De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

Mobiele elementen zijn een van de belangrijkste bronnen van menselijke genetische instabiliteit. Inzicht in hun expressie in verschillende weefsels en omstandigheden is van cruciaal belang om hun impact op het genoom te begrijpen. De enorme L1 transcripties zijn het resultaat van passieve opname van L1-gerelateerde sequenties in andere transcripties die geen rol spelen in de L1 levenscyclus.

Onze aanpak elimineert deze irrelevante achtergrond. Dit protocol kan worden aangepast aan studies van elk mobiel element, of zelfs virussen in een sequentiegenoom. Er moet op zijn minst enige volgorde variatie om discriminatie tussen loci mogelijk te maken.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang bij het illustreren van de strengheid en zorg die nodig zijn om vol vertrouwen uitgedrukte L1 repetitieve elementen op het locus-specifieke niveau te identificeren. Begin deze procedure met cytoplasmische RNA-extractie en de volgende generatie sequencing zoals beschreven in het tekstprotocol. Door te selecteren voor cytoplasmatisch RNA, L1-gerelateerde reads gevonden binnen uitgedrukt intronic mRNA in de kern zijn aanzienlijk uitgeput.

In de sequencing bibliotheek voorbereiding een andere stap genomen om transcriptie ruis los van L1s te verminderen omvat de selectie van polyadenylated transcripties. Hiermee verwijdert U L1-gerelateerde transcriptieruis die bij niet-mRNA-soorten wordt aangetroffen. Voer uitlijnparadigma sequencing FASTQ-bestanden met de RNA seq monster van belang met behulp van bowtie1 door het typen van de opdracht lijn in de Linux-terminal.

Deze uitlijning strategie vereist de transcripties uniek en collinearly uitgelijnd met een uitputtende genomische zoekopdracht. Deze strategie geeft vertrouwen in het oproepen van reads mapping specifiek naar een enkele L1 locus. Streng scheidt de output BAM bestanden Met behulp van SAMtools en Linux commando's te selecteren voor de bovenste streng en de onderste streng.

Houd er rekening mee dat de werkelijke vlagwaarden kunnen variëren als men geen standaardvolgordevolgingsprotocollen van de volgende generatie gebruikt. Deze onderdeelscheidingsstap werkt om de transcriptieruis die wordt gegenereerd in L1-sequenties die geen verband houden met L1-retrotranspositie, uit te filteren door potentiële antisense L1-gerelateerde in kaart gebrachte reads te elimineren. Het genereren van leesstellingen tegen annotaties voor L1 loci met behulp van bedgereedschappen.

Typ eerst de opdrachtregel om leestellingen voor L1's te genereren in de richting van de betekenis op de bovenste streng en typ vervolgens de opdrachtregel om leestelling voor L1's te genereren in de zinsrichting op de onderste streng. De annotaties die worden gebruikt om L1's te identificeren, geven L1's over de volledige lengte aan met functionele promotorregio's die werken aan het elimineren van achtergrondgeluiden die anders afkomstig zijn van afgeknotte L1's. Maak een spreadsheet voor reads die zijn toegewezen aan elke geannoteerde L1-locus.

Kopieer over de gegenereerde gelezen tellingen tekstbestand dat is gemaakt voor de onderste streng en label de pagina als minus_bottom. Sorteer alle kolommen op basis van het hoogste tot laagste aantal reads in kolom J.Copy over het gegenereerde tekstbestand voor gelezen tellingen dat is gemaakt voor de bovenste streng. Sorteer alle kolommen op basis van het hoogste tot laagste aantal reads in kolom J.En label de pagina als top_plus.

Maak een derde pagina met het label als gecombineerd en voeg alle loci toe met 10 of meer reads van minus_bottom en plus_top pagina's. Sorteer alle kolommen op basis van het hoogste tot laagste aantal reads in kolom J.To helpen bij de mappability van genomische regio's, met name in of nabij L1 loci, werden hele genoom gekoppelde en sequencing bestanden van de soorten van belang gedownload van NCBI en omgezet naar FASTQ-bestanden zoals beschreven in het tekstprotocol. Indexeer nu de BAM-bestanden om ze zichtbaar te maken in de Integrative Genomics Viewer, afgekort IGV, voordat u de bestanden laadt.

In IGV belasting het referentiegenoom van belang om geannoteerde genen te visualiseren. Laad ook het annotatiebestand voor volledige lengte L1-elementen om de L1-annotatie, het BAM-bestand voor menselijke RNA-expressie, te visualiseren om in kaart gebrachte transcripties van het monster van belang en het BAM-bestand voor de mappability van het menselijk genoom te visualiseren om de mappability van genomische regio's te beoordelen. Verwijder dekkings- en verbindingsrijen die aan elk BAM-bestand zijn gekoppeld.

Compreer de BAM-bestanden voor menselijke RNA-expressie en voor de mappability van het menselijk genoom, zodat alle IGV-tracks op één scherm passen. De laatste kritieke stap in het elimineren van transcriptieruis van L1-sequenties die niets te maken hebben met L1-retrotranspositie is de handmatige creatie van L1's die zijn geïdentificeerd om RNA-transcripties in kaart te hebben gebracht. De handmatige curatie omvat de visualisatie van elke uitgedrukte L1 locus in de context van de omringende genomische omgeving om te bevestigen dat expressie afkomstig is van de L1-promotor.

Met behulp van coördinaten van L1 loci vermeld op de spreadsheet gecombineerde pagina, handmatig curate elke L1 locus met uniek in kaart gebrachte transcripties door het onderzoeken van hun omliggende genomische omgeving in IGV. Curate een locus om authentiek te worden uitgedrukt uit zijn eigen als er geen leest stroomopwaarts in de L1 richting tot vijf kilobases. Label de rij groen van kleur en let op waarom het een authentiek uitgedrukte L1 is. Er bestaat een uitzondering op deze regel als de regio stroomopwaarts van de L1 niet mappable is.

Als dit het geval is, labelt u de rij rood van kleur en moet u er rekening mee houden dat de expressie van het gebied stroomopwaarts van de L1-promotor niet kan worden geëvalueerd en dat de expressie van de L1 daarom niet met vertrouwen kan worden bepaald. Curate een locus niet authentiek worden uitgedrukt uit zijn eigen promotor als er leest stroomopwaarts tot vijf kilobases. Label de rij rood in kleur en let op waarom het geen authentiek uitgedrukte L1 is. Curate een locus als vals als het wordt uitgedrukt in een intron van een uitgedrukt gen in dezelfde richting, met leest stroomopwaarts van de L1, als het stroomafwaarts van een uitgedrukt gen in dezelfde richting met leest stroomopwaarts van de L1, of voor niet-geannoteerde expressie patronen met leest stroomopwaarts van de L1. Een uitzondering op deze regel is van toepassing wanneer er minimale reads zijn die direct overlappende de L1 promotor start site, maar iets stroomopwaarts van de L1. Als er geen andere leest stroomopwaarts van een L1 geval als deze, overweeg dan deze L1 authentiek worden uitgedrukt.

Label de rij groen en let op waarom het een authentiek uitgedrukte L1 is. Curate een L1 locus als waarschijnlijk vals zijn als het patroon van in kaart gebracht leest aan de locus niet correleren met de specifieke L1's regio's van mappability. Als een L1 is zeer mappable, maar heeft alleen een stapel van leest in een gecondenseerd gebied binnen de L1, is het minder waarschijnlijk te worden gerelateerd aan L1 expressie uit zijn eigen promotor en meer kans om uit niet-geannoteerde bronnen zoals exonen of LRs. In gevallen als deze, curate de loci als oranje en let op waarom de locus is verdacht.

Controleer bronnen van verdachte pile-ups door de L1-locatie in de UCSC Genome Browser te controleren. Curate een locus niet authentiek worden uitgedrukt als het binnen een genomische omgeving van sporadisch uitgedrukt onaangeïnsteide regio's. Reads kan worden uitgedrukt 10 kilobases stroomopwaarts van de L1. Maar elke 10 kilobases of zo, zijn er in kaart gebracht leest en sommige van die leest uitlijnen met de L1. Deze L1's zijn waarschijnlijk in kaart gebracht leest als gevolg van niet-aangemelde patronen van genomische expressie.

In gevallen als deze, curate de loci als rood en merk op waarom de locus is verdacht. Om de mappability van elke L1 loci te helpen bepalen het aantal uniek in kaart gebrachte leest aan L1 loci met behulp van de bedtools programma, de FL-L1 annotatie en de uitgelijnde genomische sequentie gegevens. Wijs een L1-locus aan om volledige dekkingsmogelijkheden te hebben wanneer er 400 unieke reads op zijn uitgelijnd.

Bepaal de factor die nodig is om op te schalen of omlaag genomic DNA uitgelijnd leest tot 400 voor elke individuele L1. Als u een geschaalde mate van expressie wilt hebben op basis van individuele L1-locusmappability, vermenigvuldigt u de factor met het aantal RNA-transcriptielezen dat overeenkomt met individuele, authentiek uitgedrukte L1's. Elke stap wordt gebruikt om verschillen tussen L1-elementen te benadrukken die zijn uitgedrukt uit hun eigen promotor, en alle manieren waarop L1-elementen kunnen worden opgenomen in andere transcripties die geen verband houden met de L1-levenscyclus. Hier getoond zijn transcript leest die kaart uniek aan alle volledige lengte intacte L1's in het menselijk genoom uitgedrukt in de DU145 prostaat tumorcellijn.

In het zwart zijn de specifieke loci geïdentificeerd als authentiek uitgedrukt na handmatige curatie. En in het rood zijn de specifieke loci afgewezen als authentiek uitgedrukt leest na handmatige curatie. In grijs zijn loci met minder dan 10 leest toewijzing aan elk.

Aangezien deze loci vertegenwoordigen een kleine fractie van de transcriptie leest, werden ze niet handmatig samengesteld. Ongeveer 4500 loci worden niet grafisch getoond, aangezien zij nul in kaart gebrachte leest hadden. Na handmatige curatie, het aantal leest dat kaart uniek tot authentiek uitgedrukt specifieke L1 loci in DU145 variëren van 175 leest tot een willekeurig gekozen minimum afgesneden van 10 leest.

Zodra de reads werden aangepast voor mappability scores in elke locus, de kwantificering voor expressie voor de meeste loci toegenomen. Het aantal reads dat uniek in kaart gebracht om authentiek uitgedrukt specifieke L1 loci met mappability correcties in DU145 varieerde van 612 tot vier leest en er was een herschikking van de hoogste tot laagste uitdrukken loci. Elke stap speelt een cruciale rol bij het verminderen van het hoge niveau van transcriptie achtergrondgeluid.

Echter, de meest kritische stap is de handmatige curatie van elke L1 locus om transcriptie van zijn eigen promotor te bevestigen. Ongeveer 50% van L1 loci geïdentificeerd bioinformatisch in DU145 cellen werden afgewezen als L1 achtergrondgeluid afkomstig van andere transcriptie bronnen, met nadruk op de strengheid die nodig is om betrouwbare resultaten te produceren. Om de jongste L1's te identificeren, raden we aan om vijf-prime RACE-selectie van L1-transcripties en sequencing-technologie zoals PacBio te gebruiken die gebruik maken van langere reads en meer unieke mapping mogelijk maakt.

Met deze aanpak kunnen we L1-expressiepatronen streng en vol vertrouwen identificeren en kwantificeren. Dit effent de weg naar een beter begrip van de regulering van individuele L1 loci en de mogelijke impact.