Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

De betekenis van dit protocol is het gebruik van een nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG eiwit voor de detectie van het eiwit modifier SUMO in verschillende eukaryotische cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een eenvoudig protocol voor de antilichaamvrije detectie van SUMO in verschillende cellen, waaronder de weefselkweek van zoogdieren en nematodeklieren. SUMO speelt een belangrijke rol bij kanker en neurodegeneratieve aandoeningen, en dit onderstreept de noodzaak van robuuste en betrouwbare tools voor de detectie en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten.

Omdat SUMO zeer behouden is, kan het fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit worden gebruikt om geschimenteerde SUMO in veel verschillende organismen te labelen. Deze video toont het gebruik ervan in zoogdiercellen. Daarnaast beschrijft de volledige tekst het gebruik ervan in aaltjes.

De visuele demonstratie van deze techniek biedt kritische hints voor de behandeling van cellen voor vlekken en SUMO detectie. Om te beginnen groeien weefsel cultuur cellen van keuze op 22-millimeter ronde deksel glijdt in zes-goed TC platen tot 70 tot 80% confluent. Was de cellen kort met een milliliter DPBS.

Om de cellen te repareren, voeg twee milliliter verse 4%PFA en DPBS aan elke put. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen drie keer gedurende vijf minuten in een milliliter DPBS terwijl de plaat wordt gekalift.

Om de cellen te permeabiliseren, 15 minuten inbroed met 1%Triton X-100 in DPBS. Was de cellen opnieuw, zoals voorheen. Incubeer de cellen met 500 microliter van 1 molaire glycine HCL pH 2 gedurende 10 seconden.

Neutraliseer vervolgens de pH onmiddellijk met 500 microliters van 10X SUMO Protease buffer, of SPB. Na het wassen van de cellen zoals voorheen, verwijder de deksel glijdt uit de put en plaats ze in een vochtigheidskamer. Voor UTAG-FL kleuring alleen, meng een microgram UTAG-FL met 100 microliter van 1X SPB met vijf millimolar TCEP in een buis.

Vervolgens pipette de mix op de cellen op de cover slip en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende een uur in de vochtigheidskamer. Om de afdekslipjes te wassen, worden pipette 200 microliters van DPBS op elke afdeksel en laat 10 minuten op zijn plaats. Herhaal de was nog twee keer.

Verwijder de afdek uit de laatste wasbeurt en keer om op een voorgezuiverde microscopie schuif met een druppel montagemedium. Bewaar de monsters 's nachts in een 20 graden Celsius vriezer voor het bekijken onder de microscoop. Visualiseer de cellen met behulp van de juiste filtersets voor DAPI en Texas Red.

Zie de volledige tekst voor een protocol over het labelen van SUMO en vaste nematode-komaf. Terwijl het labelen van zoogdiercellen vrij eenvoudig is, vereist het labelen van aaltjes eicellen voorafgaande training in gonad dissecties. KmUTAG-FL geïncubeerd met vaste PMT2 cellen toonde een duidelijke nucleaire kleuring.

Zowel diffuse nucleaire kleuring en verschillende nucleaire foci waren zichtbaar. Nucleaire lokalisatie werd bevestigd met behulp van co-kleuring met DAPI. In overeenstemming met de SUMO-overvulactiviteit van KmUTAG-FL deed het nucleaire lokalisatiepatroon denken aan SUMO23-kleuring.

Co-kleuring met anti-SUMO23 8A2 antilichaam bevestigde de co-lokalisatie van KmUTAG-FL met het SUMO23 signaal. Dit valideert de werkzaamheid van KmUTAG-FL om SUMO23 in zoogdiercellen te detecteren. Geïsoleerde gonaden van eicelproducerende volwassen hermafrodiet c.

elegans nematoden werden gelabeld met anti-SUMO antilichaam. In overeenstemming met eerdere rapporten, anti-SUMO antilichaam in eerste instantie gelokaliseerd op de nucleaire plasm van late myotische profase eicellen. Het vervolgens herverdeeld naar de centrale ring complex van de gepaarde homologs als de nucleaire envelop brak en de chromosomen in de richting van de metafase plaat.

In parallelle voorbereidingen, gonads gelabeld met KmUTAG-FL bleek soortgelijke patronen. KmUTAG-FL verschoof van het labelen van het nucleoplasma naar het concentreren op het ringcomplex toen eicellen begonnen en voltooiden het proces van nucleaire enveloppe afbraak. Deze resultaten valideren KmUTAG-FL als een nuttig instrument voor de analyse van myose en SUMO-gerelateerde processen in c.

elegans en eventueel andere aaltjes. Tijdens het uitvoeren van fixatie is het van cruciaal belang om verse paraformaldehyde en een korte fixatietijd te gebruiken om SUMO native gevouwen te houden, zodat het kan worden herkend door de KmUTAG. Aangezien de tertiaire structuur van SUMO zeer behouden is gebleven, is het zeer waarschijnlijk dat SUMO-varianten van aanvullende model- en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met het KmUTAG-FL-reagens.

Momenteel gebruiken we deze nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit om de functie van SUMO te bestuderen tijdens cellulaire stress. Houd er ten slotte rekening mee dat alle stappen met behulp van het fixatieve paraformaldehyde in een laboratoriumveiligheidskap moeten worden uitgevoerd en dat dit reagens goed moet worden verwijderd.