikkeling worden verminderd.
- Strategische waarde: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van directe visualisatie van de interactie van het doelwit met de SUMO-machinerie, wat de mechanistische ambiguïteit in vroege projecten vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die SUMOylering moduleren door functioneel, op lokalisatie gebaseerd bewijs van pathway-activiteit te leveren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, fixatie en fluorescentiemicroscopie voor een correcte monsterpreparatie en visualisatie.
- Afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopie met geschikte filtersets voor DAPI- en Texas Red-kanalen.
- Het labelen van nematode-oocyten vereist voorafgaande training in gonad-dissectie, wat de onmiddellijke schaalbaarheid in niet-gespecialiseerde laboratoria beperkt.
- Fixatie met vers paraformaldehyde is essentieel voor het behoud van de tertiaire structuur van SUMO, wat gestandaardiseerde omgang met reagentia op alle locaties vereist.
- Hoewel effectief in zoogdiercellen en C. elegans, kan empirische validatie nodig zijn voor nieuwe modelsystemen om de compatibiliteit van kmUTAG-FL te bevestigen.
