Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

Met behulp van dit systeem kunnen we de sub-millimeter clusters van menselijk vetweefsel verzamelen, waarin de hele micro-omgeving van regeneratieve cellen intact is. Het hele microvasculaire systeem is ook intact, en dus kunnen we dit soort microorganen gebruiken voor in-vivo transplantatie voor in-vitro cultuur en voor celisolatie voor verdere karakterisering. De belangrijkste reden voor het gebruik van het systeem in het onderzoekslaboratorium is dat het proces volledig enzymvrij is, en dus maakt het de snelle en efficiënte verwerking van menselijk vetweefsel mogelijk met behoud van een micro-architectuur en het zal de microvasculatuur van het weefsel volledig intact zijn.

En zo kunnen we direct een celtherapieproduct bestuderen dat al zeer nuttig is gebleken in de kliniek. Deze gesloten systeemtechnologie is een gebruiksvriendelijke techniek voor het oogsten, verwerken en herinjecteren geraffineerd vetweefsel intraoperatief, en kan met succes worden toegepast in cosmetica orthopedie, proctologie en ook gynaecologie. Deze methode maakt verdere studie van de impact van vet in weefselregeneratie mogelijk.

De procedure zal worden aangetoond door Bianca Vezzani, een postdoctoraal fellow en door Mario Gomez-Salazar, die een promovendus. Werken onder aseptische omstandigheden binnen 16 uur na het oogsten, plaats de abdominoplastie monster op de top van een chirurgische doek met de huid naar boven gericht. Gebruik een wegwerpweefsel infiltratie canule te injecteren 50 tot 100 milliliter van 37 graden Celsius 0,9% natriumchloride oplossing in het onderhuidse vetweefsel.

Sluit een 10 milliliter Luer lock spuit aan op een wegwerp liposuctie canule en het grijpen van het monster op het cutane gebied in de buurt van een rand van het monster, voorzichtig introduceren van de canule in het vetweefsel. Zodra de canule is in het weefsel, extract van de zuiger en beweeg de canule radiaal binnen het vetweefsel monster. Het is belangrijk om het vetweefsel stevig te behandelen tijdens de lipo-aspiratie.

Als er niet genoeg vet wordt verzameld, overweeg dan het uitvoeren van een extra zoutinjectie. Wanneer de spuit vol lipo-aspiraat is, verwijder dan voorzichtig de canule uit het weefsel en vervang de volledige spuit door een nieuwe lege spuit totdat in totaal 60 milliliter aanzuigen is geoogst. Voor microfragmentatie van de lipo-aanzuigen, verwijder het apparaat uit de verpakking en controleer of de hoofdeenheid is aangesloten op de afvalzak.

Leg de afvalinzamelzak op de grond en zorg ervoor dat de kleppen aan de doppen van de proceseenheid worden bevestigd. Doorboor de zakverbindingspoort om de terminalpiek van de invoerlijn in de zoutzak aan te sluiten en de zoutzak hoger te positioneren dan de verwerkingseenheid. Controleer of alle vijf de klemmen die op de buizen van de circuits zijn aangesloten, open zijn, plaats de verwerkingseenheid in een verticale positie, laat de zoutoplossing de verwerkingseenheid vullen en bevestig dat de stroom de afvalzak bereikt.

Schud de verwerkingseenheid om luchtbellen te verwijderen en plaats het apparaat in een verticale positie met de blauwe dop naar boven gericht. Sluit de klem naast de ingangslijn en sluit een spuit lipo-aspiraat aan op de zelf-occluding klep van de blauwe ingangsdop om te beginnen met het injecteren van de lipo-aspirate. Houd de verwerkingseenheid verticaal, duw langzaam naar beneden op de spuit zuiger totdat alle lipo-aspiraat is overgebracht naar het apparaat.

Wanneer alle lipo-aspiraat is geïnjecteerd, open de input klem om de zoutstroom te herstellen en krachtig schudden van de verwerkingseenheid gedurende ten minste twee minuten, regelmatig controleren van de zoutoplossing stroom in de afvalzak. Wanneer de zoutoplossing in de verwerkingseenheid transparant wordt, plaatst u het apparaat met de grijze dop naar boven en sluit u de klemmen op de afvoer in de buurt van zowel de blauwe als de grijze doppen. Het verwerkte weefsel zweeft aan de bovenkant.

Vul vervolgens een Luer-sluimer van 10 milliliter Luer met zoute oplossing en sluit de spuit aan op de laadklep van de blauwe dop. Sluit een lege Luer-sluisspuit van 10 milliliter aan met de zuiger die volledig op de klep van de grijze dop wordt geplaatst. De zoutoplossing stevig in de verwerkingseenheid injecteren vanuit de blauwe dop, waarbij wordt gecontroleerd of de met de grijze klep verbonden spuit bijgevolg wordt gevuld met het verwerkte weefsel.

Wanneer alle zoute is geïnjecteerd, verwijder voorzichtig beide spuiten en herhaal de zoutoplossing tot alle verwerkte weefsels zijn verzameld. Verwijder aan het einde van de verwerking alle spuiten, sluit alle klemmen, maak de zoutzak los en gooi het apparaat volgens lokale protocollen weg. Wanneer al het verwerkte weefsel is verzameld, breng het micro-gefragmenteerde vetweefsel in een steriele container en voeg een gelijk volume van de spijsvertering medium aan de container.

Plaats de verzegelde container in een 37 graden Celsius schudden water bad, ingesteld op 120 rotaties per minuut gedurende 45 minuten, het stoppen van de spijsvertering met een gelijk volume van het blokkeren van oplossing aan het einde van de incubatie. Consequent filteren het monster, eerst door middel van een 100 micrometer cel zeef gevolgd door filtratie door middel van een 70 micrometer cel zeef en centrifugeren de gefilterde suspensie gedurende vijf minuten op 200 keer g. We schorten de pellet in ongeveer 5 milliliter erythrocyte lyse buffer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.

Stop de lysis met een gelijk volume van de blokkeringsoplossing en filter de oplossing door een 40 micrometer celzeef. Verzamel vervolgens de micro-gefragmenteerde vetweefselcellen door centrifugatie en we schorten de pellet op in verse blokkeeroplossing met floure-mengen voor het tellen. Na dissociatie en antilichaamkleuring kunnen microfragmenteerde vetcellen naar de stroomcytometer worden gebracht voor celanalyse en/of sortering.

Mechanische dissociatie van handmatige lipo-aspiraten resulteert in de productie van micro-gefragmenteerd vetweefsel dat bestaat uit een aggregaat van adipocyten die een microvasculair netwerk omhullen. Immunofluorescentieanalyse van gelatine ingebed in cryofixed micro-gefragmenteerd vetweefsel benadrukt de structuur, met het vasculaire netwerk dat wordt gekenmerkt door de endotheelcelmarker Ulex Europaeus Agglutinine 1-receptor en voornamelijk bestaat uit kleine capillaire vaten. Met name pericyten die neuron-gliaantant 2 of bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor bèta uitdrukken, worden normaal gesproken verdeeld, ensheathing endotheelcellen.

Door cd31-positieve endotheel- en CD45-positieve hematopoietische cellen uit te sluiten, kan de aanwezigheid van CD146-positieve CD34-negatieve pericyten en CD146-negatieve en CD34-positieve adventitiale cellen worden geïdentificeerd binnen de MAT. Handmatige lipo-aspiratie is een cruciaal onderdeel van de procedure en moet niet meer dan 16 uur na de abdominoplastie onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Micro-gefragmenteerd vetweefsel kan verder worden verwerkt door immunohistochemische kleuring, in vitro cultuur of secretoom analyse om een dieper inzicht in vetweefsel biologie te verkrijgen.

Deze techniek maakt het mogelijk om diverse weefsels in hun natuurlijke, inheemse, driedimensionale opstelling te bestuderen als een soort kleine organoïden, die klein genoeg zijn om te worden getransplanteerd in muizen of te worden gehandhaafd in de langetermijncultuur. We gebruiken dit systeem voornamelijk om de verschillende orgaanspecifieke micro-omgevingen experimenteel te benaderen. Onze vetweefseldonoren staan niet bekend als dragers van overdraagbare infecties.

Bij gebrek aan verdere screening moeten alle menselijke weefsels echter als mogelijk verontreinigd worden beschouwd en dienovereenkomstig worden behandeld.